Summary
이 프로토콜에서 우리는 galvanotaxis 동안 신경 전구체 세포 translocation을 얻은 성인 뇌의 시간 경과 영상을 사용하려면 직류 전기장의 응용 프로그램을 허용 사용자 정의 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
신경 줄기 및 성인 포유류의 뇌 전구 세포 (이하 칭했다 신경 전구체 세포) (NPCs)의 발견은 neuroregenerative 전략의 개발이 세포 multipotent과 proliferative 속성을 활용하기위한 연구의 몸 시켰습니다. 이러한 전략의 성공을위한 중요한 단계는 외인성 이식 후 병변 사이트 향해 나 CNS의 periventricular 지역에서 발견되는 내생 전구체의 반응을 향상시키기 위해 NPCs의 동원이다. 따라서, 그것은, 홍보 안내 및 NPC 마이그레이션을 강화 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다. galvanotaxis로 알려진 현상 - 우리의 작품은 홍보 할 수 직류 전기 분야의 활용 (dcEFs)와 직접 NPC 마이그레이션에 초점을 맞추고 있습니다. 내생 생리 전기 분야는 정상적인 개발 및 상처 수리하는 동안 세포 이주에 대한 중요한 단서로 기능을 수행합니다. 의 약리 중단axolotl 배아의 횡단 신경 튜브의 잠재력은 심각한 발달 기형 1됩니다. 상처 치유의 맥락에서 상처 각막의 수리 율은 직접 dcEF 2-3의 약리 향상과 혼란에 도시 된 바와 같이, 부상 후 발생하는 상피 상처 잠재력의 크기와 상관되어 있습니다. 우리는 외부 적용 dcEF에 노출되면 성인 subependymal NPCs는 체외에 신속하고 감독 cathodal 마이그레이션을받을 것을 증명하고있다. 이 프로토콜에서 우리는 높은 해상도, 단일 셀 수준에서 직접 전지 본체의 translocation (마이그레이션)의 장기 관찰을위한 간단하고 효과적인 galvanotaxis 분석을 만들기위한 우리 연구실의 기술을 설명합니다. 이 분석은 유전자 변형이나 한방 마우스, 짧은 간섭 RNA, 또는 특정 수용체 agonists / antagonists의 사용을 통해 세포 운동성에 dcEF의 도입을 규제 메커니즘을 조사에 적합한 것입니다.
Protocol
동물 처리에 관련된 모든 절차는 제도적 지침 (프로토콜 안돼. 20009387)에 따라 토론토 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 다음과 같은 방법은 해당되는 층류 후드에 무균 도구와 기술을 사용하여 수행해야합니다.
아래의 프로토콜 텍스트에서 구문 "EFH-SFM은"표피 성장 인자, 기초 섬유 아세포 성장 인자와 헤파린과 보충 혈청 무료 미디어를 의미합니다. 이 mitogens가 undifferentiated 상태 4 NPCs을 유지하기 때문에 undifferentiated NPCs의 galvanotaxis를 조사 할 때 EFH-SFM이 사용됩니다. 성숙 세포 유형으로 구별하도록 유도 NPCs의 galvanotaxis을 조사 할 때, "FBS-SFM은"1% 태아 소 혈청을 보충 혈청 무료 미디어를 의미합니다. FBS는 성숙한 신경 phenotypes 5로 NPCs의 차별화를 촉진합니다.
1. 신경 전구체의 분리와 문화 (없음) 비디오에 표시
- 자궁 경부 전위를 통해 isofluorane과 희생으로 CD1 마우스를 (6~8주 세) 마취시키다.
- 70 % 에탄올에 머리를 끄게하고 날카로운 해부 가위로 동물을 목을 베다.
- 수술 집게로 머리를 누른 상태에서 두개골을 노출 등쪽 표면에 피부를 제거합니다.
- 메스와 더를 사용하지 않습니다. 11 블레이드, mediolateral 축을 따라 정면 굴에서 두개골을 득점하며 rostrocaudal 방향으로 시상 봉합을 따라.
- 멀리이없는 머리에서 정수리 뼈 껍질. 7 곡선 포셉은 피어스로 뇌 조직을 관리하지 말이지.
- 소뇌 아래에서 시작하여 후각 구근으로 발전 뇌 아래에 얇은 주걱을 삽입합니다. 포셉과 장소에 두개골을 누른 상태에서 부드럽게 두개골에서 뇌를 당겨 즉시 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수 (아래 레시피를 참조)에 배치합니다.
