一个的趋电含量为神经前体细胞迁移的动力学分析外部施加直流电场

Summary

在这个协议中，我们将演示如何构建自定义室，允许应用程序的直流电场，使时间的推移成像的成人脑源性神经前体细胞转趋电性。

Abstract

神经干细胞和祖细胞（统称为神经前体细胞）（的NPC）在成年哺乳动物大脑的发现已导致一个机构的研究，目的是在利用这些细胞的多能和增殖特性的发展的神经再生策略。这种战略成功的一个关键步骤是动员的NPC外源性移植后向病变部位或提高内源性的前体，发现脑室周围白质区域的中枢神经系统的反应。因此，有必要了解的机制，促进，引导，增强人大迁移。我们的工作主要集中在利用直流电场（量增多），以促进和直接的NPC迁移 - 这种现象被称为趋电性。内源性生理电场的正常发育和伤口修复细胞迁移过程中发挥作用的关键线索。药理中断在蝾螈胚胎的的跨神经管潜力会导致严重的发育畸形。的速度修复受伤的角膜伤口愈合的情况下，直接与上皮损伤后产生的伤害潜力的幅度，药理增强或中断，这DCEF ^2-3所示。我们已经证明，成年室管膜下的NPC进行快速和导演的阴极迁移的影响 ，当暴露在外部施加的dcEF。在这个协议中，我们将介绍创建一个简单而有效的高分辨率，长期观察的细胞体易位（迁移）在单细胞水平的趋电检测实验室的技术。该测定中，将适合于调查机制调节dcEF转导到细胞运动通过使用转基因或基因敲除小鼠，短干扰RNA，或特定的受体激动剂/拮抗剂。

Protocol

多伦多大学的动物保健委员会批准了在所有涉及动物处理的程序，按照制度指引（协议。20009387）。应当执行下面的方法，使用无菌的工具和技术，在层流罩（如适用）。

在下面的协议文本中，短语“EFH-SFM”是指以与表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子和肝素的无血清培养基中。 EFH-SFM调查时，未分化的NPC，因为这些有丝分裂原的趋电维持其未分化状态的NPC ^4。当调查趋电的NPC诱导分化成成熟的细胞类型，“FBS-SFM”指的是含1％胎牛血清的无血清培养基中。 FBS促进NPC的分化为成熟的神经表型。

1。神经前体细胞的分离和培养（不视频中所示）

1. 一个CD1小鼠（6-8周龄）麻醉与异氟烷和牺牲精神，通过颈椎脱位。
2. 浇在70％的乙醇和锐性剥离剪刀斩首动物的头。
3. 用手术钳头，背表面上去除皮肤暴露的头骨。
4. 用手术刀并没有。 11刀，颅骨额窦的沿内外侧轴的得分，也沿矢状缝在rostrocaudal方向。
5. 没有远离头部顶骨去皮。 7弯曲的镊子，小心不要刺破脑组织。
6. 将下方的小脑和大脑开始走向嗅球薄锅铲下。用钳子按住头骨的地方，轻轻一拉从头骨的脑，并立即将其放置在冰冷的人工脑脊液（见下面的食谱）。
7. 在解剖显微镜下，用消毒解剖剪刀和镊子把大脑中的一半沿中线。旋转，使每个半球的内侧表面（切段）朝上。
8. 选择一个半球，内侧面朝上，找到胼胝体压部，胼胝体（胼胝体后区）。
9. 做一个切口从皮层的表面沿背腹轴的胼胝体的胼胝体压。
10. 去皮，切开皮层向嗅球暴露侧脑室壁的内侧和外侧。
11. 旋转，这样的半球背表面朝上，并使用弯曲microscissors，切出，收集暴露的内侧和外侧的墙壁，其中包含的脑室周围地区的NPC位于。
12. 重复步骤1.8-1.11另一半球。
13. 用移液管的离体组织到7毫升的胰蛋白酶溶液（见下面的配方），在15毫升管中，并放置在37℃的管上的摇杆培养箱中培养25分钟。
14. 管在1,500 rpm离心5分钟，吸出上清液，并重新悬浮在2毫升的胰蛋白酶抑制剂溶液（见下面的配方）的组织。
15. 轻轻捣碎组织一个小孔径巴斯德吸管30-50倍小心，以避免气泡。
16. 离心管在1,500 rpm离心5分钟，吸出上清液，并重新悬浮在1-2ml的SFM（见配方下面）通过捣碎沉淀3-5倍。
17. 离心管在1,500 rpm离心3分钟，吸出上清液，重悬在1ml的SFM + EFH。
18. 用血细胞计数板在T25培养瓶中的细胞的密度为10个细胞每微升SFM + EFH中，计数活细胞密度。
19. 允许的文化成长为7天不受干扰产生的NPC组成的自由浮动的主要神经球。

