Summary
I denne protokollen viser vi hvordan du kan lage tilpassede kammer som tillater bruk av en likestrøm elektrisk felt for å aktivere time-lapse avbildning av voksen hjerne avledet nevrale forløper celle translokasjon under galvanotaxis.
Abstract
Oppdagelsen av nevrale stilk og progenitor celler (betegnet med samlebetegnelsen neural forløper celler) (NPC) i den voksne hjernen hos pattedyr har ført til en kropp av forskning rettet mot å utnytte de multipotent og proliferativ egenskapene til disse cellene for utvikling av neuroregenerative strategier. En kritisk steg for å lykkes med slike strategier er mobilisering av NPCer mot en lesjon nettstedet etter eksogene transplantasjon eller for å forbedre responsen til de endogene forløperne som er funnet i den periventrikulær regionen i CNS. Følgelig er det viktig å forstå hvilke mekanismer som fremmer, veilede og forbedre NPC migrasjon. Vårt arbeid fokuserer på utnyttelse av likestrøm elektriske felt (dcEFs) for å fremme og direkte NPC migrasjon - et fenomen kjent som galvanotaxis. Endogene fysiologiske elektriske felt fungere som kritiske signaler for celle migrasjon under normal utvikling og såret reparasjon. Farmakologisk forstyrrelse avtrans-nevralrøret potensial i Axolotl embryoer forårsaker alvorlige utviklingsforstyrrelser misdannelser en. I sammenheng med sårtilheling, er frekvensen av reparasjon av sårede hornhinnen direkte korrelert med størrelsen av epiteliale såret potensialet som oppstår etter skaden, som vist ved farmakologisk forsterkning eller avbrudd av denne DCEF 2-3. Vi har vist at voksne subependymal NPCer gjennomgå rask og regissert katodisk migrasjon in vitro når de utsettes for en eksternt påført DCEF. I denne protokollen beskriver vi vår lab teknikker for å skape en enkel og effektiv galvanotaxis analysen for høy oppløsning, langsiktige observasjon av rettet cellen kroppen translokasjon (migrasjon) på en encellet nivå. Denne analysen vil være egnet for å undersøke mekanismer som regulerer DCEF transduksjon i cellulært motilitet gjennom bruk av transgene eller knockout mus, korte interfererende RNA, eller bestemte reseptor agonister / antagonister.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr håndtering ble godkjent av Universitetet i Toronto Animal Care komiteen i samsvar med institusjonelle retningslinjer (protokoll nr. 20009387). Følgende metoder bør utføres ved hjelp av sterile verktøy og teknikker, i en laminær hette der det er aktuelt.
I protokollen teksten nedenfor, refererer uttrykket "EFH-SFM" til serumfritt medier supplert med epidermal vekstfaktor, grunnleggende fibroblast vekstfaktor og heparin. EFH-SFM brukes når etterforsker galvanotaxis av udifferensierte NPCer fordi disse mitogens opprettholde NPCer i sin udifferensiert tilstand 4. Når undersøke galvanotaxis NPCer induserte til å differensiere til modne celletyper, "FBS-SFM" angir serumfritt medier supplert med 1% føtalt bovint serum. FBS fremmer differensiering av NPCer til modne nevrale fenotyper 5.
1. Isolasjon og kultur av Neural Forstadier (Ikkevist i videoen)
- Anaesthetize en CD1 mus (6-8 uker gammel) med isofluorane og offer via cervical forvridning.
- Douse hodet i 70% etanol og halshogge dyret med skarpe disseksjon saks.
- Mens du holder hodet med kirurgiske pinsett, fjerner huden på framsiden for å avsløre skallen.
- Ved hjelp av en skalpell og nei. 11 blad, scorer skallen på frontal sinus langs mediolateral aksen, og også langs sagittal sutur i rostrocaudal retning.
- Skrell parietal bein bort fra hodet med no. 7 buede tang, tar seg ikke å pierce hjernevevet.
- Sett en tynn stekespade under hjernen fra under lillehjernen og fremme mot olfactory pærer. Mens du holder skallen på plass med tang, dra forsiktig i hjernen fra skallen og umiddelbart plassere den i iskaldt kunstig cerebrospinalvæsken (se oppskrifter under).
- Under en disseksjon mikroskop, med steriledisseksjon saks og tang kutte hjernen i to langs midtlinjen. Roter hver halvkule, slik at den mediale (cut) overflate vender oppover.
