Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica

Summary

In questo protocollo si dimostra come costruire camere personalizzate che consentono l'applicazione di un campo di corrente elettrica diretta a consentire time-lapse imaging del cervello adulto derivato neurale traslocazione cellula precursore durante galvanotaxis.

Abstract

La scoperta di staminali e cellule progenitrici (collettivamente chiamati cellule precursori neurali) (NPC) nel cervello dei mammiferi adulti ha portato ad un corpo di ricerca finalizzata ad utilizzare le proprietà multipotenti e proliferativi di queste cellule per lo sviluppo di strategie neurorigenerativo. Un punto critico per il successo di tali strategie è la mobilitazione di NPC verso un sito di lesione dopo trapianto esogena o per migliorare la risposta dei precursori endogeni che si trovano nella regione periventricolare del SNC. Di conseguenza, è essenziale per comprendere i meccanismi che promuovono, guidare, e migliorare la migrazione NPC. Il nostro lavoro si concentra su l'utilizzo di campi elettrici a corrente diretta (dcEFs) per la promozione e la migrazione diretta NPC - un fenomeno noto come galvanotaxis. Campi elettrici endogeni fisiologici operato come spunti critici per la migrazione delle cellule durante il normale sviluppo e la riparazione delle ferite. Interruzione farmacologica dellatrans-neurale potenziale tubo in embrioni axolotl causa gravi malformazioni dello sviluppo ^1. Nel contesto della guarigione delle ferite, il tasso di riparazione di cornea feriti è direttamente correlata con la grandezza del potenziale lesione epiteliale che sorge dopo la lesione, come mostrato dal miglioramento farmacologico o interruzione di questo dcEF ^2-3. Abbiamo dimostrato che adulti NPC subependimali incontro a rapida e diretta migrazione catodiche in vitro quando esposti ad un dcEF applicata esternamente. In questo protocollo si descrivono le tecniche del nostro laboratorio per la creazione di un saggio galvanotaxis semplice ed efficace ad alta risoluzione, osservazione a lungo termine della traslocazione cellula diretto del corpo (migrazione) su una singola cellula. Questo saggio sarebbe adatto per indagare i meccanismi che regolano la trasduzione dcEF in motilità cellulare attraverso l'uso di topi transgenici o knockout, brevi RNA interferenti, o agonisti dei recettori specifici / antagonisti.

Protocol

Tutte le procedure che comportano il trattamento degli animali sono state approvate dal Comitato Università di Toronto Animal Care in conformità con le linee guida istituzionali (protocollo n. 20009387). I metodi seguenti devono essere effettuate utilizzando strumenti sterili e tecniche, in una cappa a flusso laminare dove applicabile.

Nel testo del protocollo sottostante, la frase "EFH-SFM" si riferisce a mezzi di informazione liberi siero integrato con il fattore di crescita epidermico, fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti e eparina. EFH-SFM viene utilizzato quando studiando la galvanotaxis di NPCs indifferenziate perché questi mitogeni mantenere NPC nel loro stato indifferenziato ^4. Quando si verifica il galvanotaxis di NPC indotte a differenziarsi in tipi di cellule mature, "FBS-SFM" si riferisce a mezzi di informazione liberi siero addizionato con 1% di siero fetale bovino. FBS promuove la differenziazione dei PNG in mature fenotipi neurali ^5.