2。趋电池准备

1. 放置3个方形玻璃。 1盖玻片（22×22×0.17毫米）呐瓶的6N盐酸过夜。
2. 第二天，使用金刚石尖端玻璃刀片削减6矩形条（22×5×0.17毫米）的玻璃从方无。 1盖玻片上。
3. 酸洗方形单和矩形单传送到在层流罩中。矩形和正方形带先用70％乙醇洗净，然后用组织培养级的灭菌水，并允许上的金擦拭干燥（用于加入无菌，玻璃可能被允许空气干燥）。
4. 应用真空脂玻片的平方的一个表面的周边，将它们密封的60毫米的塑料陪替氏培养皿的基础上。
5. 应用真空润滑脂沿长轴的长方形玻璃条的一个表面，将它们密封的相对边缘的方形的载玻片（使得它们彼此平行地），以建立一个中部槽。
6. 紫外线消毒室，层流罩至少15分钟。
7. 移液器250-300μl的聚-L-LYSI东北到中央槽室，室温孵育2小时。
8. 约15分钟之前结束的潜伏期，准备Matrigel的解决方案（见下面的配方）。
9. 吸取聚-L-赖氨酸，用1毫升灭菌水，和移液管250-300微升到中央槽的Matrigel溶液洗中央槽。
10. 在37°C孵育室1小时。
11. 吸取基质胶溶液，轻轻地洗1-2毫升SFM中央槽。
12. 吸取100微升EFH-SFM或FBS-SFM到中央槽和转移的趋电室搬上舞台，显微镜计数。
13. 移液器3-4毫升的神经球的含培养一个60毫米的培养皿中，并转移到陪替氏培养皿的计数显微镜的阶段。
14. 在观看目标的5x，使用P10吸管5-8整个神经球（最多四个在一个时间）传输到各趋电槽中央室无解离，并小心地围绕中部槽不破坏基底膜基板的情况下的神经球。
15. EFH-SFM或FBS-SFM添加一个额外的150-200微升到中央的低谷。
16. 趋电室转移到在37℃，5％CO _2，100％湿度的培养箱中培养17-20小时（如果分析未分化的NPC）允许神经球坚持的Matrigel的衬底，并分离成单个细胞，如在图1中所示。如果分析差异化的NPC，潜伏期延长到69-72小时，让细胞分化。

