Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Published: October 13, 2012 doi: 10.3791/4193

Summary

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

Abstract

Die Entdeckung von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (kollektiv als neuralen Vorläuferzellen) (NPC) im erwachsenen Gehirn von Säugetieren ist an einem Körper der Forschung auf die Nutzung der multipotenten und proliferativen Eigenschaften dieser Zellen für die Entwicklung von Strategien neuroregenerative gerichtet geführt. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Mobilisierung von NSC Richtung einer Läsionsstelle nach Transplantation oder exogene, um die Reaktion der endogenen Vorstufen, die in der periventrikulären Region des ZNS gefunden werden verbessern. Dementsprechend ist es wichtig, die Mechanismen, die zu fördern leiten, und verbessern NPC Migration verstehen. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Nutzung von Gleichstrom elektrische Felder (dcEFs) zu fördern und zu direkten NPC Migration - ein Phänomen, das als Galvanotaxis bekannt. Endogenen physiologischen elektrischen Feldern funktionieren als kritische Hinweise für die Zellwanderung während der normalen Entwicklung und Wundheilung. Pharmakologische Unterbrechung dertrans-Neuralrohr Potenzial Axolotl Embryonen verursacht schweren Entwicklungsstörungen Fehlbildungen 1. Im Rahmen der Wundheilung, wird die Rate der Reparatur der verwundeten Hornhaut direkt mit der Größe der Wunde epithelialen Potential, das nach der Verletzung auftritt korreliert, als durch pharmakologische Verstärkung oder Störung dieses dcEF 2-3 gezeigt. Wir haben gezeigt, dass adulte subependymale NPCs rasche und gerichteten Migration kathodenseitigen in vitro durchlaufen, wenn sie einem von außen angelegten dcEF ausgesetzt. In diesem Protokoll beschreiben wir unser Labor die Techniken für die Schaffung eines einfachen und effektiven Galvanotaxis Assay für hochauflösende, langfristige Beobachtung der Regie Zellkörper Translokation (Migration) auf einer Ebene einzelner Zellen. Dieser Assay wäre geeignet für die Untersuchung der Mechanismen, dcEF Transduktion in zelluläre Motilität regulieren durch die Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäuse, short interfering RNA oder spezifischen Rezeptor Agonisten / Antagonisten.

Protocol

Alle Verfahren, die Behandlung der Tiere wurden von der University of Toronto Animal Care Committee in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts (Protokoll Nr. 20.009.387) zugelassen. Die folgenden Methoden sollten unter Verwendung steriler Instrumente und Techniken in einer Sterilbank, soweit zutreffend.

Im Protokoll-Text bezieht sich der Ausdruck "EFH-SFM" zu serumfreiem Medium mit epidermalen Wachstumsfaktor, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Heparin ergänzt. EFH-SFM wird verwendet, wenn die Untersuchung der Galvanotaxis undifferenzierter NPCs, weil diese Mitogene NPCs in ihrem undifferenzierten Zustand 4 zu halten. Bei der Untersuchung der Galvanotaxis NPC-induzierte zu reifen Zelltypen differenzieren, "FBS-SFM" bezieht sich auf serumfreiem Medium mit 1% fötalem Rinderserum ergänzt. FBS fördert die Differenzierung von NSCs in reife neuronale Phänotypen 5.

Ein. Isolation und Kultur von neuralen Vorläuferzellen (Nichtdargestellt im Video)