1. Isolamento e la coltura dei precursori neurali (nonmostrato nel video)

1. Anestetizzare un topo CD1 (6-8 settimane) con isofluorano e sacrificio tramite dislocazione cervicale.
2. Spegnere la testa in etanolo al 70% e decapitare l'animale con le forbici affilate dissezione.
3. Mentre si tiene la testa con una pinza chirurgica, togliere la pelle sulla superficie dorsale per esporre il cranio.
4. Utilizzando un bisturi e non. 11 lame, segnare il cranio al seno frontale lungo l'asse medio-laterale, e anche lungo la sutura sagittale in direzione rostrocaudale.
5. Sbucciare le ossa parietali di distanza dalla testa senza. 7 pinze curve, facendo attenzione a non perforare il tessuto cerebrale.
6. Inserire una spatola sottile sotto il cervello a partire da sotto il cervelletto e avanzando verso i bulbi olfattivi. Tenendo il cranio in posizione con le pinze, tirare delicatamente il cervello dal cranio e subito mettere in ghiaccio freddo liquido cerebrospinale artificiale (vedi le ricette sotto).
7. Sotto un microscopio di dissezione, utilizzando steriledissezione forbici e pinze tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana. Ruotare ciascun emisfero in modo che il mediale (taglio) di superficie rivolta verso l'alto.
8. Selezionare un emisfero, e con la superficie mediale rivolta verso l'alto, individuare il splenio del corpo calloso (regione posteriore del corpo calloso).
9. Effettuare un'incisione dalla superficie della corteccia alla splenio del corpo calloso lungo l'asse dorsoventrale.
10. Sbucciare la corteccia incisa verso il bulbo olfattivo per esporre le pareti mediale e laterale del ventricolo laterale.
11. Ruotare l'emisfero in modo che la superficie dorsale rivolta verso l'alto, e usare microforbici curve per tagliare e raccogliere le pareti esposte mediale e laterale, che contengono la regione periventricolare dove PNG risiedono ^6.
12. Ripetere i passaggi 1,8-1,11 per l'altro emisfero.
13. Pipettare il tessuto isolato in 7 ml di soluzione di tripsina (vedi ricetta sotto) in un tubo da 15 cc, e posizionare il tubo su un agitatore a 37 ° Cincubatore per 25 min.
14. Centrifugare la provetta a 1500 rpm per 5 minuti, aspirare il surnatante, risospendere il tessuto e in 2 ml di soluzione di tripsina (vedi ricetta sotto).
15. Triturare delicatamente il tessuto con un piccolo pozzo pipetta Pasteur 30-50 volte con attenzione per evitare bolle d'aria.
16. Centrifugare la provetta a 1500 rpm per 5 minuti, aspirare il supernatante, e risospendere in 1-2 ml di SFM (vedi ricetta sotto) triturando il pellet 3-5 volte.
17. Centrifugare la provetta a 1.500 rpm per 3 minuti, aspirare il surnatante e risospendere in 1 ml di SFM + EFH.
18. Contare vivere densità delle cellule con un emocitometro e piastra le cellule in una beuta T25 coltura ad una densità di 10 cellule per microlitri di SFM + EFH.
19. Lasciare che la cultura di crescere per 7 giorni per ottenere indisturbati neurosfere primarie liberamente fluttuanti composti da NPC.