- Velg en halvkule, og med den mediale overflaten vendt oppover, finn splenium av corpus callosum (posterior regionen i corpus callosum).
- Gjøre et snitt fra overflaten av hjernebarken til splenium av corpus callosum langs dorsoventral aksen.
- Skrell radert cortex mot luktelappen å avsløre de mediale og laterale veggene i lateral ventrikkel.
- Roter halvkule, slik at framsiden vender oppover, og bruke buede microscissors å kutte ut og samle utsatte mediale og laterale veggene, som inneholder periventrikulær regionen hvor NPCer bor seks.
- Gjenta trinn 01.08 til 01.11 for den andre halvkule.
- Pipetter isolerte vevet inn 7 ml trypsin-løsning (se oppskrift nedenfor) i en 15 cc rør, og plasser røret på en rocker i en 37 ° Cinkubator i 25 min.
- Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min, aspirer supernatanten og resuspender vevet i 2 ml trypsin inhibitor oppløsning (se oppskrift nedenfor).
- Forsiktig triturate vevet med en liten borehull Pasteur pipette 30-50 ganger nøye for å unngå luftbobler.
- Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min, aspirer supernatanten og resuspender på 1-2 ml SFM (se oppskrift nedenfor) ved triturating pelleten 3-5 ganger.
- Sentrifuger røret ved 1500 opm i 3 min, aspirer supernatanten og resuspender i 1 ml SFM + EFH.
- Tell leve celletetthet med en haemocytometer og plate cellene i en T25 kultur kolbe ved en densitet på 10 celler pr ul i SFM + EFH.
- Tillate kulturen å vokse for 7 dager uforstyrret å gi frittflytende primære neurospheres bestående av NPCer.
2. Galvanotaxis Chamber Forberedelse
- Plasser tre kvadrat glass no. 1 dekkglass (22 x 22 x 0,17 mm) ina flaske 6N saltsyre over natten.
- Neste dag, bruker en diamant-tip glass-cutter for å kutte seks rektangulære strimler (22 x 5 x 0,17 mm) av glass fra torget no. 1 dekkglass.
- Overfør syre-vasket firkantede slips og rektangulære slips i en laminær hette. Vask rektangulære og kvadratiske strimler første med 70% etanol, deretter med vev kultur-grade autoklaverte vann, og la det tørke på et Kim Tørk (for ekstra sterilitet, kan glasset få lov til å lufttørke).
- Påfør vakuum fett til omkretsen av en overflate av de firkantede glassplater, og forsegle dem til bunnen av 60 mm plast petriskåler.
- Påfør vakuum smørefett langs den lange aksen av en overflate av de rektangulære glasslistene og forsegle dem til motsatte kanter av de firkantede glassplater (slik at de er parallelle med hverandre) for å etablere en sentral renne.
- UV-sterilisere kamrene for minst 15 minutter i det laminære strømningshette.
- Pipetter 250-300 ul poly-L-lysiNE på den sentrale trau av kamrene og inkuber ved romtemperatur i 2 timer.
- Omtrent 15 min før slutten av inkubasjonstiden, forberede Matrigel løsningen (se oppskrift nedenfor).
- Aspirer poly-L-lysin, vask de sentrale trau med 1 ml autoklavert vann og pipetter 250-300 ul Matrigel løsning inn mot de sentrale trau.
- Inkuber kamrene ved 37 ° C i 1 time.
- Aspirer Matrigel løsning og forsiktig vaske de sentrale trau med 1-2 ml SFM.
- Pipetter 100 ul EFH-SFM eller FBS-SFM inn mot de sentrale troughs og overføre galvanotaxis kamre på scenen av en telling mikroskop.
- Pipetter 3-4 ml av neurosphere-holdige kultur inn en 60 mm petriskål og overføre petriskål til scenen av telling mikroskop.
- På en visning mål på 5x, bruk en P10 pipette til å overføre 5-8 hele neurospheres (opptil fire på en gang) på den sentrale trau hver galvanotaxiskammer uten dissociating dem, og nøye spre neurospheres rundt den sentrale trau uten å forstyrre Matrigel substratet.
- Legge til en ekstra 150-200 ul EFH-SFM eller FBS-SFM inn mot de sentrale trau.
- Overfør galvanotaxis kamre i en 37 ° C, 5% CO 2, 100% fuktet inkubator i 17-20 timer (hvis analysere udifferensierte NPC) for å tillate neurospheres å overholde de Matrigel underlaget og dissosierer til enkle celler som vist i Figur 1 . Hvis analyse differensierte NPCer bør inkubasjonstiden forlenges til 69-72 hr å tillate differensiering av cellene.