- 해부 현미경에서 무균 사용해부 가위와 집게는 중간 선을 따라 반으로 뇌에 상처를 냈어. 중간 (컷) 표면이 이상 직면 수 있도록 각 반구를 회전합니다.
- 반구를 선택하고 안쪽 표면이 위쪽으로 향해있는 코퍼스의 callosum (코퍼스의 callosum의 뒤쪽 지역)의 splenium를 찾습니다.
- 피질의 표면에서 dorsoventral 축을 따라 코퍼스 callosum의 splenium에 절개를합니다.
- 측면 심실의 중간과 측면 벽을 노출 할 수있는 후각 망울을 향해 칼에 베인 피질 껍질을 벗기다.
- 등쪽 표면이 위쪽으로 직면 있도록 반구를 회전하고, NPCs는 6 거주 periventricular 지역을 포함하는 노출 안쪽과 측면 벽을 잘라 및 수집 곡선 microscissors을 사용합니다.
- 반복은 다른 반구에 대한 1.8-1.11 단계를 반복합니다.
- 15 CC 관 트립신 솔루션 (아래 레시피를 참조) 7 ML로 분리 된 조직을 피펫, 그리고 37 ° C에서 로커에 관을 배치25 분을위한 보육.
- 5 분에 1,500 rpm으로 튜브를 원심 분리기, 표면에 뜨는을 대기음, 그리고 (아래 레시피를 참조) 트립신 억제제 솔루션 2 ML의 조직을 resuspend.
- 부드럽게 기포를 피하기 위해 조심스럽게 작은 시추공 파스퇴르 피펫 30-50 번과 조직을 씹다.
- 5 분에 1,500 rpm으로 튜브를 원심 분리기, 표면에 뜨는을 대기음, 그리고 펠렛에게 3-5 번 triturating하여 SFM 1-2 ML (아래 레시피를 참조) resuspend.
- 3 분에 1,500 rpm으로 튜브를 원심 분리기, SFM + EFH의의 표면에 뜨는 및 resuspend 1 ML을 대기음.
- SFM + EFH에 μl 당 10 셀의 밀도에서 T25 문화 플라스크에 혈구와 플레이트 세포와 세포 밀도를 살고 계산합니다.
- 문화 NPCs 구성 자유 부동 주요 neurospheres를 얻을 수 그대로 7 일 동안 성장 할 수 있습니다.
2. Galvanotaxis 상공 회의소 준비
- 더 세 광장 유리를 놓습니다. 1 커버 용지 (22 X 22 X 0.17 mm) 전하루 아침에 6N 염산이 없음 병.
- 다음 날, 광장 노에서 유리 6 직사각형 조각을 (22 × 5 X 0.17 mm) 잘라 다이아몬드 팁 유리 커터를 사용합니다. 한 표지 용지.
- 층류 흐름 후드에 산 세척 광장 전표 및 직사각형 전표를 전송합니다. 조직 문화 수준 autoclaved 물 다음, 70 % 에탄올로 먼저 사각형과 사각형 스트립을 씻고, 그리고 닦아 킴 건조 할 수 있도록 (추가 불임에 대한, 유리는 공기 건조에 허용 될 수 있습니다.)
- 사각형 유리 슬라이드 중 하나 표면의 경계에 진공 그리스를 적용하고, 60mm 플라스틱 배양 접시의 기본으로 봉인.
- 직사각형 유리 스트립 중 하나 표면의 긴 축을 따라 진공 그리스를 적용하고, 중앙 트로프를 생성하기 위해 광장 유리 슬라이드의 반대 가장자리 (서로에 평행되도록)로 밀봉.
- 층류 흐름 후드에 적어도 15 분 동안 방을 UV-소독.
- 폴리-L-라이시의 피펫 250-300 μl2 시간 동안 실온에서 챔버 및 배양의 중심 트로프로 NE.
- 부화 기간이 종료하기 전에 약 15 분 (아래 레시피 참조) Matrigel 솔루션을 준비합니다.
- , 폴리-L-라이신을 기음 autoclaved 물 1 ML, 그리고 중앙 골짜기로 Matrigel 솔루션의 피펫 250-300 μl를 중앙 골짜기을 씻는다.
- 1 시간에 37 ° C에서 방을 품다.