2. Galvanotaxis camera di preparazione

1. Mettere 3 vetro quadrato no. 1 vetrini coprioggetto (22 x 22 x 0.17 mm) ina bottiglia di acido cloridrico 6N overnight.
2. Il giorno successivo, utilizzare una punta di diamante di vetro taglierina per tagliare sei strisce rettangolari (22 x 5 x 0.17 mm) di vetro da nessuna piazza. 1 coperchio scivola.
3. Trasferire i tagliandi quadrati lavata con acido e marze rettangolari in una cappa a flusso laminare. Lavare le strisce rettangolari e quadrate prima con etanolo al 70%, poi con coltura tissutale acqua di grado autoclavato, e lasciare asciugare su un Kim Wipe (per sterilità aggiunto, il vetro può essere consentito di aria secca).
4. Applicare grasso per vuoto al perimetro di una superficie dei vetrini quadrati, e sigillare a base di piatti di plastica 60 millimetri Petri.
5. Applicare grasso per vuoto lungo l'asse di una superficie delle strisce rettangolari di vetro, e sigillare a bordi opposti dei vetrini quadrati (in modo che siano paralleli tra loro) in modo da creare una depressione centrale.
6. UV-sterilizzare le camere per almeno 15 min in cappa a flusso laminare.
7. Pipettare 250-300 microlitri di poli-L-lizzane sul canale centrale delle camere e incubare a temperatura ambiente per 2 h.
8. Circa 15 minuti prima della fine del periodo di incubazione, preparare la soluzione Matrigel (vedi ricetta sotto).
9. Aspirare il poli-L-lisina, lavare gli avvallamenti centrali con 1 ml di acqua autoclavato, e pipetta 250-300 microlitri di soluzione di Matrigel sulle depressioni centrali.
10. Incubare le camere a 37 ° C per 1 ora.
11. Aspirare la soluzione Matrigel e lavare delicatamente i trogoli centrali con 1-2 ml di SFM.
12. Pipettare 100 ul di EFH-SFM o FBS-SFM sulle depressioni centrali e trasferire le camere galvanotaxis sul palco di un microscopio di conteggio.
13. Pipetta 3-4 ml di neurosfere contenente coltura in piastre da 60 mm Petri e trasferire il piatto Petri alla fase del microscopio conteggio.
14. Ad un obiettivo di visualizzazione 5x, utilizzare una pipetta P10 trasferire 5-8 neurosfere interi (fino a quattro alla volta) sul canale centrale di ogni galvanotaxiscamera senza dissociare, e con cura diffondere le neurosfere di tutto il canale centrale, senza interrompere il substrato Matrigel.
15. Aggiungi un ulteriore 150-200 ml di EFH-SFM o FBS-SFM sulle depressioni centrali.
16. Trasferire le camere galvanotaxis in un 37 ° C, 5% di CO _2, 100% incubatore umidificato per 17-20 hr (se analizzando NPCs indifferenziate) per consentire la neurosfere di aderire al substrato Matrigel e dissociarsi in singole cellule, come mostrato in Figura 1 . Se l'analisi di NPC differenziati, il periodo di incubazione dovrebbe essere esteso per 69-72 ore per permettere la differenziazione delle cellule.

3. Live cellulare Time-Lapse Imaging

1. Permettono il sistema live cell imaging equilibrare a 37 ° C, 5% di CO ₂ per un minimo di 30 minuti prima dell'inizio del time-lapse.
2. Tagliate due 12 pezzi cm di 1 mm di diametro del filo d'argento, l'avvolgimento di bobine da un capo, e metterli in Clorox blisciviazione per 20 minuti per formare Ag / AgCl elettrodi.
3. Trasferire le camere galvanotaxis sul palco di un microscopio di conteggio e scegliere quale camera sarà utilizzato per live-cella di analisi di immagini di migrazione sulla base dei seguenti criteri: i) le neurosfere dovrebbe essere quasi completamente dissociato in singole cellule e ii) le cellule devono possedere morfologie rotondi con piccole-to-nessun processo si estende dai corpi cellulari.
4. Trasferire la camera selezionata galvanotaxis in una cappa a flusso laminare, con un no quadrato separato. 1 coperchio in vetro antiscivolo e grasso per vuoto.
5. Lavare il coperchio scivolare prima con etanolo 70%, poi con acqua autoclavata, e applicare una striscia di grasso per vuoto su due bordi paralleli del vetrino.
6. Aspirare il mezzo di coltura dalla vasca centrale della camera, quindi rapidamente posizionare il vetrino (grasso lato rivolto verso il basso) sulla camera di modo che il resto del grasso strisce sulle due strisce parallele rettangolari di vetro, creando un tettoalla camera.
7. Pipettare 100 ul di fresco EFH-SFM o FBS-SFM nella vasca centrale tramite azione capillare.
8. Utilizzare grasso per vuoto per creare bordi per piscine di terreni di coltura su ciascuna estremità del canale centrale, come mostrato in Figura 2.
9. Tagliate due 15 pezzi cm di tubo in PVC, e utilizzare una siringa da 10 cc con un ago da 18 gauge per iniettare con attenzione la soluzione di agarosio nel tubo, assicurando che nessun bolle si formano nei tubi, e permettere al gel di solidificare per 5 minuti.
10. Trasferire la camera galvanotaxis al sistema live imaging cellulare, insieme al gel di agarosio tubi, Ag / AgCl elettrodi, e un paio di piatti vuoti 60 millimetri Petri che verranno utilizzati come mezzi di coltura serbatoi e conterrà il Ag / AgCl elettrodi. Lasciare la camera galvanotaxis ad arrestarsi entro i 37 ° C, 5% di CO ₂ ambiente per 20-30 min.
11. Durante questo tempo, preparare i coperchi dei 2 piatti vuoti Petri e il coperchio della scatola di Petri della camera galvanotaxis da parte di foriin loro con un utensile Dremel o simile come mostrato in Figura 3.
12. Pipettare 1-1,5 ml di EFH-SFM o FBS-SFM su entrambi i lati del canale centrale, e 7-8 ml di SFM in ciascuna piastra di Petri vuota. Mettere una piastra di Petri su ciascun lato del canale centrale della camera galvanotaxis e mettere un Ag / AgCl in ogni piatto. Colmano il divario tra la camera galvanotaxis e le piastre di Petri di stabilire una continuità elettrica con i ponti gel agarosio, come mostrato in Figura 4.
13. Collegare le Ag / AgCl elettrodi a un alimentatore esterno, con un amperometro in serie per misurare la corrente elettrica, e accendere l'alimentazione. Utilizzare un voltmetro per misurare la forza del campo elettrico direttamente attraverso il trogolo centrale, e regolare l'uscita dell'alimentatore finché la forza desiderata campo elettrico viene ottenuto (i saggi effettuati in questo laboratorio utilizzano una forza dcEF di 250 mV / mm con corrente elettrica tra 1 e 1,5 mA).
14. Iniziativate il time-lapse modulo sul sistema live imaging cellulare, e che l'esperimento possa funzionare per il tempo desiderato. Dopo il completamento del test, fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per l'analisi immunoistochimica standard.