  1. Betäuben ein CD1-Maus (6-8 Wochen alt) mit Isofluran und Opfer über Genickbruch.
  2. Begießen den Kopf in 70% Ethanol und enthaupten das Tier mit scharfen Dissektion Schere.
  3. Halten Sie den Kopf mit chirurgischen Pinzette die Haut auf der dorsalen Oberfläche, um den Schädel freizulegen.
  4. Mit einem Skalpell und nein. 11 Blättern, erzielt das Schädels an der Stirnhöhle entlang der mediolateralen Achse und auch entlang der Sagittalnaht im rostrokaudalen Richtung.
  5. Schälen Sie die Scheitelbeinen vom Kopf ohne. 7 gebogene Pinzette, dabei nicht zu durchbohren das Hirngewebe.
  6. Führen Sie einen dünnen Spatel unterhalb des Gehirns ab unter dem Kleinhirn und Weiterentwicklung in Richtung der Riechkolben. Halten Sie den Schädel an Ort und Stelle mit einer Pinzette, ziehen das Gehirn aus dem Schädel und sofort legen Sie sie in eiskaltem künstlichen Liquor (siehe Rezepte unten).
  7. Unter einem Dissektionsmikroskop, mit sterilenDissektion Schere und Pinzette geschnitten das Gehirn in der Hälfte entlang der Mittellinie. Drehen Sie jeden Hemisphäre, so dass die mediale (cut) Oberfläche nach oben zeigt.
  8. Wählen Sie eine Halbkugel, und mit der medialen Oberfläche nach oben, suchen Sie die Splenium des Corpus callosum (hinteren Bereich des Corpus callosum).
  9. Einen Einschnitt von der Oberfläche der Hirnrinde der Splenium des Balkens entlang der dorsoventralen Achse.
  10. Peel die eingeschnittene Kortex zu der Riechkolben, die medialen und lateralen Wände des lateralen Ventrikel freizulegen.
  11. Rotieren die Halbkugel so dass der dorsale Oberfläche nach oben zeigt, und mit gekrümmten Mikroschere zum Ausschneiden und sammeln die freiliegenden medialen und lateralen Wänden, die den Bereich, in dem periventrikulären NPCs aufzuhalten 6 enthalten.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,11 für die andere Hemisphäre.
  13. Pipettieren der isolierten Gewebe in 7 ml Trypsin-Lösung (siehe Rezept unten) in einem 15 ccm Rohr, und legen Sie das Rohr auf einer Wippe in einem 37 ° CInkubator für 25 min.
  14. Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min, den Überstand aspirieren und resuspendieren das Gewebe in 2 ml Trypsin-Inhibitor-Lösung (siehe Rezept unten).
  15. Gently verreiben das Gewebe mit einer kleinen Bohrung Pasteurpipette 30-50 mal vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden.
  16. Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 5 min, den Überstand aspirieren und resuspendieren in 1-2 ml SFM (Rezept siehe unten) durch Verreiben das Pellet 3-5 mal.
  17. Zentrifugieren bei 1.500 rpm für 3 min, saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 1 ml SFM + EFH.
  18. Zählen leben Zelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in einer T25-Kulturkolben in einer Dichte von 10 Zellen pro ul in SFM + EFH.
  19. Lassen Sie die Kultur für 7 Tage ungestört frei schwebenden primäre Neurosphären von NPCs zusammen ergeben wachsen.

2. Galvanotaxis Chamber Vorbereitung

  1. Platz 3 quadratischen Glas-Nr. 1 Deckgläschen (22 x 22 x 0,17 mm) ina Flasche 6N Salzsäure über Nacht.
  2. Am nächsten Tag, mit einem Diamant-Spitze Glasschneider bis 6 rechteckigen Streifen (22 x 5 x 0,17 mm) aus Glas vom Quadrat nicht geschnitten. 1 Deckgläser.
  3. Übertragen Sie die acid-washed Platz rutscht und rechteckige rutscht in eine laminare Strömung Kapuze. Waschen Sie die rechteckige und quadratische Streifen zunächst mit 70% Ethanol, dann mit Gewebekultur-grade autoklavierten Wasser, und lassen Sie sie auf einem Kim trocknen Wischen (für zusätzliche Sterilität, kann das Glas an der Luft trocknen erlaubt sein).
  4. Anwenden Vakuumfett an dem Umfang der einen Fläche der quadratischen Glasobjektträgern und verschließt diese an der Basis von 60 mm Petrischalen aus Kunststoff.
  5. Anwenden Vakuumfett entlang der langen Achse der einen Oberfläche der rechteckigen Glasstreifen, und schließt diesen an gegenüberliegenden Kanten der quadratischen Glasobjektträgern (derart, dass sie parallel zueinander sind), um eine zentrale Mulde zu schaffen.
  6. UV-Sterilisation der Kammern für mindestens 15 min in der Sterilbank.
  7. Pipette 250-300 ul von Poly-L-Lysine auf den zentralen Mulde der Kammern hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
  8. Etwa 15 Minuten vor dem Ende der Inkubationszeit, bereiten die Matrigel-Lösung (siehe Rezept unten).
  9. Saugen Sie die Poly-L-Lysin, waschen Sie die zentralen Tröge mit 1 ml autoklavierten Wasser, und Pipette 250-300 &mgr; l Matrigel Lösung auf den zentralen Tälern.
  10. Inkubiere die Kammern bei 37 ° C für 1 Stunde.
  11. Saugen Sie die Matrigel-Lösung und vorsichtig waschen die zentralen Tröge mit 1-2 ml SFM.
  12. Je 100 ul der EFH-SFM oder FBS-SFM auf den zentralen Tälern und übertragen Sie die Galvanotaxis Kammern auf der Bühne eines Zählen Mikroskop.
  13. Pipette 3-4 ml des Neurosphäre enthaltenden Kultur in eine 60 mm Petrischale und übertragen die Petrischale auf der Bühne des Mikroskops gezählt.
  14. Bei einer Betrachtung Ziel 5x, verwenden Sie eine P10 Pipette 5-8 gesamten Neurosphären (bis zu vier gleichzeitig) auf den zentralen Mulde jedes Galvanotaxis übertragenKammer ohne distanziert sie, und sorgfältig verteilt die Neurosphären rund um den zentralen Mulde ohne Unterbrechung des Matrigel Substrat.
  15. Fügen Sie eine weitere 150-200 ul EFH-SFM oder FBS-SFM auf den zentralen Tälern.
  16. Übertragen der Galvanotaxis Kammern in einem 37 ° C, 5% CO 2, 100% befeuchteten Inkubator für 17 bis 20 h (wenn Analysieren undifferenzierten NPC), damit die Neurospheres, um zu der Matrigel Substrat haften und dissoziieren in einzelne Zellen, wie in Abbildung 1 dargestellt . Wenn Analysieren differenzierten NSCs sollte die Inkubationszeit bis 69-72 h verlängert, um die Differenzierung der Zellen zu ermöglichen.