- Matrigel 솔루션을 기음 부드럽게 SFM 1-2 ML과 중앙 골짜기을 씻는다.
- 피펫 100 중앙 골짜기로 EFH-SFM 또는 FBS-SFM의 μl와 계산 현미경의 무대에 galvanotaxis 방을 전송할 수 있습니다.
- 피펫 3-4 60mm 페트리 접시에 neurosphere 함유 문화의 ML하고 계산 현미경의 무대에 페트리 접시를 전송할 수 있습니다.
- 5 배의 볼 목적에서, 각 galvanotaxis의 중심 구유에 5-8 전체 neurospheres을 (최대 4 번) 전송 P10 피펫을 사용하여을 dissociating, 그리고 조심스럽게 Matrigel 기판을 중단하지 않고 중앙 구유 주변의 neurospheres을 전파하지 않고 챔버.
- 중앙 골짜기에 EFH-SFM 또는 FBS-SFM의 추가 150-200 μl를 추가합니다.
- 37 ° C, 5 % CO 2, 17-20 시간 100 % humidified 인큐베이터에 galvanotaxis 챔버를 전송 (있는 경우 undifferentiated NPCs를 분석) 그림 1과 같이 neurospheres이 Matrigel 기판에 준수 및 단일 세포로 해리 할 수 있도록 . 차별화 된 NPCs를 분석하면, 잠복기는 세포의 분화를 허용하도록 69-72 시간까지 연장해야합니다.
3. 셀 시간 경과 영상 라이브
- 라이브 셀 이미징 시스템은 37 평형 할 수 있도록 허용 ° C, 5 % 전에 시간 경과 기록의 개시 30 분 최소 CO 2.
- 한쪽 끝에서 1mm 직경 실버 와이어, 코일 두 12cm의 조각을 잘라, 그리고 Clorox B에 배치여과기는 20 분 동안 자세 / AgCl 전극을 형성한다.
- 계산 현미경의 무대에 galvanotaxis 챔버를 전송하고 다음 기준에 따라 라이브 셀 이미징 마이그레이션 분석에 사용 될 챔버 선택 전) neurospheres는 세포가 가지고해야합니다) 단일 셀 및 II에 거의 dissociated해야 작은 - 투 - 노 프로세스와 원형 morphologies은 세포 기관에서 확장됩니다.
- 별도의 정사각형 번호와 함께 층류 후드에 선택한 galvanotaxis 챔버를 전송합니다. 한 유리 커버 슬립 및 진공 그리스.
- 커버가 autoclaved 물 다음, 70 % 에탄올 처음에 빠져 있으며, 커버 슬립의 두 평행 가장자리에 진공 그리스의 스트립을 적용 씻으십시오.
- , 챔버의 중앙 구유에서 문화 미디어를 대기음 후 신속하게 두 개의 평행 한 직사각형 유리 스트립에있는 그리스 스트립의 나머지는, 효율적으로 지붕을 만들어 있도록 챔버에 커버 슬립 (그리스 측 아래로 향해)를 배치챔버합니다.
- 모세관 작용을 통해 중앙 구유에 신선한 EFH-SFM 또는 FBS-SFM의 피펫 100 μl.
- 그림 2에 도시 된 바와 같이, 중앙 트로프의 각 끝에 문화 미디어 풀을 위해 국경을 만드는 진공 그리스를 사용하십시오.
- PVC 관의 두 15cm의 조각을 잘라, 그리고주의 깊게 더 거품이 튜브에서 형성되지 보장 튜브에 아가로 오스 솔루션을 주입하는 18 게이지 바늘로 10 CC의 주사기를 사용하고, 젤 5 분 동안 더욱 강화 할 수 있습니다.
- 아가로 오스 겔 튜브, 자세 / AgCl 전극, 문화 미디어 저수지로 사용됩니다 비어있는 60mm 배양 접시 한 쌍의와 함께 라이브 셀 이미징 시스템에 galvanotaxis 챔버를 전송하고 자세 / AgCl 전극을 포함합니다. galvanotaxis 챔버는 37에서 휴식을 할 수 있도록 허용 ° C, 20-30 분에 대한 5 % CO 2 환경입니다.
- 이 기간 동안 시추 구멍으로 2 빈 배양 접시의 뚜껑과 galvanotaxis 챔버의 페트리 접시의 뚜껑을 준비그 그림 3과 같이 드레 멜 또는 이와 유사한 도구로.