Representative Results

Analisi cinematica rivela che in presenza di un mV / mm 250 dcEF, NPCs indifferenziate esporre galvanotaxis altamente orientati e rapido verso il catodo (figura 5A, Movie 1). In assenza di un dcEF, movimento casuale delle cellule si osserva (figura 5B, Movie 2). A questa forza di campo,> 98% di NPCs indifferenziate migrare per l'intero 6-8 hr per cui essi vengono esposte, e poiché le cellule morte non migrano questo suggerisce che essi rimangono vitali durante questo periodo, in assenza o presenza di un dcEF.

Fenotipi differenziati subiscono migrazione trascurabile, sia in presenza che in assenza di un dcEF (Film 3, 4). Sottoinsiemi di cellule differenziate estendere i processi che tendono ad allineare perpendicolarmente alla direzione del dcEF, ma non evidente traslocazione corpo cellulare viene osservata.

Immunocolorazione verifica che i PNG mantenere positivo expression del precursore nestina neurale marcatore dopo 6 ore di esposizione dcEF (Figura 6A). Nei saggi coinvolgono NPC indotte a differenziarsi in fenotipi maturi, la maggioranza delle cellule mature astrociti esprimono il marcatore proteina acida fibrillare gliale (GFAP), dopo 6 ore di esposizione dcEF (Figura 6B).

Gli anticorpi primari utilizzati in queste analisi sono stati i seguenti: anticorpi monoclonali di topo anti-nestina (1:400, Millipore, Canada), e policlonale di coniglio anti-GFAP (1:500, Sigma, Canada). Gli anticorpi secondari utilizzati in queste analisi sono state le seguenti:-capra anti-topo coniugato con Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Canada), e di capra anti-coniglio coniugato con Alexafluor 488 (1:400, Invitrogen-Gibco , Canada).

Figura 1. Neurosfere aderire al substrato e Matrigel dissocimangiato in singole cellule dopo 17 ore di incubazione a 37 ° C / 5% di CO _2, 100% di umidità in EFH-SFM.

Figura 2. Illustrazione di camera galvanotaxis. Strisce di grasso per vuoto sono utilizzati per creare un pool di terreni di coltura su entrambi i lati del canale centrale.