3. Live Cell Time-Lapse Imaging

  1. Lassen Sie das Live Cell Imaging System bei 37 ° C äquilibrieren, 5% CO 2 für mindestens 30 min vor Beginn der Zeitraffer-Aufnahme.
  2. Schneiden Sie zwei 12 cm lange Stücke von 1 mm Durchmesser Silber Draht, Spule sie von einem Ende, und legen Sie sie in Clorox bLeach für 20 min zu bilden Ag / AgCl Elektroden.
  3. Übertragen Sie die Galvanotaxis Kammern auf der Bühne eines Zählen Mikroskop und auswählen, welche Kammer wird für Live-Cell-Imaging Migration Analyse auf Grundlage der folgenden Kriterien verwendet werden: i) die Neurosphären sollte fast vollständig dissoziiert in einzelne Zellen und ii) die Zellen besitzen sollte Runde Morphologien mit wenig bis keine Prozesse sich von den Zellkörper.
  4. Übertragen des ausgewählten Galvanotaxis Kammer in einer Sterilbank, zusammen mit einem getrennten quadratischen Nr. 1 Deckglas und Vakuum Fett.
  5. Waschen der Deckel erste rutschen mit 70% igem Ethanol, dann mit autoklaviertem Wasser und Anwendung eines Streifens aus Vakuumfett an zwei parallelen Kanten des Deckglases.
  6. Absaugen Kulturmedien von der zentralen Rinne der Kammer, dann schnell platzieren das Deckglas (Fett-Seite nach unten) auf die Kammer derart, dass das Fett Streifen auf den beiden parallelen rechteckigen Glasstreifen, effektiv eine Dachan die Kammer.
  7. Je 100 ml frisches EFH-SFM oder FBS-SFM in den zentralen Mulde durch Kapillarwirkung.
  8. Verwenden Vakuumfett um Grenzen für Pools von Kulturmedien auf jedem Ende der zentralen Rinne zu schaffen, wie in 2 gezeigt.
  9. Schneiden Sie zwei 15 cm Stücke von PVC-Schlauch, und verwenden Sie einen 10-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel sorgfältig injizieren Agarose-Lösung in den Schlauch, wodurch keine Blasen bilden in den Rohren, und lassen Sie das Gel für 5 min zu festigen.
  10. Übertragen der Galvanotaxis Kammer zu der lebenden Zellen System, zusammen mit dem Agarosegel Rohren, Ag / AgCl-Elektroden, und ein Paar von leeren 60 mm Petrischalen, die als Reservoire Kulturmedien verwendet werden und wird die Ag / AgCl-Elektroden enthalten. Lassen Sie die Galvanotaxis Kammer innerhalb des 37 ruhen ° C, 5% CO 2-Umgebung für 20-30 min.
  11. Während dieser Zeit bereiten die Deckel der 2 leere Petrischalen und den Deckel der Petrischale des Galvanotaxis Kammer die durch Bohren von Löchernin sie mit einem Dremel oder ein ähnliches Werkzeug, wie in Abbildung 3 gezeigt.
  12. Pipette 1-1,5 ml EFH-SFM oder FBS-SFM auf beiden Seiten der zentralen Rinne und 7-8 ml SFM in jedes leere Petrischale. Legen Sie eine Petrischale auf jeder Seite des Galvanotaxis Kammer der zentralen Mulde und Ort ein Ag / AgCl-Elektrode in jede Schale. Die Lücke zwischen der Kammer und den Galvanotaxis Petrischalen auf elektrische Kontinuität mit den Agarosegel Brücken zu schaffen, wie in Abbildung 4 dargestellt.
  13. Schließen Sie die Ag / AgCl-Elektroden mit einem externen Netzteil, mit einem Amperemeter in Reihe, um elektrischen Strom zu messen, und schalten Sie die Stromversorgung. Mit einem Voltmeter, um die Stärke des elektrischen Feldes direkt auf der zentralen Mulde zu messen, und den Ausgangspegel der Stromversorgung bis die gewünschte elektrische Feldstärke erreicht ist (die Assays in diesem Labor durchgeführt nutzen eine dcEF Stärke von 250 mV / mm mit elektrischer Strom zwischen 1 und 1,5 mA).
  14. Initiate der Zeitraffer-Modul auf dem Live Cell Imaging System und ermöglichen das Experiment, um die gewünschte Menge an Zeit laufen. Nach Abschluss des Tests, fixieren die Zellen in 4% Paraformaldehyd für Standard Immunfärbung Analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kinematische Analyse zeigt, daß in Gegenwart von 250 mV / mm dcEF, undifferenzierte NPCs sehr gerichtet und rasche Galvanotaxis Richtung der Kathode (5A, Kinofilm 1) aufweisen. In Abwesenheit eines dcEF wird zufällige Bewegung der Zellen beobachtet (5B, Film 2). Zu dieser Feldstärke> 98% von undifferenzierten NSCs für die gesamte 6-8 h, für die sie abgebildet migrieren, und da tote Zellen nicht migrieren dies legt nahe, dass sie lebensfähig bleiben während dieses Zeitraums in Abwesenheit oder Anwesenheit eines dcEF.