3. Lever Cell Time-Lapse Imaging
- Tillat den levende celle bildesystem ekvilibrere ved 37 ° C, 5% CO 2 i minst 30 min før initiering av tiden intervallopptak.
- Klipp to 12 cm biter av 1 mm diameter sølv wire, coil dem fra den ene enden, og plassere dem i Clorox bleach i 20 min for å danne Ag / AgCl-elektroder.
- Overfør galvanotaxis kamre på scenen av en telling mikroskop og velg hvilket kammer vil bli brukt til live-cell imaging migrasjon analyse basert på følgende kriterier: i) neurospheres skal være nesten helt dissosiert i enkeltceller og ii) at cellene bør ha runde morfologi med lite til ingen prosesser som strekker seg fra cellen organer.
- Overføre den valgte galvanotaxis kammeret inn i en laminær strømningshette, sammen med en separat firkantet nei. 1 glass dekkglass og vakuum fett.
- Vask dekkglass først med 70% etanol, deretter med autoklaverte vann, og bruke en stripe av vakuum fett på to parallelle kanter av dekkglass.
- Aspirer dyrkningsmedium fra den sentrale trau av kammeret, deretter raskt plasser dekkglass (grease-siden ned) på kammeret slik at fettet strimler hviler på de to parallelle rektangulære glasslistene, effektivt skape et taktil kammeret.
- Pipetter 100 ul frisk EFH-SFM eller FBS-SFM inn i det sentrale trau via kapillarvirkning.
- Bruk vakuum grease opprette grensene for bassenger av dyrkningsmedier på hver ende av den sentrale renne, som vist i figur 2.
- Klipp to 15 cm biter av PVC rør, og bruke en 10 cc sprøyte med en 18 gauge nål til å nøye injisere agarose løsning inn i røret, slik ingen bobler dannes i rørene, og la geleen stivne i 5 min.
- Overfør galvanotaxis kammeret til den levende celle imaging system, sammen med agarosegel rør, Ag / AgCl elektroder, og et par tomme 60 mm petriskåler som skal brukes som kultur medier reservoarer og vil inneholde Ag / AgCl-elektroder. Tillate galvanotaxis kammeret å hvile i den 37 ° C, 5% CO 2 miljø for 20-30 min.
- I løpet av denne tiden, forberede lokkene på de to tomme petriskåler og lokket av galvanotaxis kammeret er petriskål ved å bore hullinn i dem med en Dremel eller lignende verktøy, som vist i figur 3..
- Pipetter 1 til 1,5 ml EFH-SFM eller FBS-SFM på enten side av den sentrale renne, og 7-8 ml SFM i hver tom petriskål. Plass en petriskål på hver side av kammeret galvanotaxis sentrale renne og sted en Ag / AgCl elektrode i hver skål. Bro over gapet mellom galvanotaxis kammer og petriskåler å etablere elektrisk kontinuitet med agarosegel broer, som vist i Figur 4.
- Koble Ag / AgCl elektroder til en ekstern strømforsyning, med et amperemeter i serie for å måle elektrisk strøm, og slå på strømmen. Bruk et voltmeter for å måle styrken av det elektriske felt direkte over sentrale trau, og justere styrken strømforsyningen til ønsket elektrisk feltstyrke oppnås (analysene utført i dette laboratoriet benytte en DCEF styrke på 250 mV / mm med elektrisk strøm mellom 1 og 1,5 mA).
- Initiativte tid-lapse-modulen på levende celle imaging system, og la eksperimentet til å kjøre for ønsket tidsrom. Etter fullførelse av forsøket fikser cellene i 4% paraformaldehyd for standard farging analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinematisk analyse viser at i nærvær av en 250 mV / mm DCEF, udifferensierte NPCer oppviser sterkt rettet og raske galvanotaxis mot katoden (figur 5A, Film 1). I fravær av en DCEF, er tilfeldig bevegelse av cellene observert (figur 5B, Film 2). På dette feltstyrke,> 98% av udifferensierte NPCer migrerer for hele 6-8 hr som de er avbildet, og siden døde celler ikke migrere dette tyder på at de forblir levedyktig i denne perioden i fravær eller nærvær av en DCEF.