Figura 3. Schema di fori che devono essere perforati nella coperchi della camera galvanotaxis ed i serbatoi di terreno di coltura. I fori 7 mm di diametro in entrambi i coperchi sono usati per inserire i tubi gel di agarosio. I fori 4 mm di diametro nel coperchio della camera galvanotaxis viene utilizzato per misurare il potenziale elettrico direttamente attraverso il canale centrale utilizzando un voltmetro. Il diametro di 4 mm foro nel coperchio del re terreno di colturaservoir è di consentire l'Ag / AgCl a sporgere dal coperchio del piatto per il collegamento alla rete di alimentazione.

Figura 4. Illustrazione di montaggio camera galvanotaxis per time-lapse imaging. La camera galvanotaxis è il piatto Petri centrale, in cui le cellule vengono piastrate. I mezzi di comunicazione all'interno del corpo centrale capsula di Petri della camera galvanotaxis è o + SFM EFH o SFM + 1% FBS. Le piastre di Petri su entrambi i lati della camera galvanotaxis sono pieni di SFM, e contengono anche i Ag / AgCl elettrodi. Questi elettrodi sono collegati ad una alimentazione esterna, e colmando le tre piastre di Petri con gel di agarosio-ponti forma un circuito completo.

Figura 5. Nella presentazionece di un NPC dcEF indifferenziate subiscono una rapida migrazione galvanotactic verso il catodo (A), che in assenza di un dcEF le cellule subiscono casuale migrazione radiale (B).

Figura 6. Immunocolorazione verifica che i NPC rimangono indifferenziate precursori nestina-positivi dopo 6 ore di esposizione dcEF (A), e che i NPC indotte a differenziare soprattutto esprimere la GFAP maturo marcatore degli astrociti dopo 6 ore di esposizione dcEF (B).

Movie 1. Time-lapse video di NPC indifferenziati esposti ad un dcEF. NPC piastrate su camere galvanotaxis per 17 ore in SFM + EFH, e quindi esposto a un mV / mm 250 migrazione mostra dcEF rapida e diretta verso il catodo. 1 secondo di video = 15 minuti in tempo reale. Clicca qui per vedere movie.

Movie 2. Time-lapse video di NPCs indifferenziate, in assenza di un dcEF. NPC piastrate su galvanotaxis camere per 17 hr a SFM + EFH, e poi ripreso in assenza di un dcEF applicata subiscono migrazione casuale. 1 secondo di video = 15 minuti in tempo reale. Clicca qui per visualizzare filmati .

Movie 3. Time-lapse video di NPC differenziati esposti ad un dcEF. NPC piastrate su camere galvanotaxis per 69-72 hr in SFM + FBS, e quindi esposto a un mV / mm 250 migrazione mostra dcEF molto poco in qualsiasi direzione. 1 secondo di video = 15 minuti in tempo reale. Clicca qui per visualizzare filmati .

Movie 4. Time-lapse video di NPC differenziate in assenza di un dcEF. NPC piastrate su galvanotaxis chambers per 69-72 hr in SFM + FBS, e poi ripreso in assenza di un dcEF applicata esporre migrazione molto poco in qualsiasi direzione, simile a NPC differenziate che sono esposti a un dcEF. 1 secondo di video = 15 minuti in tempo reale. Clicca qui per visualizzare filmati .

Discussion

Questo protocollo è stato adattato da ben consolidati metodi di studi precedenti ^7-9. Camere Galvanotactic può essere costruito utilizzando una varietà di tecniche diverse, compresa la costruzione di un bicchiere ben separata per il confinamento di semina cellulare, o mediante ablazione laser CO ₂ per microfabbricazione del trogolo centrale ^10,11. Alcune tecniche possono essere più laborioso o costose di altre. Abbiamo descritto un test semplice e conveniente per la costruzione di una camera NPC galvanotaxis utilizzando materiali comunemente in molti laboratori di biologia cellulare. Nostro protocollo include una riscaldata, umidificata, CO ₂ incubatore regolamentato che circonda il sistema live imaging cellulare per mantenere le cellule in condizioni ottimali per continuo a lungo termine imaging. La mancanza di tale apparecchio è una limitazione di alcune tecniche precedentemente pubblicati ^9,12.