Differenzierten Phänotypen unterziehen vernachlässigbare Migration sowohl in Anwesenheit und Abwesenheit eines dcEF (Filme 3, 4). Teilmengen von differenzierten Zellen erstrecken Prozesse, die senkrecht zur Richtung auszurichten des dcEF neigen, aber keine merkliche Zellkörper Translokation beobachtet wird.

Immunfärbung bestätigt, dass NPCs positive expressio haltenn der neuralen Vorläuferzellen Nestin nach 6 h dcEF Exposition (6A). In den Assays unter NPCs induzierten Phänotypen zu reifen differenzieren, exprimieren die Mehrzahl der Zellen, die das reife Astrozyten Marker gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) nach 6 h Belichtung dcEF (Abbildung 6B).

Die primären Antikörper in diesen Analysen verwendet wurden, waren wie folgt: monoklonalen anti-Nestin (1:400, Millipore, Kanada) und polyklonalen Kaninchen anti-GFAP (1:500, Sigma, Kanada). Die sekundären Antikörper in diesen Analysen verwendet wurden, waren wie folgt: Ziege-anti-Maus konjugiert mit AlexaFluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Kanada) und Ziege-anti-Kaninchen konjugiert mit AlexaFluor 488 (1:400, Invitrogen-Gibco , Kanada).

Abbildung 1
Abbildung 1. Neurospheres dem Matrigel Substrat und Dissoziation haltenaß in einzelne Zellen nach 17 Stunden Inkubation bei 37 ° C / 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit in EFH-SFM.