Differensiert fenotyper gjennomgå ubetydelig migrasjon både i nærvær og fravær av en DCEF (3 Filmer og 4). Undergrupper av differensierte celler utvide prosesser som har en tendens til å justere vinkelrett til retningen av DCEF, men ingen merkbar cellelegemét translokasjon observeres.
Farging bekrefter at NPCer opprettholde positive expression av det nevrale forløper markør nestin etter 6 hr av DCEF eksponering (figur 6A). I analysene som involverer NPCer indusert til å differensiere i modne fenotyper, de fleste av cellene uttrykker modne astrocyte markør glial fibrillary surt protein (GFAP) etter 6 timers for DCEF eksponering (figur 6B).
De primære antistoffer som brukes i disse analysene var som følger: mus monoklonalt anti-nestin (1:400, Millipore, Canada), og kanin polyklonale anti-GFAP (1:500, Sigma, Canada). De sekundære antistoffer som brukes i disse analysene var som følger: geit-anti-mus konjugert med Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Canada), og geite-anti-kanin konjugert med Alexafluor 488 (1:400, Invitrogen-Gibco , Canada).
Figur 1. Neurospheres holder seg til den Matrigel underlaget og dissocispiste inn enkeltceller følgende 17 hr av inkubering ved 37 ° C / 5% CO 2, 100% fuktighet i EFH-SFM.
Figur 2. Illustrasjon av galvanotaxis kammer. Strimler av vakuum smørefett benyttes til å opprette en pool av dyrkningsmedier på hver side av den sentrale renne.
Figur 3. Skjematisk av hull som skal bores inn i lokkene i galvanotaxis kammeret og dyrkningsmedium reservoarene. På 7 mm diameter hull i begge lokk er brukt til å sette inn agarosegel rør. De 4 mm diameter hull i lokket på galvanotaxis kammeret brukes til å måle den elektriske potensial direkte over sentrale trau ved hjelp av en voltmeter. 4 mm diameter hull i lokket på kulturmediet reservoir er å tillate Ag / AgCl elektrode å stikke ut fra lokket på tallerken for tilkobling til strømforsyningen.
Figur 4. Illustrasjon av galvanotaxis kammer montering for time-lapse imaging. Den galvanotaxis kammeret er den sentrale petriskål, hvor cellene er belagt. Materiale inne i sentrale Petriskål bolig galvanotaxis kammeret er enten SFM + EFH eller SFM + 1% FBS. De petriskåler på hver side av galvanotaxis kammeret er fylt med SFM, og også inneholde Ag / AgCl-elektroder. Disse elektrodene er forbundet med en ekstern strømforsyning, og bygge bro over tre petriskåler med agarose-gel broer danner en komplett krets.
Figur 5. I presentasjonce av en DCEF udifferensierte NPCer gjennomgår rask galvanotactic migrasjon mot katoden (A), mens det i fravær av en DCEF cellene gjennomgå tilfeldige radial migrasjon (B).
Figur 6. Farging bekrefter at NPCer forbli nestin-positive udifferensierte forløpere etter 6 timers for DCEF eksponering (A), og at NPCer overtalt til å skille det meste uttrykke modne astrocyte markør GFAP etter 6 timers for DCEF eksponering (B).
Movie 1. Time-lapse video av udifferensierte NPCer utsatt for en DCEF. NPCer platet ut galvanotaxis kamre for 17 hr i SFM + EFH, og deretter eksponert for en 250 mV / mm DCEF utstillingen rask og rettet migrasjon mot katoden. 1 sekund med video = 15 minutter sanntid. Klikk her for å se movie.
Movie 2. Time-lapse video av udifferensierte NPCer i fravær av en DCEF. NPCer platet ut galvanotaxis kamre for 17 hr i SFM + EFH og deretter avbildes i fravær av et anvendt DCEF gjennomgå tilfeldig migrasjon. 1 sekund med video = 15 minutter sanntid. Klikk her for å se filmen .
Movie 3. Time-lapse video av differensierte NPCer utsatt for en DCEF. NPCer platet ut galvanotaxis kamre for 69-72 hr i SFM + FBS, og deretter eksponert for en 250 mV / mm DCEF utstillingen svært lite migrasjon i hvilken som helst retning. 1 sekund med video = 15 minutter sanntid. Klikk her for å se filmen .