- 피펫 각 빈 페트리 접시에 중앙 구유의 양쪽 위에 EFH-SFM 또는 FBS-SFM의 1-1.5 ML, 그리고 SFM 7-8 ML. 각 요리에 galvanotaxis 챔버의 중앙 트로프와 놓으 자세 / AgCl 전극의 각면에 놓으 페트리 접시. 그림 4에 도시 된 아가로 오스 겔 다리로 전기 연속성을 확립 할 수있는 galvanotaxis 챔버와 배양 접시 사이에 다리 격차.
- 전기 전류를 측정 할 수 일련의 전류계로, 외부 전원 공급 장치에 자세 / AgCl 전극을 연결하고 전원 공급 장치를 켜십시오. 직접 중앙 구유에서 전기장의 강도를 측정하는 전압계를 사용하여 원하는 전기장 강도가 (이 실험실에서 수행 assays와 함께 250 뮤직 비디오 / mm의 dcEF 강도를 활용 달성 될 때까지 전원 공급 장치의 출력을 조정 1 1.5 mA 사이의 전류).
- Initia테는 시간 경과에 라이브 셀 이미징 시스템 모듈 및 실험 시간을 원하는 금액 실행 할 수 있습니다. 분석이 완료되면, 표준 immunostaining 분석을위한 4 % paraformaldehyde에서 셀을 수정합니다.
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Representative Results
동 분석은 250 MV / mm dcEF의 존재에 undifferentiated NPCs는 음극 대한 높은 이동 및 빠른 galvanotaxis (그림 5A, 영화 1) 전시 것을 보여줍니다. dcEF의 부재에서 세포의 무작위 운동 (그림 5B, 영화 2) 관찰된다. 이 필드 강도에서 undifferentiated NPCs의> 98 %가 그들이 이미징하는 동안 전체 6-8 시간에 대한 마이그레이션, 죽은 세포가 마이그레이션되지 않기 때문에이 사람들이 dcEF의 부재 또는 존재하는이 기간 동안 가능한 상태로 유지하는 것이 좋습니다.
차별화 된 phenotypes는 존재와 dcEF의 부재 (영화 3, 4)에 모두 무시할 마이그레이션을 받고있다. 차별화 된 세포의 일부는 dcEF의 방향에 수직 정렬하는 경향이 프로세스를 확장 있지만, 눈에 띄는 전지 본체의 translocation을 준수하지 않습니다.
Immunostaining는 NPCs 긍정적 인 expressio을 유지하는지 확인N dcEF 노출 (그림 6A) 6 시간 후 신경 전구체 마커 nestin의. 성숙한 phenotypes에 차별화하도록 유도 NPCs을 포함한 assays에서 세포의 대부분은 dcEF 노출 (그림 6B) 6 시간 후 성숙 astrocyte 마커 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)을 표현한다.
다음과 같이 이러한 분석에 사용되는 기본 항체였다 : 마우스 단클론 항 nestin (1:400, Millipore, 캐나다), 그리고 토끼 polyclonal 방지 GFAP (1:500, 시그마, 캐나다). 다음과 같이 이러한 분석에 사용되는 보조 항체가되었습니다 Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, 캐나다)와 염소 - 안티 - 마우스 복합, 그리고 (1:400, Invitrogen-Gibco Alexafluor 488과 염소 - 안티 - 토끼 복합 , 캐나다).
그림 1. Neurospheres은 Matrigel 기판 및 dissoci을 준수37 ° C / 5% CO 2, EFH-SFM의 100 % 습도에서 부화 17 시간에 따라 하나의 세포로 먹었다.
그림 2. galvanotaxis 챔버의 그림. 진공 기름의 스트립은 중앙 구유의 양쪽에 문화 미디어 풀을 만드는 데 사용됩니다.
그림 3. 뚜껑 galvanotaxis 챔버와 문화 매체 저수지에 뚫고 들어가되어야 구멍 도식. 모두 뚜껑에있는 7mm 직경 구멍은 아가로 오스 겔 튜브를 삽입하는 데 사용됩니다. galvanotaxis 챔버의 뚜껑에있는 4mm 직경의 구멍은 전압계를 사용하여 직접 중앙 구유에 걸쳐 전위를 측정하는 데 사용됩니다. 문화 매체 재의 뚜껑에있는 4mm 직경 구멍servoir는 자세 / AgCl 전극 전원 공급 장치에 연결하기위한 접시의 뚜껑으로부터 돌출 할 수 있도록하는 것입니다.