Abbildung 2
Abbildung 2. Illustration der Galvanotaxis Kammer. Streifen aus Vakuumfett verwendet, um einen Pool von Kulturmedien zu beiden Seiten der zentralen Rinne schaffen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Schematische der Löcher, die in den Deckeln der Galvanotaxis Kammer und die Kulturmedium Reservoirs gebohrt werden sollen. Die 7 mm Durchmesser Löcher in beiden Deckel werden verwendet, um die Agarosegel Rohre einzufügen. Die 4 mm Durchmesser Löcher im Deckel des Galvanotaxis Kammer wird verwendet, um das elektrische Potential direkt auf der zentralen Mulde mit einem Voltmeter messen. Die 4 mm Durchmesser Loch im Deckel des Kulturmediums reservoir ist, damit der Ag / AgCl-Elektrode, von dem Deckel der Schale zur Verbindung mit der Energieversorgung vorstehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Illustration der Galvanotaxis Kammerbaugruppe für Zeitraffer-Aufnahmen. Die Galvanotaxis Kammer ist die zentrale Petrischale, in dem die Zellen ausplattiert. Die Medien in der zentralen Petrischale Unterbringung der Galvanotaxis Kammer ist entweder SFM + EFH oder SFM + 1% FBS. Die Petrischalen auf jeder Seite der Kammer sind mit Galvanotaxis SFM gefüllt und enthalten auch die Ag / AgCl-Elektroden. Diese Elektroden werden an eine externe Stromversorgung angeschlossen ist, und die Überbrückung der drei Petrischalen mit Agarose-Gel-Brücken bildet eine vollständige Schaltung.

Abbildung 5
Abbildung 5. In der Präsentationce eines dcEF undifferenzierten NPCs durchlaufen eine schnelle galvanotactic Migration in Richtung der Kathode (A), während in der Abwesenheit eines dcEF die Zellen zufälligen radialen Migration (B) unterzogen werden.

Abbildung 6
Abbildung 6. Immunfärbung bestätigt, dass die NPCs bleiben Nestin-positiven undifferenzierten Vorläufern nach 6 h dcEF Exposition (A), und dass die NPCs bewogen, vor allem zu unterscheiden äußern die reife Astrozyten-Marker GFAP nach 6 h dcEF Exposition (B).

Movie 1. Zeitraffer-Video von undifferenzierten NPCs ausgesetzt einer dcEF. NSC auf Galvanotaxis Kammern für 17 hr in SFM + EFH plattiert, und dann auf eine 250 mV / mm aufweisen dcEF schnelle und gerichtete Wanderung in Richtung der Kathode freigelegt. 1 Sekunde video = 15 Minuten Echtzeit. Klicken Sie hier, um mo anzeigenvie.

Movie 2. Zeitraffer-Video von undifferenzierten NPCs in der Abwesenheit eines dcEF. NSC auf Galvanotaxis Kammern für 17 hr in SFM + EFH plattiert, und dann in der Abwesenheit eines angelegten dcEF abgebildet unterziehen zufällige Migration. 1 Sekunde video = 15 Minuten Echtzeit. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .

Movie 3. Zeitraffer-Video von differenzierten NPCs ausgesetzt einer dcEF. NSC auf Galvanotaxis Kammern für 69-72 h in SFM + FBS ausplattiert, und dann auf eine 250 mV / mm dcEF zeigen sehr geringe Migration in jeder Richtung ausgesetzt. 1 Sekunde video = 15 Minuten Echtzeit. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .

Movie 4. Zeitraffer-Video von differenzierten NPCs in Abwesenheit zu einer dcEF. NPCs auf Galvanotaxis cha überzogenmbers für 69-72 h in SFM + FBS und dann abgebildet in Abwesenheit eines angelegten dcEF weisen sehr geringe Migration in jeder Richtung, ähnlich zu differenzierten NPCs, die einem dcEF ausgesetzt sind. 1 Sekunde video = 15 Minuten Echtzeit. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieses Protokoll wurde von den etablierten Methoden der früheren Studien 7-9 angepasst. Galvanotactic Kammern kann unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Techniken, einschließlich der Errichtung eines separaten Glas gut für Einschluss Zellaussaat oder mit Hilfe von CO 2-Laser-Ablation zur Mikrofabrikation des zentralen Rinne 10,11 werden. Einige Techniken können mehr mühsam oder kostspieliger als andere. Wir haben eine einfache und kostengünstige Konstruktion eines Assays für NPC Galvanotaxis Kammer unter Verwendung von Materialien üblicherweise in den meisten Laboratorien gefunden Zellbiologie beschrieben. Unser Protokoll verfügt über einen beheizten, befeuchtet, CO 2 geregelten Inkubator, das Live Cell Imaging System, um die Zellen unter optimalen Bedingungen für eine kontinuierliche langfristige Bildgebung zu halten umgibt. Das Fehlen einer solchen Vorrichtung ist eine Einschränkung von einigen bereits veröffentlichten Techniken 9,12.