3。活细胞延时成像

1. 允许活细胞成像系统平衡，在37℃，5％CO _2中的至少30分钟的时间推移记录开始前。
2. 剪下的两个12厘米的块1毫米直径的银线，线圈的一端，并将其放置在高乐氏（Clorox）b浸20分钟，以形成Ag / AgCl电极。
3. 转移的趋电性室的计数显微镜搬上舞台，并选择该室将被用于活细胞成像迁移分析基于以下标准：i）本神经球应该是几乎完全离解成单个细胞及ii）应具备的细胞小到没有任何进程从细胞体延伸的圆形形态。
4. 转移到在层流罩中选定的趋电室，以及一个单独的正方形无。 1玻璃盖片和真空润滑脂。
5. 洗盖滑先用70％的乙醇，然后用无菌水，并应用真空润滑脂在两条平行的盖玻片的边缘的带状。
6. 吸出培养基从中部槽室，室的润滑脂条剩下的两个平行的长方形玻璃条，有效地创建一个屋顶上，然后迅速将的盖玻片（油脂面朝下）会议厅。
7. 吸取100微升新鲜EFH-SFM或FBS-SFM到中央槽通过毛细作用。
8. 使用真空脂培养基池创建边界的中心槽的每一端上，如在图2中示出。
9. 剪切PVC管的两个15厘米的片，并使用10毫升的用18号针头的注射器仔细的琼脂糖溶液注入到管中，确保无气泡在管中形成的，使凝胶固化5分钟。
10. 转移趋电室的活细胞成像系统中，沿与琼脂糖凝胶管，的Ag / AgCl电极，以及一对空的60毫米的培养皿中，将被用作培养介质储层并且将包含Ag / AgCl电极。允许的趋电室休息内的37℃，5％CO _2的环境，为20-30分钟。
11. 在此期间，准备钻孔的2个空培养皿的盖子和趋电性室的皮氏培养皿的盖子到他们具有的Dremel或类似的工具，如在图3中所示。
12. 用移液管1-1.5毫升EFH-SFM或FBS-SFM到两侧的中部槽，和7-8毫升的SFM到每一个空的培养皿中。将一个培养皿每一侧的趋电性室的的槽中央和地方，一个Ag / AgCl电极为每一道菜。趋电室和培养皿建立电连续性与琼脂糖凝胶桥桥之间的间隙，如在图4中示出。
13. Ag / AgCl电极连接到一个外部电源，用电流表串联测量电流，并开启电源。使用电压表测量直接跨接在槽中央的电场强度，调整输出的电源，直到所需的电场强度达到（在该实验室进行的检测采用DCEF强度在250 mV /月之间的电流1和1.5毫安）。
14. 创议特的时间推移模块上的活细胞成像系统，并允许在实验过程中运行所需的时间量。测定完成后，进行细胞固定在4％多聚甲醛的标准免疫染色分析。

Representative Results

运动学分析表明，在250毫伏/毫米dcEF的存在下，未分化的NPC表现出高度定向和快速的趋电向阴极（ 图5A，电影1）。在一个dcEF缺席，随机运动的细胞中观察到（ 图5B，电影2）。在此输入强度，> 98％的未分化的NPC迁移整个6-8小时，这是他们的成像，并自死细胞不迁移，这表明，它们在此期间，在存在或不存在的dcEF仍然可行。

有区别的表型进行可以忽略不计的迁移，无论是在存在和不存在的DCEF（ 电影3，4）。分化的细胞的亚群的延伸过程，往往对齐垂直方向的dcEF，但没有明显的细胞体观察到易位。

免疫组化染色验证的NPC保持积极的表达探讨n为DCEF曝光（ 图6A），6小时后的神经前体标记物巢蛋白。在检测涉及的NPC诱导分化成成熟的表型的，大多数的细胞表达成熟的星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP），6小时后的DCEF曝光（ 图6B）。

在这些分析中所用的主要抗体如下：小鼠单克隆抗巢蛋白（1:400，Millipore公司，加拿大），兔多克隆抗-GFAP（1:500，Sigma公司，加拿大）。在这些分析中所使用的二次抗体如下：山羊抗小鼠Alexafluor 568（1:400，Invitrogen公司，Gibco公司，加拿大），共轭的山羊抗兔共轭与Alexafluor 488（1:400，Invitrogen公司，Gibco公司，加拿大）。

图1。神经球坚持Matrigel的衬底和dissoci的吃成单个细胞，培养17小时后，在37°C / 5％CO _2，湿度为100％，在EFH-SFM。

图2。趋电性室的插图。带真空润滑脂用来创建一个池的任一侧上的中心槽的培养基。

图3的孔应钻成的盖的趋电室和培养基水库示意图。在两个盖子7毫米直径的孔是用来插入琼脂糖凝胶管。的趋电室的盖的4毫米直径的孔中被用来测量使用电压表直接跨越槽中央的电位。 4毫米直径的孔中的盖体的培养基中再servoir是允许的Ag / AgCl电极，用于连接到电源的菜从盖突出。