그림 4. 시간 경과 영상에 대한 galvanotaxis 챔버 어셈블리의 그림. galvanotaxis 챔버 세포를 도금되는 중앙 페트리 접시입니다. 중앙 페트리 접시 주택 내부의 미디어 galvanotaxis 챔버 SFM + EFH 또는 SFM 중 하나입니다 + 1퍼센트 FBS. galvanotaxis 챔버의 양쪽에있는 페트리 요리는 SFM로 가득하고, 또한 자세 / AgCl 전극을 포함하고 있습니다. 이 전극은 외부 전원 공급 장치에 연결하고, 아가로 오스 - 젤 다리와 세 개의 배양 접시를 연결하면 전체 회로를 형성한다. 아르
그림 5. presen에서dcEF의 부재에서 세포가 임의의 반경 마이그레이션 (B)를 받아야 반면 dcEF undifferentiated NPCs의 CE는 음극 (A)를 향해 빠른 galvanotactic 마이그레이션을 받고있다.
그림 6. Immunostaining는 NPCs는 dcEF 노출 (A) 6 시간 이후에 nestin 양성 undifferentiated 전구체를 유지하고, 대부분 차별화하도록 유도 그 NPCs는 dcEF 노출 (B) 6 시간 후 성숙 astrocyte 아이콘 GFAP을 표현 확인합니다.
dcEF에 노출 undifferentiated NPCs의 동영상 1. 시간 경과 동영상입니다. NPCs는 SFM + EFH 17 시간에 galvanotaxis 챔버에 도금 한 다음, 음극쪽으로 250 뮤직 비디오 / mm dcEF 전시 신속하고 감독 마이그레이션에 노출. 동영상 1 번째는 = 15 분 실시간이 있습니다. MO를 보려면 여기를 클릭하십시오우열이 없다.
dcEF의 부재에 undifferentiated NPCs의 동영상 2. 시간 경과 동영상입니다. NPCs는 SFM + EFH 17 시간에 galvanotaxis 방에 도금 한 후 응용 dcEF의 부재에서 이미징은 무작위로 마이그레이션을 받고있다. 동영상 1 번째는 = 15 분 실시간이 있습니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
dcEF에 노출 차별화 된 NPCs의 동영상 3. 시간 경과 동영상입니다. NPCs는 SFM + FBS에서 69-72 시간에 대한 galvanotaxis 챔버에 도금 한 후 원하는 방향으로 250 뮤직 비디오 / mm dcEF 전시 거의 마이그레이션에 노출. 동영상 1 번째는 = 15 분 실시간이 있습니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
dcEF에 없으면, 차별화 된 NPCs의 동영상 4. 시간 경과 동영상입니다. galvanotaxis 차에 도금 NPCs그리고 SFM + FBS에서 69-72 시간에 대한 mbers, 그리고 응용 dcEF의 부재에서 이미징은 dcEF에 노출되어 차별화 된 NPCs와 유사한 어떤 방향에서 거의 마이그레이션을 나타냅니다. 동영상 1 번째는 = 15 분 실시간이 있습니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
이 프로토콜은 이전 연구 7-9의 잘 알려진 방법에서 적응되었습니다. Galvanotactic 챔버는 세포 시딩의 구속, 또는 중앙 트로프 10,11의 microfabrication에 대한 CO 2 레이저 절제를 사용하는 잘 별도의 유리의 건설 등 다양한 기법, 다양한을 사용하여 구성 할 수 있습니다. 일부 기술은 다른 것보다 더 힘든거나 비용이 많이 드는 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 대부분의 세포 생물학 실험실에있는 재료를 사용하여 NPC galvanotaxis 챔버를 만들기위한 간단하고 비용 효율적인 분석을 설명하고 있습니다. 우리 프로토콜은 지속적으로 장기 이미징을위한 최적의 조건에서 세포를 유지하는 라이브 세포 이미징 시스템을 둘러싸는 온수, humidified, CO 2 규제 보육이 포함되어 있습니다. 이러한 장치의 부족은 일부 이전에 다음 ID로 출판 기술 9,12의 제한 사항입니다.