Neuere Arbeiten von einer anderen Gruppe zeigten ähnliche galvanotactic Verhalten von Zellen aus einer hippocampalen Zelllinie 13, mit einem anderen Protokoll und ein arbeitsintensiver Galvanotaxis Kammer-Konstruktion. Unser Test ist besonders elegant, dass es eine Analyse des gleichen Ausgangsbedingungen Population von Zellen erlaubt - primären Zellkulturen von undifferenzierten Neurosphäre abgeleiteten NPCs - das haben verschiedene Bedingungen, wodurch ein Vergleich der wandernden Eigenschaften beider undifferenzierten und differenzierten Zellen ausgesetzt wurde, einfach durch Änderung der Faktoren verwendet, um die Kulturmedien im Galvanotaxis Kammer zu ergänzen.

Der Test in diesem Protokoll vorgestellt ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die langfristige Verfolgung und Analyse der NPC Galvanotaxis, und möglicherweise auch andere Zelltypen, die galvanotactic Migration 14,15 unterziehen. Wie bei jedem Protokoll können Nuancen in der Vorbereitung und Durchführung bestimmter Schritte in diesem Protokoll erfolglosen Ergebnissen führen. Die folgenden Richtlinien und Vorschläge sollten soSIST bei der erfolgreichen Durchführung dieses Protokolls:

  • Um die Zellen nach der Durchführung elektrischer Strom-assoziierten Hitzetod zu verhindern, haben die Abmessungen der Kammer Galvanotaxis so berechnet, dass die Wirkungen von Joule-Heizung 16 zu minimieren. Die Wärme in der Kammer erzeugt wird, ist proportional zum Quadrat des durchfließenden Stroms ist, die wiederum proportional zu der Querschnittsfläche des Galvanotaxis Kammer ist. Wir empfehlen Aufrechterhalten der Querschnittsfläche der Kammer als 2,04 mm 2 (12 mm x 0,17 mm).
  • Nach 7 Tagen Kultur Neurosphären können gesammelt werden, in einzelne Zellen dissoziiert und replattiert in Wachstumsfaktor-Bedingungen (ein Prozess bezeichnet als "Passage") zur sekundären Neurosphären ergeben. Wir beziehen unsere besten Ergebnisse mit Neurosphären, die weniger als drei Passagen unterzogen haben (maximal 21 Tage in Kultur), mit einem sichtbaren Rückgang der wandernden Möglichkeiten bei der Verwendung Neurosphären dass wurden eine größere numbe passagiertr von Malen. Dies steht im Einklang mit unseren früheren Arbeiten zeigen, dass längerfristige Kulturen Zellkinetik verändern 17.
  • Bei der Auswahl eines Galvanotaxis enthaltende Kammer NSCs zur Beobachtung, ist es wichtig, eine Kammer, in der die Neurosphäre abgeleiteten Zellen dissoziiert und um genaue kinematische Analysen erlauben auszuwählen. Wenn die nicht dissoziierten Neurospheres gut (NPC sind miteinander verklebt und kann nicht abgegrenzt werden kann), wird Analyse der einzelnen Zelle Zugverhalten nahezu unmöglich geworden. Die Kulturen sollten mehr Zeit vor der Beobachtung distanzieren zugelassen werden. Zusätzlich können Zellen, die in enger Nähe zueinander sind physikalisch behindern die Migration von Nachbarzellen. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass Zellen positioniert mindestens einen Zellkörper weg von ihren nächsten benachbarten Zelle zu wesentlich größeren Geschwindigkeiten als Zellen, die miteinander in der Nähe der Mitte des dissoziierten Neurosphäre geclustert sind migrieren, wenn auch mit gleicher erzeictedness.
  • Wenn es eine Fülle von Prozessen, die sich von den NPCs, ist dies ein Indikator dafür, dass die Zellen begonnen haben, zu unterscheiden, und deshalb sind sie nicht ein getreues Abbild einer undifferenzierten Bevölkerung. Ein Vorteil der Herstellung der Galvanotaxis Kammern in dreifacher Ausführung ist, dass die verbleibenden zwei Kammern, die nicht für Zeitraffer-Bildgebung ausgewählt sind sofort nach ihrer inkubierten Plattieren Periode (Schritt 2.16) befestigt zu werden, und um die Differenzierung immungefärbt Profil der Zellen verifizieren.
  • Für optimale Ergebnisse die Kulturmedien sollte frisch hergestellt und an jedem Tag, dass es erforderlich ist, ergänzt.
  • Die Zeitraffer-Aufnahmen und anschließende kinematische Analysen sind sehr empfindlich gegen Störung der Probe. Die lebenden Zellen an einem Mikroskop sollte Lufttisch, um Vibrationen zu minimieren platziert werden, und das System sollte während Experimentieren gestört werden.