Un recente lavoro di un altro gruppo ha dimostrato galva similenotactic comportamento di cellule di una linea di cellule dell'ippocampo ^13, utilizzando un protocollo diverso e più un lavoro ad alta intensità di disegno della camera galvanotaxis. La nostra analisi è particolarmente elegante in quanto permette una analisi della popolazione iniziale di cellule identiche - colture cellulari primarie di NPC neurosfere derivate indifferenziate - che sono state esposte a condizioni distinte permettendo così un confronto delle proprietà di entrambi migratori cellule indifferenziate e differenziate, semplicemente modificando i fattori utilizzati per integrare i terreni di coltura all'interno della camera galvanotaxis.

Il saggio presentato in questo protocollo è un potente strumento per tracciamento a lungo termine e l'analisi di galvanotaxis NPC, e altri tipi di cellule, eventualmente, altri che subiscono la migrazione galvanotactic ^14,15. Come con qualsiasi protocollo, sfumature nella preparazione e l'esecuzione di alcuni passaggi di questo protocollo potrebbe portare a risultati infruttuosi. Le seguenti linee guida e suggerimenti come dovrebbeSist nella corretta esecuzione di questo protocollo:

• Per evitare che le cellule in fase di corrente elettrica associata morte termica, le dimensioni della camera galvanotaxis sono state calcolate per minimizzare gli effetti di riscaldamento Joule ^16. Il calore generato nella camera è proporzionale al quadrato della corrente che fluisce attraverso di essa, che è a sua volta proporzionale alla sezione trasversale della camera galvanotaxis. Consigliamo mantenendo l'area in sezione trasversale della camera come 2.04 mm ² (12 mm x 0.17 mm).
• Dopo 7 giorni di neurosfere cultura possono essere raccolti, dissociato in singole cellule e della crescita ripiastrate fattore di condizioni (un processo denominato 'passaging') per dare neurosfere secondari. Otteniamo i nostri migliori risultati con l'uso neurosfere che hanno subito meno di tre brani (massimo 21 giorni di coltura), con un calo visibile nelle capacità migratorie quando si utilizza neurosfere che sono stato posto un numbe maggiorer di volte. Ciò è coerente con il nostro lavoro precedente e dimostrano che a lungo termine colture alterare cinetica delle cellule ^17.
• Quando si seleziona una camera contenente galvanotaxis NPC per l'osservazione, è importante scegliere una camera in cui le cellule hanno neurosfere derivate dissociato bene per consentire accurate analisi cinematiche. Se le neurosfere non hanno dissociato bene (NPC vengono fatti aderire uno all'altro e non può essere delineata), analisi del comportamento singola cella migratorio diventerà quasi impossibile. Le colture devono essere autorizzati più tempo per dissociare prima osservazione. Inoltre, cellule che sono in stretta vicinanza l'uno all'altro può impedirne la migrazione delle cellule vicine. Le nostre analisi hanno mostrato che le cellule posizionate almeno un corpo cellulare lontano dal più vicino cellula vicina migrare a velocità significativamente maggiori rispetto alle cellule che sono raggruppati insieme in prossimità del centro del neurosfere dissociato, pur con dire ugualictedness.
• Se esiste un'abbondanza di processi estendono dalle NPC, questo è un indicatore che le cellule hanno iniziato a differenziare e quindi non sono una rappresentazione fedele di una popolazione indifferenziata. Un vantaggio di preparare le camere galvanotaxis in triplice copia è che i rimanenti due camere che non sono selezionati per time-lapse imaging può essere fissato immediatamente dopo il loro periodo di placcatura incubato (Passo 2,16), e immunostained verificare il profilo differenziazione delle cellule.
• Per ottenere risultati ottimali terreni di coltura devono essere preparati al momento e completato, su ogni giorno che è necessario.
• Il time-lapse immagini e le successive analisi cinematiche sono molto sensibili alle perturbazioni del campione. Il live-cella microscopio immagini dovrebbero essere posti su un tavolo aria per minimizzare le vibrazioni, e il sistema non deve essere perturbato durante la sperimentazione.