다른 그룹의 최근 작품은 유사한 galva을 보여다른 프로토콜과보다 노동 집약적 인 galvanotaxis 챔버 디자인을 사용하여 hippocampal 세포 13 호선 세포 notactic 행동. undifferentiated neurosphere 파생 NPCs의 주요 세포 문화 - - 우리의 분석은 세포의 동일한 시작 인구의 분석이 이루어질 수 있다는 점에서 특히 우아함으로써 undifferentiated와 차별화 된 세포 모두의 철새 속성의 비교를 허용 별개의 조건에 노출 된 그, 단순히 galvanotaxis 챔버 내의 문화 미디어를 보완하는 데 사용되는 요소를 수정하여.
이 프로토콜에서 제공 검정은 galvanotactic 마이그레이션 14,15를 받아야 장기 추적 및 분석 NPC의 galvanotaxis의, 및 기타 세포 유형에 대한 강력한 도구입니다. 모든 프로토콜과 마찬가지로,이 프로토콜의 특정 단계의 준비 및 실행의 뉘앙스가 실패 결과를 유도 할 수 있습니다. 다음 지침과 제안은해야이 프로토콜의 성공적인 실행 sist :
- 전기 전류 관련 열 죽음에 진행에서 세포를 방지하기 위해 galvanotaxis 챔버의 크기는 줄 가열 (16)의 영향을 최소화하기 위해 계산되었습니다. 챔버에서 생성 된 열은 galvanotaxis 챔버의 단면 지역에 비례 설정으로 들어를 통해 흐르는 전류의 제곱에 비례합니다. 우리는 2.04 mm 2 (12mm X 0.17 mm)로 챔버의 단면 영역을 유지하시기 바랍니다.
- 문화 neurospheres 7 일이 하나의 세포로, dissociated 수집 및 보조 neurospheres를 얻을 수 있도록 (프로세스가 'passaging'로 칭함) 성장 인자 조건에서 replated 할 수 있습니다 후. 우리는 큰 numbe를 passaged 된 그 neurospheres를 사용하는 경우 최선의 노력 결과 철새 기능에 눈에 띄는 감소와 함께, (최대 문화 21 일)가 세 개 미만 통로를받은 neurospheres을 사용하여 얻을시대의 연구. 이 장기적인 문화가 세포 동력학 17을 변경하는 시연 이전 작업과 일치합니다.
- 관찰을위한 NPCs를 포함하는 galvanotaxis 챔버를 선택하면 neurosphere 파생 된 세포가 정확한 동적 해석을 허용하기 위해 잘 dissociated 가지고있는 챔버를 선택하는 것이 중요합니다. neurospheres 잘 dissociated하지 않은 경우 (NPCs는 서로 준수하고 구분 될 수 없습니다), 개별 셀 철새 행동의 분석은 불가능 근처가됩니다. 문화는 사전 관찰을 해리하는 데 더 많은 시간이 허용되어야합니다. 또한, 서로 가까이에있는 세포가 물리적으로 이웃 세포의 마이그레이션하는 데 방해가 될 수 있습니다. 우리 분석은 거리에 자신의 가장 가까운 이웃 셀에서 하나 이상의 셀 몸을 위치 세포가 같은 끔찍한과이라도 dissociated neurosphere의 중심 근처에 모여있는 세포보다 훨씬 더 큰 속도로 마이그레이션하는 것으로 나타났습니다ctedness.
- NPCs에서 연장 프로세스의 풍부가있는 경우,이 세포가 차별화하기 시작했으며 따라서는 undifferentiated 인구의 진정한 표현하지 않다고 지표입니다. 세중의에 galvanotaxis 챔버를 준비의 이점은 시간 경과 영상에 선택되지 않은 나머지 2 챔버 그들의 incubated 도금 시대 (단계 2.16)에 따라 즉시 해결하고, 세포의 분화 프로필을 확인하는 immunostained 할 수 있다는 것입니다.
- 최적의 결과를 얻으 문화 미디어는 갓이 필요합니다 각 날에 준비 보충해야합니다.
- 시간 경과 이미지 및 이후의 동적 분석은 표본의 섭동에 매우 민감합니다. 라이브 셀 이미징 현미경은 진동을 최소화하기 위해 공기 테이블에 배치해야하고, 시스템은 실험 기간 동안 어리둥절하지 말아야합니다.