Unser Labor routinemäßig Bilder NPC galvanotAchse für 6-8 h, obwohl bis zu 15-h-Analysen wurden durchgeführt. Im Laufe der 15-Stunden Zeitraum sank die dcEF über die Kammer von 250 mV / mm bis 227 mV / mm (9,2% Rückgang). Längere Zeiträume Bildgebung zwangsläufig zu modifizieren den pH des Mediums in der Kammer, des Weiteren Modifizieren des elektrischen Feldes. So empfiehlt es sich, Ersetzen Sie die Medien etwa alle 6 Stunden. Wir haben jedoch 8-Std NPC Galvanotaxis Assays ohne Medienaustausch durchgeführt und haben keine merkliche Zelltod (tote Zellen nicht migrieren) oder Rückgang der Zellmotilität beobachtet, die Zellen behalten ihre Wanderungsgeschwindigkeit während des Experiments. Der Prüfer kann auch die Tiefe der Kammer, um die Stabilität des dcEF 10 zu erhöhen.

Nach der Bilderzeugung wird einzellige kinematische Tracking-Analyse auf einer Teilmenge der abgebildeten Zellen unter Verwendung Zeiss Axiovision Software Tracking-Modul durchgeführt. Die Zellen werden für die Analyse ausgewählt, wenn sie näher an der Kante lokalisiert sinddas dissoziierte Neurosphäre und mindestens einen Zellkörper abgesehen von seinem nächsten Zelle. Die Logik dahinter ist, um die Wahrscheinlichkeit von Zellen einander überlappen während der Verfolgung zu minimieren, was würde einzelne Zellen verfolgen nahezu unmöglich. Wir analysieren die folgenden vier Parameter der Migration:

  1. X-Achsen-Verschiebung - die Entfernung eine Zelle wandert in Richtung der Achse, die parallel zu der Richtung der dcEF ist.
  2. Velocity - die geradlinige Abstand zwischen Anfangs-und Endzustand Zelle Positionen durch die verstrichene Zeit geteilt.
  3. Gerichtetheit - x-Achsen-Verschiebung durch die geradlinige Entfernung zwischen den anfänglichen und endgültigen Zellpositionen unterteilt.
  4. Tortuosität - die gesamte Wegstrecke von der Zelle durch die geradlinige Entfernung zwischen Anfangs-und End Zellpositionen unterteilt.

Diese beiden letztgenannten Parameter sind Indikatoren, wie gerade die Migration Signalweg ist in einer bestimmten Richtung.

18 zu ermöglichen. Als geeignetes Substrat und Kulturmedien müsste für andere Zelltypen ausgewählt werden, und die Dauer der Zellaussaat vor der Bebilderung sollten nach Bedarf eingestellt werden. Bemerkenswerterweise können die Abmessungen der Kammer müssen modifiziert in Abhängigkeit von der Dicke des untersuchten Gewebes (zum Beispiel, wenn ein Gewebeschnitt ist in der Kammer angeordnet) werden. Der Prüfer sollte im Hinterkopf tha tragent für einen Satz elektrische Feld, ist der Stromfluss durch die Kammer direkt proportional zu der Querschnittsfläche der Kammer, und daher erhebliche Erweiterungen zu der Kammer Abmessungen kann zu erhöhten Joule'sche Erwärmung verbundenen Zelltod führen.