图4插图的趋电性室时间的推移成像组件。趋电室中央的培养皿中，其中的细胞均镀。中央培养皿内住房的媒体趋电性室或者是SFM + EFH或SFM + 1％FBS。任一侧上的陪替氏培养皿的趋电室中填充与SFM，并还含有Ag / AgCl电极。这些电极被连接到一个外部电源，并与琼脂糖凝胶桥桥接三个培养皿形成一个完整的电路。

图5在presence的一个dcEF未分化的NPC进行快速galvanotactic迁移向阴极（A），而在没有一个DCEF细胞进行随机径向迁移（B）。

图6。免疫染色验证nestin阳性的NPC保持DCEF曝光（A）6小时后，未分化的前体和诱导分化大多的NPC表达成熟的星形胶质细胞的标记物GFAP DCEF曝光（B）的6小时后。

动画1。未分化的NPC接触到dcEF时间推移视频。的NPC培养皿上趋电室SFM + EFH中的17小时，然后暴露于一个250毫伏/月DCEF具有迅速和定向的向阴极迁移。 1秒的视频= 15分钟实时点击这里查看莫争夺。

电影2。时间推移视频未分化的NPC在没有一个dcEF。的NPC，培养皿上趋电室SFM + EFH中的17小时，然后在没有施加DCEF成像进行随机迁移。 1秒的视频= 15分钟实时点击这里观看电影 。

电影3。差异化的NPC接触到dcEF时间推移视频。筹备镀上趋电性室SFM + FBS为69-72小时，然后将其暴露在一个250 mV /月的DCEF具有非常小的在任何方向迁移。 1秒的视频= 15分钟实时点击这里观看电影 。

电影4。时间推移视频差异化的NPC在没有一个DCEF。筹备镀上趋电性茶mbers SFM + FBS的69-72小时，然后在没有施加DCEF成像表现出非常小的迁移，在任何方向，类似于暴露到dcEF分化的NPC。 1秒的视频= 15分钟实时点击这里观看电影 。

Discussion

该协议已经进行了调整，从以前的研究^7-9的行之有效的方法。可以使用各种不同的技术，包括建造一个单独的玻璃以及禁闭细胞接种中部槽^10,11的微细化，或使用CO ₂激光烧蚀构造galvanotactic室。有些技术可能比别人更费力，代价高昂的。我们描述了一个简单和成本效益的分析，为构建全国人民代表大会趋电性室使用的材料通常存在于大多数细胞生物学实验室。我们的协议，包括可加热，加湿，CO ₂稳压孵化器，周围的活细胞成像系统，以保持在最佳条件下长期连续成像的细胞。这种装置是缺乏的限制，以前的一些技术^9,12。

另一组最近的工作表现出了类似的GALVAnotactic行为的细胞海马细胞株^13，使用不同的协议和劳动密集的趋电性室设计。我们的分析是特别优雅，因为它允许细胞的的同一起跑线人口的分析 - 原代细胞培养获得的未分化的神经球的NPC - 已经暴露在不同的条件，从而使未分化和分化细胞的迁移特性的比较，简单地通过修改用于补充培养基内的趋电室的因素。

在该协议中提出的分析是一个功能强大的工具，为全国人民代表大会趋电的长期跟踪和分析，以及可能的其他类型的细胞进行galvanotactic迁移^14,15。任何协议，细微之处，在编制和执行本协议中的某些步骤可能会导致失败的结果。下面的指导方针和建议应作为SIST在此协议的成功执行：