우리 연구실 정기적으로 이미지 NPC galvanot6-8 시간을위한 축, 최대 15 시간 분석을 수행되었습니다 있지만. 15 시간 기간 동안 챔버에서 dcEF는 MV / mm 250에서 227 뮤직 비디오 / mm (9.2 % 감소)로 감소했다. 긴 영상 기간은 필연적으로 더 전기 필드를 수정 챔버의 미디어의 pH를 수정합니다. 따라서 그것은 미디어에 따르면 매 6 시간을 대체하는 것이 좋습니다. 그러나, 우리는 미디어 교체없이 8 시간 NPC galvanotaxis의 assays를 수행 한하고 눈에 띄는 세포 사망 (죽은 세포 마이그레이션하지 않습니다) 또는 세포 운동성의 감소를 관찰하지 않은, 세포는 실험을하는 동안 마이그레이션의 속도를 유지하고 있습니다. 조사자는 또한 dcEF (10)의 안정성을 높이기 위해 챔버의 깊이를 줄일 수 있습니다.
이미징 따라, 단일 셀 동적 추적 분석 Zeiss Axiovision 소프트웨어의 추적 모듈을 사용하여 이미징 세포의 하위 집합에 수행됩니다. 그들이 가까이의 가장자리에 지역화하는 경우 셀은 분석을 위해 선택됩니다dissociated neurosphere와 떨어져 가장 가까운 셀에서 하나 이상의 전지 본체. 이 뒤의 근거는 불가능 근처에 개별 셀을 추적 할 수 있도록 그래서, 추적하는 동안 서로 겹치는 셀의 가능성을 최소화하는 것입니다. 우리는 마이그레이션의 다음 네 가지 매개 변수를 분석 :
- X-축 변위 - 셀 dcEF의 방향에 평행 축, 방향으로 마이그레이션 거리에 있습니다.
- 속도 - 경과 시간으로 나눈 초기 및 최종 셀 위치 사이의 직선 라인 거리에 있습니다.
- Directedness - 초기 및 최종 셀 위치 사이의 직선 라인 거리로 나눈 X 축 변위.
- 꼬부라 짐은 - 전체 경로 거리가 초기 및 최종 셀 위치 사이의 직선 라인 거리로 나눈 값 셀에 의해 여행.
후자의 두 가지 매개 변수는 마이그레이션 경로가 특정 방향으로 얼마나 직선의 지표입니다.
18시 중앙 구유에서 신선한 문화 미디어의 지속적인 상호 재관류을 허용하도록 galvanotaxis 챔버를 수정했습니다. 적절한 기판과 문화 미디어가 다른 세포 유형 선택해야하고, 이전 영상에 셀을 심는 기간은 필요에 따라 조정해야합니다. 특히, 챔버의 크기는 조직 (예를 들어, 조직 슬라이스가 챔버에 배치되어있는 경우) 검토되는 두께에 따라 수정해야 할 수 있습니다. 수사관이 마음 THA에서 부담합니다세트 전기 필드에 대한 t, 챔버를 통해 현재의 흐름 챔버의 단면 지역에 직접 비례하며, 챔버의 크기에 따라서 상당한 enlargements 증가 쥴 난방 관련 세포 사망을 초래할 수 있습니다.
이 보고서에 설명 된 기술은 galvanotaxis의 현상, 중요한 사건을 조사하기위한 강력한 도구를 제공하지만, 광범위하게 연구 없습니다. dcEFs에 대응하는 세포의 능력은 직접 치료 의미가 있습니다. 전기 자극 (깊은 뇌 자극)은 이미 파킨슨 병의 치료에 도움이 입증되었습니다, 그리고 마우스 모델 19,20에 hippocampal neurogenesis을 홍보하기 위해 표시되었습니다. 세포 운동성에 dcEF의 전달을 담당하는 세포 메커니즘의 전체 이해는 결국 부상 disea의 사이트를 향상하고 내생 전구체 마이그레이션 감독에 대한 임상 수단으로 전기 자극의 사용으로 이어질 수 있습니다SE는 복구 프로세스를 용이하게합니다. 방법은 이러한 프로세스를 조사 간단하고 강력한 방법을 제공합니다 위 설명했다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (보조금 # 249669, 그리고 # 482986)와 심장과 캐나다의 행정 재단 (보조금 # 485508)으로 운용되고 있습니다. 저자는 실험 프로토콜을 개발에서의 도움을 요 세프 엘 하이에크 박사 치 완 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
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References
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