Movie 4. Time-lapse video av differensierte NPCer i fravær til en DCEF. NPCer belagt på galvanotaxis chambers for 69-72 hr i SFM + FBS, og deretter avbildes i fravær av et anvendt DCEF oppviser svært lite migrasjon i alle retninger, på samme måte til differensiert NPC som er utsatt for en DCEF. 1 sekund med video = 15 minutter sanntid. Klikk her for å se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen har blitt tilpasset fra de veletablerte metoder for tidligere studier 7-9. Galvanotactic kamre kan konstrueres ved hjelp av en rekke forskjellige teknikker, herunder konstruksjonen av en separat glass godt for innesperring av celle såing, eller ved hjelp av CO 2 laser ablasjon for microfabrication av den sentrale renne 10,11. Noen teknikker kan være mer arbeidskrevende eller kostbare enn andre. Vi har beskrevet en enkel og kostnadseffektiv analyse for å konstruere en NPC galvanotaxis kammer ved hjelp av materialer som vanligvis finnes i de fleste cellebiologiske laboratorier. Vår protokoll inkluderer et oppvarmet fuktet, CO 2 regulert inkubator som omgir levende celle imaging system for å opprettholde cellene under optimale forhold for kontinuerlig langsiktig bildebehandling. Mangelen av en slik anordning er en begrensning av noen tidligere publiserte teknikker 9,12.
Nyere arbeid av en annen gruppe viste lignende galvanotactic oppførsel av celler fra en hippocampus cellelinje 13, bruker en annen protokoll og en mer arbeidskrevende galvanotaxis kammer design. Vår analysen er spesielt elegant ved at det tillater en analyse av den identiske start cellepopulasjoner - primære cellekulturer fra udifferensierte neurosphere avledet NPCer - som har blitt eksponert for forskjellige forhold og dermed tillater en sammenligning av trekkende egenskaper av både udifferensierte og differensierte celler, ganske enkelt ved å modifisere faktorene som brukes til å supplere kulturmediene innenfor galvanotaxis kammeret.
Analysen som presenteres i denne protokollen er et kraftig verktøy for langsiktig sporing og analyse av NPC galvanotaxis, og muligens andre celletyper som gjennomgår galvanotactic migrasjon 14,15. Som med enhver protokoll, kan nyanser i forberedelse og gjennomføring av visse tiltak i denne protokollen føre til mislykkede resultater. Følgende retningslinjer og forslag bør somSIST i en vellykket gjennomføring av denne protokollen:
- For å hindre at cellene fra gjennomgår elektrisk strøm-assosiert varme døde har de dimensjoner av galvanotaxis kammeret beregnet for å minimalisere virkningene av Joule oppvarming 16. Varmen som genereres i kammeret er proporsjonal med kvadratet av den strøm som flyter gjennom den, som er i sin tur er proporsjonal med tverrsnittsarealet av galvanotaxis kammeret. Vi anbefaler opprettholde tverrsnittsarealet av kammeret som 2,04 mm 2 (12 mm x 0,17 mm).
- Etter 7 dager med kultur neurospheres kan samles, dissosiert i enkeltceller og replated i vekst-faktor forhold (en prosess kalt «passaging ') for å gi sekundære neurospheres. Vi får vår beste resultater ved hjelp neurospheres som har gjennomgått mindre enn tre passeringer (maks. 21 dager i kultur), med en synlig nedgang i trekkende evner ved bruk neurospheres som har blitt passaged større number av ganger. Dette er i tråd med vår tidligere arbeid som viser at mer langsiktige kulturer endre celle kinetikk 17.
- Ved valg av en galvanotaxis kammer inneholdende NPCer for observasjon, er det viktig å velge et kammer hvor de neurosphere avledet celler har dissosiert brønnen for å tillate nøyaktig kinematiske analyser. Dersom neurospheres har ikke dissosiert godt (NPC følges av hverandre og kan ikke være avgrenset), vil analyse av enkelte cellen trekkadferden bli nær umulig. Kulturene bør tillates mer tid til å distansere før observasjon. I tillegg kan celler som er i umiddelbar nærhet til hverandre fysisk hindrer migrering av nabocellene. Våre analyser har vist at cellene plassert minst én celle kroppen bort fra deres nærmeste nabostaten celle migrere ved betydelig større hastigheter enn celler som er gruppert sammen i nærheten av sentrum av den dissosierte neurosphere, enskjønt med lik directedness.