Il nostro laboratorio di routine immagini PNG galvanotasse per 6-8 ore, anche se fino a 15 ore-analisi sono stati effettuati. Nel corso dei 15-ore periodi, il dcEF attraverso la camera è sceso da 250 mV / mm a 227 mV / mm (9,2% di riduzione). Periodi più lunghi di imaging inevitabilmente modificano il pH dei mezzi di comunicazione nella camera, che modifichi il campo elettrico. Pertanto si consiglia di sostituire il supporto circa ogni 6 ore. Tuttavia, abbiamo effettuato 8 ore NPC saggi galvanotaxis senza la sostituzione dei supporti e non hanno osservato alcun evidente morte delle cellule (cellule morte non migrano) o diminuzione della motilità cellulare, le cellule mantengono la loro velocità di migrazione durante l'esperimento. Il ricercatore può anche ridurre la profondità della camera di aumentare la stabilità del dcEF ^10.

Seguendo imaging, cella singola analisi cinematica inseguimento viene eseguita su un sottoinsieme delle cellule sotto forma di immagini utilizzando il modulo di monitoraggio Zeiss AxioVision software. Cellule vengono selezionati per l'analisi se sono localizzate vicino al bordo dila neurosfere dissociato e almeno un corpo cellulare a parte la sua cella più vicino. La logica alla base di questo è quello di ridurre al minimo la probabilità di celle che si sovrappongono l'un l'altro durante il monitoraggio, il che renderebbe il monitoraggio delle singole celle quasi impossibile. Analizziamo i seguenti quattro parametri di migrazione:

1. X-asse di spostamento - la distanza di una cellula migra nella direzione dell'asse, che è parallelo alla direzione del dcEF.
2. Velocity - la distanza in linea retta tra le posizioni iniziali di cellule e finale diviso per il tempo trascorso.
3. Directedness - x-asse di spostamento diviso per la distanza in linea retta tra le posizioni iniziale e finale delle cellule.
4. Tortuosità - la distanza totale percorsa dal percorso della cella divisa per la distanza in linea retta tra le posizioni iniziali di cellule e finale.

Gli ultimi due parametri sono indicatori di come il percorso rettilineo migrazione è in una particolare direzione.

18. Un supporto appropriato substrato e cultura dovrebbe essere selezionato per altri tipi cellulari, e la durata della semina cellulare prima immagine deve essere regolata secondo necessità. In particolare, le dimensioni della camera può avere bisogno di essere modificati a seconda dello spessore del tessuto in esame (per esempio, se una porzione del tessuto viene posta nella camera). Il ricercatore dovrebbe tenere a mente that per un campo elettrico impostato, il flusso di corrente attraverso la camera è direttamente proporzionale alla sezione trasversale della camera, e quindi allargamenti significative dimensioni della camera potrebbe causare un aumento Joule riscaldamento correlata morte cellulare.

Le tecniche descritte in questo rapporto forniscono un potente strumento per indagare l'importante, ma non ampiamente studiato, fenomeno di galvanotaxis. La capacità delle cellule di rispondere a dcEFs ha dirette implicazioni terapeutiche. Stimolazione elettrica (stimolazione cerebrale profonda) è già dimostrato utile nel trattamento del morbo di Parkinson, e ha dimostrato di promuovere la neurogenesi ippocampale in un modello murino ^19,20. Una completa comprensione dei meccanismi cellulari responsabili della trasduzione dcEF nella motilità cellulare può portare l'uso della stimolazione elettrica come mezzo per il miglioramento clinico e dirigere la migrazione precursore endogeno ai siti di lesioni o DiseÃse per facilitare il processo di riparazione. I metodi sopra descritti forniscono un modo semplice e robusta di studiare questi processi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32"ID x 5/32"OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.