• 接受电流相关联的热死，为了防止细胞的趋电室的尺寸已被计算的焦耳加热¹⁶的影响减到最小。在腔室中产生的热量是通过它，这是在旋转成比例的横截面面积的趋电室中流动的电流的平方成比例的。我们建议保持该室的横截面的面积为2.04毫米^2（12毫米×0.17毫米）。
• 经过7天的培养的神经球可以被收集，分离成单个细胞，并再接种在生长因子的条件下（在这个过程简称为“传代”），以产生次级神经球。我们得到我们最好的结果，使用神经球，经历了不到3个通道（最多21天中文化），一个在迁徙能力明显下降时使用的神经球已经传一个更大的number的时代。这是符合我们以前的工作表明，长期的文化改变细胞动力学研究^17。
• 当选择了一个趋电包含用于观察的NPC的腔室，它是重要的选择衍生的神经球的细胞有一个腔室，在其中解离，以允许精确的运动学分析。如果神经球没有解离（NPC都彼此粘附，并且不能被划定），将成为单个细胞迁移行为分析几乎是不可能的。文化应该允许更多的时间来分离之前观察。此外，现在的位置彼此接近的细胞，可以物理阻碍相邻细胞的迁移。我们的分析表明，定位距离他们最近的相邻小区的至少一个电池主体的细胞迁移，聚集在一起的解离的神经球的中心附近的细胞相比，显着更大的速度，虽然具有相同的可怕ctedness。
• 如果有大量的处理时间的NPC，这是一个指标，细胞开始分化，因此，他们是不是真实地再现了一种未分化的人口。准备的趋电室，一式三份的一个好处是可以立即修复，剩下的两个时间推移成像室没有被选中后，其孵化的镀期（2.16），免疫组化染色验证的细胞分化的档案。
• 为了达到最佳效果，应新鲜配制的培养基，并辅以每一天，它需要。
• 时间推移图像和随后的运动学分析样品的扰动非常敏感。活细胞成像显微镜应放在空气表，以尽量减少震动，系统不应该在实验过程中的扰动。

我们的实验室常规图像NPC galvanot轴为6-8小时，虽然已经进行了15小时的分析。在15小时期间，整个室内的dcEF从250 mV /月下降至227毫伏/月（下降9.2％）。较长的成像期间不可避免地修改的腔室中的介质的pH值，进一步修改的电场。因此，它是大约每隔6小时建议更换介质。然而，我们没有更换媒体进行8小时全国人民代表大会趋电性检测，并没有发现任何明显的细胞死亡（死细胞不迁移）或细胞活力下降，细胞的迁移整个实验过程中保持自己的速度。研究者也可能降低该室的深度的DCEF ^10，以增加稳定性。

成像，单细胞的运动跟踪分析成像细胞使用蔡司Axiovision软件的跟踪模块的一个子集上执行。选择细胞进行分析，如果它们被定位更接近的边缘的解离的神经球和至少一个电池主体，除了从其最接近的细胞。这样做的理由是，以尽量减少跟踪过程中的细胞相互重叠的可能性，这将使跟踪单个细胞几乎是不可能的。我们分析了以下四个参数的迁移：

1. X轴位移 - 一个细胞迁移的轴线的方向上，这是平行的dcEF方向的距离。
2. 速度 - 之间的直线距离除以经过时间的最初和最后一个单元格的位置。
3. directedness - x轴位移的初始和最终的细胞位置的直线之间的距离除以
4. 曲折路径 - 总行驶距离的细胞分裂最初和最后一个单元格位置之间的直线距离。

后两个参数是有直链的迁移途径是在一个特定的方向上的指标。

18。适当的底物和培养基中需要被选择用于其它类型的细胞，和细胞接种在成像之前的持续时间应根据需要调整。值得注意的是，在腔室的尺寸可能需要进行修改，这取决于正在审查的组织（例如，如果被放置在一个腔室）的组织切片上的厚度。调查人员应紧记THAt为一套电场，通过腔室的电流流动是直接正比于该室的横截面面积，并因此显着放大到该腔室的尺寸可能会导致在焦耳热增加相关的细胞死亡。

本报告中所描述的技术提供了一个功能强大的工具的重要调查，但没有得到广泛的研究，趋电的现象。细胞的能力，以应对量增多有直接的治疗意义。在治疗帕金森氏病，电刺激（脑深部电刺激）已经证明是有益的，并已被证明在小鼠模型中促进海马神经^19,20。负责的DCEF传导到细胞运动细胞机制的一个全面的了解，最终可能导致作为临床使用的电刺激手段，为加强和指导的内源性前体迁移到网站的人身伤害或disea本身并促进修复过程。上面描述的方法，调查这些过程提供一个简单的和可靠的方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32"ID x 5/32"OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.