- Hvis det er en overflod av prosesser som strekker seg fra NPCer, er dette en indikator på at cellene har begynt å differensiere og derfor er de ikke et sant bilde av en udifferensiert befolkningen. En fordel med å forberede galvanotaxis kamre i triplikat er at de to gjenværende kamre som ikke er valgt for tid-lapse avbildning kan festes umiddelbart etter deres inkubert Plating periode (trinn 2.16), og for å bekrefte immunostained differensieringen profilen av cellene.
- For optimale resultater kulturmediene bør være tilberedes og supplert på hver dag at det er nødvendig.
- Det tidsstyrte bilder og påfølgende kinematiske analyser er svært følsomme for forstyrrelse av prøven. Live-cell imaging mikroskop bør plasseres på en luft bord for å redusere vibrasjonene, og systemet skal ikke være perturbed under eksperimentering.
Vår lab rutinemessig bilder NPC galvanotaksen for 6-8 hr, selv om opp til 15-timers analyser er blitt utført. I løpet av de 15-timers perioder, falt DCEF over kammeret fra 250 mV / mm til 227 mV / mm (9,2% reduksjon). Lengre bildebehandling perioder uunngåelig modifisere pH i mediet i kammeret, videre endre det elektriske feltet. Dermed er det anbefalt å erstatte media omtrent hver 6 hr. Imidlertid, har vi utført 8-timers NPC galvanotaxis analyser uten medier utskifting og har ikke observert noen merkbar celledød (døde celler ikke migrere) eller nedgang i celle motilitet; cellene opprettholde sin hastighet av migrasjon gjennom hele forsøket. Undersøkeren kan også redusere dybden av kammeret for å øke stabiliteten av DCEF 10.
Etter bildebehandling, er encellede kinematisk sporing analyse utført på en undergruppe av den avbildede cellene ved hjelp Zeiss Axiovision programvaren sporing modulen. Cellene er valgt for analyse hvis de er lokalisert nærmere kanten avden dissosieres neurosphere og minst en celle kroppen bortsett fra dens nærmeste celle. Tanken bak dette er å minimere sannsynligheten for celler overlappende hverandre under sporing, noe som ville gjøre sporing individuelle celler nær umulig. Vi analyserer følgende fire parametre for migrasjon:
- X-aksen fortrengning - avstanden en celle migrerer i retning av aksen, som er parallell med retningen av DCEF.
- Velocity - den lineære avstanden mellom første og siste celle stillinger fordelt på medgått tid.
- Directedness - x-aksen fortrengning dividert med lineære avstanden mellom de første og siste celle posisjoner.
- Tortuosity - totalt veistrekningen tilbakelagt av cellen dividert den lineære avstanden mellom begynnelses-og slutt celle posisjoner.
De to sistnevnte parametrene er indikatorer på hvor rett migrasjon sti er i en bestemt retning.
18. En passende substrat og kultur media ville trenge å bli valgt for andre celletyper, og varigheten av cellen seeding før avbildning bør justeres etter behov. Spesielt, kan dimensjonene av kammeret må endres avhengig av tykkelsen av vevet som undersøkes (for eksempel hvis en vev stykke plasseres i kammeret). Etterforskeren bør huske på that for et sett elektrisk felt, er strømmen gjennom kammeret direkte proporsjonal med tverrsnittsarealet av kammeret, og derfor betydelige forstørrelser til kammeret dimensjoner kan resultere i økt Joule oppvarming-relatert celledød.
Teknikkene som beskrives i denne rapporten gir et kraftig verktøy for å undersøke viktig, men ikke mye studert, fenomenet galvanotaxis. Muligheten av celler til å svare på dcEFs har direkte terapeutiske implikasjoner. Elektrisk stimulering (dyp hjernestimulering) allerede vist seg nyttige ved behandling av Parkinsons sykdom, og har vist seg å fremme hippocampus neurogenesis i en mus modell 19,20. En fullstendig forståelse av de cellulære mekanismene som er ansvarlig for DCEF transduksjon inn cellular motilitet kan føre til bruk av elektrisk stimulering som en klinisk middel for å styrke og lede endogen forløper migrasjon til nettsteder for skade eller disease å lette reparasjonsprosessen. Metodene beskrevet ovenfor gir en enkel og robust måte å undersøke disse prosessene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet er finansiert av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (tilskudd # 249669 og # 482986) og Heart og Stroke Foundation of Canada (tilskudd # 485508). Forfatterne takker Youssef El-Hayek og Dr. Qi Wan for deres hjelp i utviklingen av eksperimentelle protokoller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
- Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
- Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
- Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
- Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
- Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
- Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
- Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
- McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
- Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
- Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
- Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
- Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).