Die Techniken, die in diesem Bericht beschrieben ein mächtiges Werkzeug für die Untersuchung der wichtigen, aber nicht weit studiert, Phänomen Galvanotaxis. Die Fähigkeit von Zellen, um zu reagieren dcEFs hat direkten therapeutischen Implikationen. Elektrische Stimulation (deep brain stimulation) bereits bewährt, bei der Behandlung der Parkinson-Krankheit und hat sich gezeigt, Neurogenese in einem Mausmodell 19,20 fördern. Ein vollständiges Verständnis der zellulären Mechanismen, die für dcEF Transduktion in zelluläre Motilität kann schließlich auf die Verwendung der elektrischen Stimulation als klinischer Mittel zum Verstärken und Leiten endogenen Vorstufe Migration auf Seiten von Verletzungen oder disea führense zur Erleichterung der Reparatur-Prozess. Die oben beschriebenen Verfahren bieten eine einfache und robuste Art der Untersuchung dieser Prozesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird durch die Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant # 249669 und # 482986) und Heart and Stroke Foundation of Canada (Grant # 485508) gefördert. Die Autoren danken Youssef El-Hayek und Dr. Qi Wan für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der experimentellen Protokolle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl Sigma S5886 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl Sigma P5405 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2 Sigma M2393 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3 Sigma S5761 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose Sigma G6152 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2 Sigma C7902 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin Gibco 15070
Bovine pancreas trypsin Sigma T1005
Sheep testes hyaluronidase Sigma H6254
Kynurenic acid Sigma K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor Worthington LS003086
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 21700075
30% Glucose Sigma G6152
7.5% NaHCO3 Sigma S5761
1M HEPES Sigma H3375 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine Gibco 25030
EGF Invitrogen PMG8041 Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF Invitrogen PHG0226 Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin Sigma H3149
Apo-transferrin R&D Systems 3188-AT 0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine Sigma P7505 Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin Sigma I5500 Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection microscope Zeiss Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides VWR 16004
6N Hydrochloric Acid VWR BDH3204-1
High vacuum grease Dow Corning
60 mm Petri dishes Fisher Scientific 0875713A
Poly-L-lysine Sigma P4707
Matrigel BD Biosciences 354234 Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS Invitrogen 10082139 Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope Olympus CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire Alfa Aesar 11434
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Heat Inactivated FBS Sigma 16140071
PVC tubing Fisher Scientific 80000006 3/32"ID x 5/32"OD
Bleach Clorox
10 cc syringe BD 309604
18 gauge needle BD 305195
Dremel drill Dremel Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber Zeiss Axiovert-200M

Recipes

Item Volume
2M NaCl 6.2 ml
1M KCl 0.5 ml
1M MgCl2 0.32 ml
155mM NaHCO3 16.9 ml
1M Glucose 1 ml
108 mM CaCl2 0.09256 ml
Penicillin-streptomycin 1 ml
Autoclaved water 74 ml

Artificial cerebrospinal fluid

Item Volume or Mass
Artificial cerebrospinal fluid 30 ml
Bovine pancreas trypsin 40 mg
Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg
Kynurenic acid 5 mg

Trypsin Solution

Item Volume or Mass
SFM 15 ml
Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg

Trypsin Inhibitor Solution

Item Volume
Autoclaved water 37 ml
10X DMEM/F12 10 ml
30% Glucose 2 ml
7.5% NaHCO3 1.5 ml
1M HEPES 0.5 ml
Transferrin, Putrescine solution 4 ml
25 mg insulin solution 4 ml
Selenium 100 μl
Progesterone 100 μl

Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)

Item Volume
Autoclaved water 37.5 ml
10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml
30% Glucose 1 ml
7.5% NaHCO3 0.75 ml
1M HEPES 0.25 ml
Hormone mix 5 ml
L-glutamine 0.5 ml
Penicillin-streptomycin 0.5 ml

Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS

Item Volume
Matrigel 150 μl
SFM 3.6 ml

Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.

Item Volume or Mass
UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20
SFM
Heat Inactivated FBS
8 ml
2 ml

Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
  2. Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
  3. Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
  6. Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
  7. Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
  8. Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
  9. Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
  10. Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  11. Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  12. SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
  13. Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
  14. Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
  15. Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
  16. McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
  17. Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
  18. Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
  19. Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
  20. Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).

Tags

Neuroscience Ausgabe 68 Biomedical Engineering Zellbiologie Physiologie Molekularbiologie neuralen Vorläuferzellen Galvanotaxis Zellmigration Zeitraffer-Aufnahmen elektrische Felder
A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R.,More

Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field. J. Vis. Exp. (68), e4193, doi:10.3791/4193 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter