Summary
हम इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन कैसे कस्टम कक्षों कि वयस्क galvanotaxis के दौरान तंत्रिका अग्रदूत साबित सेल स्थानान्तरण व्युत्पन्न मस्तिष्क के समय चूक इमेजिंग सक्षम एक प्रत्यक्ष वर्तमान बिजली क्षेत्र के आवेदन की अनुमति के निर्माण करने के लिए.
Abstract
तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष (सामूहिक करार दिया तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत) वयस्क स्तनधारी दिमाग में कोशिकाओं (NPCs) की खोज के लिए अनुसंधान के एक शरीर neuroregenerative रणनीतियों के विकास के लिए इन कोशिकाओं के multipotent और proliferative गुणों का उपयोग करने के उद्देश्य से प्रेरित किया है. ऐसी रणनीतियों की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम exogenous प्रत्यारोपण के बाद एक घाव साइट की ओर या अंतर्जात व्यापारियों है कि सीएनएस के periventricular क्षेत्र में पाए जाते हैं की प्रतिक्रिया को बढ़ाने NPCs के जुटाना है. तदनुसार, यह आवश्यक है कि तंत्र को बढ़ावा देने, मार्गदर्शन, और एनपीसी प्रवास बढ़ाने को समझने की. एक galvanotaxis के रूप में जाना जाता है घटना - हमारा काम प्रत्यक्ष मौजूदा बिजली क्षेत्रों के उपयोग (dcEFs) को बढ़ावा देने और प्रत्यक्ष एनपीसी प्रवास पर केंद्रित है. अंतर्जात शारीरिक बिजली क्षेत्र सामान्य विकास और घाव की मरम्मत के दौरान सेल प्रवास के लिए महत्वपूर्ण संकेत के रूप में कार्य करते हैं. के भेषज विघटनपार axolotl भ्रूण में तंत्रिका ट्यूब संभावित गंभीर विकास 1 विरूपताओं का कारण बनता है. घाव भरने के संदर्भ में, घायल कॉर्निया की मरम्मत की दर सीधे उपकला घाव संभावित है कि चोट के बाद उठता है की भयावहता के साथ जोड़ा जाता है, के रूप में औषधीय या इस 2-3 dcEF की वृद्धि विघटन से दिखाया गया है. हमने दिखा दिया है कि वयस्क subependymal NPCs इन विट्रो में तेजी से और निर्देशित cathodal प्रवास गुजरना जब बाह्य लागू dcEF उजागर. इस प्रोटोकॉल में हम उच्च संकल्प, एक एकल कोशिका के स्तर पर निर्देशित सेल शरीर स्थानान्तरण (प्रवास) के लंबी अवधि के अवलोकन के लिए एक सरल और प्रभावी galvanotaxis परख बनाने के लिए हमारी प्रयोगशाला की तकनीक का वर्णन. इस परख तंत्र है कि सेलुलर गतिशीलता में ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों, कम हस्तक्षेप शाही सेना, या विशिष्ट रिसेप्टर agonists / गरम का उपयोग माध्यम से dcEF पारगमन को विनियमित की जांच के लिए उपयुक्त होगा.
Protocol
सभी जानवर से निपटने को शामिल प्रक्रियाओं संस्थागत दिशा निर्देशों (कोई प्रोटोकॉल 20009387) के अनुसार टोरंटो पशु की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया. निम्न विधियों में बाँझ उपकरणों और तकनीकों का उपयोग करते हुए एक लामिना का प्रवाह हुड जहां लागू किया जाना चाहिए.
प्रोटोकॉल के नीचे पाठ में, वाक्यांश "EFH SFM" सीरम मुक्त epidermal वृद्धि कारक, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक और हेपरिन के साथ पूरक मीडिया के लिए संदर्भित करता है. जब EFH-SFM undifferentiated NPCs के galvanotaxis की जांच क्योंकि इन mitogens उनके undifferentiated राज्य 4 में NPCs को बनाए रखने में प्रयोग किया जाता है. , "FBS SFM" जब प्रेरित NPCs के galvanotaxis प्रकार परिपक्व सेल में अंतर की जांच सीरम मुक्त 1% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक मीडिया के लिए संदर्भित करता है. FBS परिपक्व तंत्रिका 5 phenotypes में NPCs के भेदभाव को बढ़ावा देता है.
1. अलगाव और तंत्रिका व्यापारियों के संस्कृति (नहींवीडियो में दिखाया गया है)
- एक CD1 माउस (6-8 सप्ताह पुराना) बेहोश करना और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम isofluorane बलिदान के साथ.
- 70% इथेनॉल में सिर पानी में गोता लगाना और तेज विच्छेदन कैंची साथ पशु वध करना.
- जबकि शल्य संदंश के साथ सिर पकड़ पृष्ठीय सतह पर त्वचा को हटाने की खोपड़ी बेनकाब.
- एक स्केलपेल और नहीं का उपयोग करना. 11 ब्लेड, खोपड़ी mediolateral अक्ष के साथ ललाट साइनस स्कोर और भी rostrocaudal दिशा में बाण के समान सीवन के साथ.
- कोई साथ सिर से दूर पार्श्विका हड्डियों पील. 7 घुमावदार संदंश, मस्तिष्क के ऊतकों देखभाल नहीं ले रही बेध.
- सेरिबैलम के नीचे से शुरू करने और घ्राण बल्ब की ओर बढ़ते मस्तिष्क के नीचे एक पतली रंग डालें. जबकि जगह में संदंश के साथ खोपड़ी धारण, धीरे खोपड़ी से मस्तिष्क खींचने के लिए और इसे तुरंत ठंडा कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (व्यंजनों नीचे देखें) में जगह.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, बाँझ का उपयोगविच्छेदन कैंची और संदंश midline साथ आधे में मस्तिष्क में कटौती. प्रत्येक गोलार्द्ध इतना है कि औसत दर्जे का सतह (कट) ऊपर चेहरे घुमाएँ.
- एक गोलार्द्ध का चयन करें, और औसत दर्जे का सतह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ, महासंयोजिका (महासंयोजिका के पीछे क्षेत्र) के splenium.
- प्रांतस्था की सतह से dorsoventral अक्ष के साथ महासंयोजिका की splenium एक चीरा बनाओ.
- पील घ्राण बल्ब की ओर पार्श्व वेंट्रिकल की औसत दर्जे का है और पार्श्व दीवारों बेनकाब छिन्न प्रांतस्था.
- गोलार्द्ध घुमाएँ इतना है कि पृष्ठीय सतह ऊपर चेहरे, और घुमावदार microscissors का उपयोग करने के लिए बाहर कटौती और औसत दर्जे का है और पार्श्व दीवारों उजागर, है जो periventricular क्षेत्र में, जहां NPCs 6 रहते होते इकट्ठा.
- दोहराएँ अन्य गोलार्द्ध के लिए 1.8-1.11 कदम.
- एक 15 सीसी ट्यूब में trypsin समाधान (नीचे नुस्खा देखें) के 7 मिलीलीटर में अलग ऊतक पिपेट, और एक घुमाव पर एक 37 डिग्री सेल्सियस में ट्यूब जगह25 मिनट के लिए इनक्यूबेटर.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर अपकेंद्रित्र ट्यूब, तैरनेवाला aspirate, और trypsin अवरोध करनेवाला समाधान के 2 मिलीलीटर में ऊतक resuspend (नुस्खा नीचे देखें).
- धीरे एक छोटे borehole पाश्चर विंदुक 30-50 बार के साथ ऊतक सावधानी से महीन चुर्ण बनाना हवाई बुलबुले से बचने के.
- 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर अपकेंद्रित्र ट्यूब, तैरनेवाला aspirate, और गोली 3-5 बार triturating SFM (नुस्खा नीचे देखें) के 1-2 मिलीलीटर में resuspend.
- 3 मिनट के लिए 1500 rpm पर अपकेंद्रित्र ट्यूब, SFM + EFH की सतह पर तैरनेवाला और resuspend में 1 मिलीलीटर aspirate.
- एक रुधिरकोशिकामापी और SFM + EFH में 10 μl प्रति कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं थाली के साथ एक T25 संस्कृति फ्लास्क में सेल घनत्व जीने गिनो.
- संस्कृति मुक्त अस्थायी प्राथमिक NPCs के शामिल neurospheres उपज undisturbed 7 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति दें.
2. Galvanotaxis चैंबर तैयारी
- 3 वर्ग में कांच की जगह नहीं. 1 कवर फिसल जाता है (22 x 22 x 0.17 मिमी) मैं6N रातोंरात हाइड्रोक्लोरिक एसिड की बोतल ना.
- अगले दिन, एक हीरे की नोक ग्लास कटर का उपयोग वर्ग नहीं से 6 कांच की आयताकार स्ट्रिप्स (22 x 5 x 0.17 मिमी) में कटौती. 1 कवर फिसल जाता है.
- एक लामिना का प्रवाह हुड में एसिड धोया वर्ग फिसल जाता है और आयताकार फिसल जाता स्थानांतरण. आयताकार और वर्ग 70% इथेनॉल के साथ पहली स्ट्रिप्स धोएं, तो टिशू कल्चर ग्रेड autoclaved पानी के साथ, और एक किम पर सूखी पोछो की अनुमति (जोडी बाँझपन के लिए, कांच शुष्क हवा के लिए अनुमति दी जा सकता है).
- वर्ग गिलास स्लाइड के एक सतह की परिधि के लिए वैक्यूम तेल लागू, और उन्हें 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के आधार को सील.
- आयताकार गिलास स्ट्रिप्स के एक सतह की लंबी अक्ष के साथ वैक्यूम तेल लागू करने के लिए, और उन्हें वर्ग कांच स्लाइड (ऐसी है कि वे एक दूसरे के समानांतर हैं) के विपरीत किनारों को सील करने के क्रम में एक केंद्रीय गर्त बनाने.
- लामिना का प्रवाह हुड में कम से कम 15 मिनट के लिए कक्षों यूवी बाँझ.
- पिपेट पाली एल lysi 250-300 μlकक्षों और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते के केंद्रीय गर्त पर पूर्वोत्तर.
- लगभग 15 ऊष्मायन अवधि के अंत से पहले मिनट, Matrigel समाधान तैयार (नुस्खा नीचे देखें).
- पाली - एल Lysine Aspirate, autoclaved पानी की 1 मिलीग्राम और 250-300 μl विंदुक केंद्रीय troughs पर Matrigel समाधान के साथ केंद्रीय troughs धो लो.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कक्षों सेते हैं.
- Matrigel समाधान Aspirate और धीरे SFM की 1-2 मिलीलीटर के साथ केंद्रीय troughs धो लो.
- पिपेट केंद्रीय troughs पर 100 EFH SFM या FBS - SFM की μl और एक गिनती खुर्दबीन के मंच पर galvanotaxis कक्षों हस्तांतरण.
- पिपेट संस्कृति neurosphere युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश में 3-4 मिलीग्राम और गिनती खुर्दबीन के मंच पर पेट्री डिश हस्तांतरण.
- 5x की एक को देखने के उद्देश्य, एक P10 विंदुक का उपयोग करने के लिए प्रत्येक galvanotaxis के केंद्रीय गर्त पर 5-8 पूरे neurospheres (चार एक समय में) हस्तांतरणकक्ष उन्हें dissociating, और ध्यान से Matrigel सब्सट्रेट में खलल न डालें बिना केंद्रीय गर्त चारों ओर neurospheres फैला बिना.
- केंद्रीय troughs पर EFH-SFM या FBS SFM की एक अतिरिक्त 150-200 μl जोड़ें.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 17-20 घंटे के लिए 100% humidified इनक्यूबेटर में galvanotaxis कक्षों स्थानांतरण (यदि undifferentiated NPCs विश्लेषण) Matrigel सब्सट्रेट का पालन करने के neurospheres और एकल कक्षों में अलग कर देना जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया की अनुमति . यदि विभेदित NPCs विश्लेषण, ऊष्मायन अवधि 69-72 घंटे के लिए बढ़ाया जा कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति चाहिए.
3. लाइव सेल इमेजिंग समय चूक
- जीना सेल इमेजिंग प्रणाली 37 में संतुलन में लाना करने की अनुमति दें डिग्री सेल्सियस, 5% समय चूक रिकॉर्डिंग की दीक्षा से पहले 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए सीओ 2.
- एक छोर से दो उन्हें 1 मिमी व्यास चांदी के तार तार, 12 सेमी टुकड़े काटें, और उन्हें Clorox ख में जगहनमकीन पानी में 20 मिनट के लिए एजी / AgCl इलेक्ट्रोड बनाने के लिए.
- एक गिनती खुर्दबीन के मंच पर galvanotaxis कक्षों स्थानांतरण और चुनें जो कक्ष जीवित कोशिका इमेजिंग प्रवास विश्लेषण निम्नलिखित मानदंडों के आधार के लिए इस्तेमाल किया जाएगा: i) neurospheres एकल कक्षों और द्वितीय में लगभग पूरी तरह से अलग हो सकता है) कोशिकाओं के अधिकारी चाहिए चाहिए थोड़ा करने के लिए कोई प्रक्रिया के साथ दौर morphologies सेल शरीर से विस्तार.
- एक लामिना का प्रवाह हुड में एक अलग वर्ग के साथ नहीं के साथ चयनित galvanotaxis कक्ष, स्थानांतरण. 1 गिलास को कवर पर्ची और वैक्यूम तेल.
- धो कवर 70% इथेनॉल के साथ 1 पर्ची, तो autoclaved पानी के साथ, और कवर पर्ची के दो समानांतर किनारों पर वैक्यूम तेल की एक स्ट्रिप लागू.
- चैम्बर के केंद्रीय गर्त से संस्कृति मीडिया Aspirate, तो जल्दी से ऐसे कक्ष है कि दो समानांतर आयताकार गिलास स्ट्रिप्स पर तेल स्ट्रिप्स बाकी है, प्रभावी रूप से एक छत बनाने पर कवर पर्ची (तेल - साइड नीचे का सामना करना पड़) जगहचैम्बर के लिए.
- पिपेट केशिका क्रिया के माध्यम से केंद्रीय गर्त में 100 μl ताजा EFH SFM या FBS SFM.
- वैक्यूम तेल का उपयोग करने के लिए केंद्रीय गर्त के प्रत्येक के अंत पर संस्कृति मीडिया के पूल के लिए सीमाओं को बनाने के लिए, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है.
- दो पीवीसी टयूबिंग के 15 सेमी टुकड़े काटें, और एक 18 गेज सुई के साथ एक 10 सीसी सिरिंज का उपयोग करने के लिए ध्यान टयूबिंग में agarose समाधान इंजेक्षन, यह सुनिश्चित करने के कोई ट्यूबों में बुलबुले के रूप में, और 5 मिनट के लिए जेल जमना करने के लिए अनुमति देते हैं.
- जीना सेल इमेजिंग प्रणाली स्थानांतरण galvanotaxis कक्ष agarose जेल ट्यूबों, एजी / AgCl इलेक्ट्रोड, और खाली 60 मिमी पेट्री डिश है कि संस्कृति मीडिया जलाशयों के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा की एक जोड़ी के साथ और एजी / AgCl इलेक्ट्रोड शामिल होंगे. Galvanotaxis कक्ष 37 के भीतर आराम करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस, 20-30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 पर्यावरण.
- इस समय के दौरान, ड्रिलिंग छेद से 2 खाली पेट्री डिश के lids और galvanotaxis कक्ष पेट्री डिश के ढक्कन तैयारमें उन्हें एक Dremel या इसी तरह के उपकरण के रूप में 3 चित्र में दिखाया.
- पिपेट केंद्रीय गर्त के दोनों ओर पर 1-1.5 EFH SFM या FBS - SFM की मिली, और प्रत्येक खाली पेट्री डिश में SFM की 7-8 मिलीलीटर. प्रत्येक पकवान में galvanotaxis कक्ष केंद्रीय गर्त और जगह एक एजी / AgCl इलेक्ट्रोड के प्रत्येक पक्ष पर एक जगह पेट्री डिश. ब्रिज galvanotaxis चैम्बर और पेट्री डिश agarose जेल पुलों के साथ बिजली निरंतरता स्थापित करने के बीच अंतर है, के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है.
- एजी / AgCl इलेक्ट्रोड कनेक्ट एक बाहरी बिजली की आपूर्ति करने के लिए, बिजली वर्तमान को मापने के लिए श्रृंखला में एक ammeter के साथ, और बिजली की आपूर्ति पर बारी. एक वाल्टमीटर का उपयोग करने के लिए सीधे केंद्रीय गर्त भर में बिजली क्षेत्र की शक्ति को मापने के लिए, और बिजली की आपूर्ति के उत्पादन को समायोजित जब तक वांछित बिजली के क्षेत्र में ताकत हासिल की है (इस प्रयोगशाला में प्रदर्शन assays के साथ 250 मिमी mV / dcEF शक्ति का उपयोग मा 1 और 1.5 के बीच बिजली के वर्तमान).
- पहलजीना सेल इमेजिंग प्रणाली पर ते मॉड्यूल समय चूक, और समय के वांछित राशि के लिए चलाने के लिए प्रयोग की अनुमति. परख के पूरा होने के बाद, मानक immunostaining विश्लेषण के लिए 4% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक.
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Representative Results
कीनेमेटीक्स विश्लेषण से पता चलता है कि एक 250 mV / मिमी dcEF की उपस्थिति में, undifferentiated NPCs प्रदर्शन कैथोड की ओर निर्देशित अत्यधिक और तेजी galvanotaxis (चित्रा 5A, 1 मूवी). एक dcEF के अभाव में कोशिकाओं की अनियमित आंदोलन (चित्रा 5B, मूवी 2) मनाया जाता है. इस क्षेत्र की ताकत, जिसके लिए वे हैं imaged पूरे 6-8 घंटा के लिए> undifferentiated NPCs के 98% विस्थापित हो, और के बाद से मृत कोशिकाओं को पलायन नहीं करती यह पता चलता है कि वे अभाव या एक dcEF की उपस्थिति में इस अवधि के दौरान व्यवहार्य रहेगा.
विभेदित phenotypes दोनों उपस्थिति और एक dcEF की अनुपस्थिति (3 सिनेमा, 4) में नगण्य प्रवास गुजरना. विभेदित कोशिकाओं के सबसेट प्रक्रियाओं है कि dcEF की दिशा को सीधा संरेखित करें जाते हैं का विस्तार, लेकिन कोई ध्यान सेल शरीर स्थानान्तरण मनाया जाता है.
Immunostaining पुष्टि है कि NPCs सकारात्मक expressio बनाए रखनेn dcEF जोखिम (6A चित्रा) के 6 घंटा के बाद तंत्रिका अग्रदूत साबित मार्कर nestin की. परिपक्व phenotypes में अंतर करने के लिए प्रेरित किया NPCs को शामिल assays में कोशिकाओं के बहुमत dcEF जोखिम (चित्रा 6B) के 6 घंटे के बाद परिपक्व astrocyte मार्कर glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) व्यक्त करते हैं.
प्राथमिक एंटीबॉडी इन विश्लेषण में इस्तेमाल के रूप में इस प्रकार थे: माउस मोनोक्लोनल विरोधी nestin (1:400, Millipore, कनाडा), और खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी GFAP (1:500, सिग्मा, कनाडा). माध्यमिक एंटीबॉडी इन विश्लेषण में इस्तेमाल के रूप में इस प्रकार थे: बकरी विरोधी माउस Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen Gibco, कनाडा) के साथ संयुग्मित, और बकरी विरोधी खरगोश 488 Alexafluor के साथ संयुग्मित (1:400, Invitrogen Gibco , कनाडा).
चित्रा 1. Neurospheres Matrigel सब्सट्रेट और dissoci पालनएकल 37 ° / सी 5% 2 सीओ, 100% आर्द्रता EFH-SFM में ऊष्मायन 17 घंटा के बाद कोशिकाओं में खाया.
चित्रा 2 galvanotaxis चैम्बर के चित्रण. वैक्यूम तेल के स्ट्रिप्स केंद्रीय गर्त के दोनों तरफ संस्कृति मीडिया के एक पूल बनाने के लिए किया जाता है.
चित्रा 3 छेद है कि galvanotaxis चैम्बर और संस्कृति के माध्यम जलाशयों lids में drilled किया जाना चाहिए की योजनाबद्ध. दोनों lids में 7 मिमी व्यास छेद agarose जेल ट्यूबों को सम्मिलित किया जाता है. Galvanotaxis चैम्बर के ढक्कन में 4 मिमी व्यास छेद सीधे केंद्रीय गर्त भर में बिजली क्षमता एक वाल्टमीटर का उपयोग को मापने के लिए किया जाता है. संस्कृति के माध्यम पुनः के ढक्कन में 4 मिमी व्यास छेदservoir एजी / AgCl इलेक्ट्रोड पकवान के ढक्कन से बिजली की आपूर्ति करने के लिए कनेक्शन के लिए बढ़ाना अनुमति है.
चित्रा 4 galvanotaxis समय चूक इमेजिंग के लिए चैम्बर विधानसभा के चित्रण. galvanotaxis चैम्बर केंद्रीय पेट्री डिश है, जो कोशिकाओं में चढ़ाया जाता है. केंद्रीय पेट्री डिश आवास के अंदर मीडिया galvanotaxis कक्ष भी SFM + EFH या SFM FBS 1% +. Galvanotaxis चैम्बर के दोनों तरफ पेट्री डिश SFM से भर रहे हैं, और भी एजी / AgCl इलेक्ट्रोड होते. ये इलेक्ट्रोड एक बाहरी बिजली की आपूर्ति से जुड़े हैं, और agarose जेल पुलों के साथ तीन पेट्री डिश ब्रिजिंग एक पूरी सर्किट रूपों.
5 presen में यह आंकड़ा.एक dcEF undifferentiated NPCs CE कैथोड (ए) की ओर तेजी से galvanotactic प्रवास से गुजरना है, जबकि एक dcEF की अनुपस्थिति में कोशिकाओं यादृच्छिक रेडियल माइग्रेशन (बी) से गुजरना.
चित्रा 6 Immunostaining पुष्टि कि NPCs dcEF जोखिम (ए) के 6 घंटा के बाद nestin सकारात्मक undifferentiated व्यापारियों रहते हैं, और कि NPCs ज्यादातर अंतर के लिए प्रेरित है (बी) dcEF जोखिम के 6 घंटा के बाद परिपक्व astrocyte मार्कर GFAP व्यक्त.
मूवी 1 undifferentiated एक dcEF को उजागर NPCs के समय चूक वीडियो. NPCs SFM + EFH में 17 घंटा लिए galvanotaxis कक्षों पर चढ़ाया, और तो एक 250 कैथोड ओर mV / मिमी dcEF प्रदर्शनी तेजी से और निर्देशित प्रवास उजागर. वीडियो के 2 1 = 15 मिनट वास्तविक समय यहाँ क्लिक मो देखनेहोड़ करना.
मूवी 2. एक dcEF के अभाव में समय चूक undifferentiated NPCs के वीडियो. NPCs SFM + EFH में 17 घंटा लिए galvanotaxis कक्षों पर चढ़ाया, और फिर एक आवेदन dcEF के अभाव में imaged यादृच्छिक प्रवास से गुजरना. वीडियो के 2 1 = 15 मिनट वास्तविक समय फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
मूवी 3. विभेदित एक dcEF संपर्क NPCs के समय चूक वीडियो. NPCs SFM + FBS में 69-72 घंटा लिए galvanotaxis कक्षों पर चढ़ाया, और फिर 250 mV / मिमी किसी भी दिशा में dcEF प्रदर्शनी बहुत कम प्रवास को अवगत कराया. वीडियो के 2 1 = 15 मिनट वास्तविक समय फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
मूवी 4 एक dcEF के अभाव में समय चूक विभेदित NPCs के वीडियो. Galvanotaxis चा पर चढ़ाया NPCsmbers SFM + FBS में 69-72 घंटे के लिए और फिर एक आवेदन dcEF के अभाव में imaged किसी भी दिशा, विभेदित NPCs कि एक dcEF को उजागर कर रहे हैं के लिए इसी तरह के प्रदर्शन में बहुत कम प्रवास. वीडियो के 2 1 = 15 मिनट वास्तविक समय फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
इस प्रोटोकॉल पिछले 7-9 अध्ययन के अच्छी तरह से स्थापित तरीकों से अनुकूलित किया गया है. Galvanotactic कक्षों सेल बोने के कारावास या केंद्रीय 10,11 गर्त की microfabrication के लिए सीओ 2 लेजर पृथक का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से एक अलग कांच के निर्माण सहित विभिन्न तकनीकों के एक किस्म का उपयोग कर निर्माण किया जा सकता है. कुछ तकनीकों अधिक श्रमसाध्य या दूसरों की तुलना में महंगा हो सकता है. हम एक एनपीसी galvanotaxis सामान्यतः सबसे कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में पाया सामग्री का उपयोग कर कक्ष के निर्माण के लिए एक सरल और लागत प्रभावी परख वर्णित है. हमारा प्रोटोकॉल एक गरम humidified, सीओ 2 विनियमित इनक्यूबेटर कि चारों ओर से घेरे जीना सेल इमेजिंग इष्टतम शर्तों के तहत निरंतर इमेजिंग लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने प्रणाली शामिल हैं. ऐसे तंत्र की कमी के कारण कुछ पहले प्रकाशित 9,12 तकनीक की एक सीमा है.
एक समूह द्वारा हाल ही में काम समान गल्वा का प्रदर्शनएक hippocampal सेल लाइन 13 से कोशिकाओं के notactic व्यवहार, एक अलग प्रोटोकॉल और एक अधिक श्रम गहन galvanotaxis कक्ष डिजाइन का उपयोग कर. Undifferentiated neurosphere व्युत्पन्न NPCs के प्राथमिक सेल संस्कृतियों - हमारी परख विशेष रूप से सुंदर है कि यह कोशिकाओं के समान शुरू जनसंख्या का एक विश्लेषण परमिट है कि अलग जिससे दोनों undifferentiated और विभेदित कोशिकाओं के प्रवासी गुणों की एक तुलना की अनुमति की स्थिति को उजागर किया गया है, संस्कृति मीडिया galvanotaxis कक्ष के भीतर पूरक इस्तेमाल किया कारकों को संशोधित करके बस.
इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत परख लंबी अवधि के ट्रैकिंग और एनपीसी galvanotaxis के विश्लेषण, और संभवतः अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है कि galvanotactic 14,15 प्रवास से गुजरना है. किसी भी प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, इस प्रोटोकॉल में कुछ कदम की तैयारी और क्रियान्वयन में बारीकियों असफल परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. निम्नलिखित दिशा निर्देशों और सुझावों के रूप में होना चाहिएइस प्रोटोकॉल के सफल क्रियान्वयन में sist:
- बिजली गर्मी वर्तमान से जुड़े मौत के दौर से गुजर से कोशिकाओं को रोकने, galvanotaxis चैम्बर के आयाम जौल 16 हीटिंग के प्रभाव को कम करने के लिए की गई है. चैम्बर में उत्पन्न गर्मी इसके माध्यम से बह वर्तमान के वर्ग है, जो बारी galvanotaxis चैम्बर के पार के अनुभागीय क्षेत्र के लिए आनुपातिक है आनुपातिक है. हम 2.04 2 मिमी (12 मिमी x 0.17 मिमी) के रूप चैम्बर के पार के अनुभागीय क्षेत्र को बनाए रखने की सलाह है.
- संस्कृति neurospheres के 7 दिनों के बाद एकत्र किया जा सकता है एकल कक्षों में अलग और वृद्धि के कारक की स्थिति में replated (एक प्रक्रिया 'passaging' के रूप में करने के लिए भेजा) माध्यमिक neurospheres उपज. हम हमारी सबसे अच्छा परिणाम neurospheres है कि कम से कम तीन मार्ग से गुजरा है (संस्कृति में अधिकतम 21 दिन) का उपयोग करते हुए, प्रवासी क्षमताओं में एक दृश्य गिरावट के साथ जब neurospheres कि एक बड़ा numbe passaged प्राप्तसमय की आर. यह हमारे पिछले काम के साथ प्रदर्शित किया है कि लंबी अवधि संस्कृतियों सेल कैनेटीक्स 17 को बदल अनुरूप है.
- जब एक galvanotaxis अवलोकन के लिए NPCs युक्त कक्ष का चयन, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए एक कक्ष का चयन करें जिसमें neurosphere व्युत्पन्न कोशिकाओं dissociated अच्छी तरह से क्रम में सटीक कीनेमेटीक्स विश्लेषण की अनुमति. यदि neurospheres अच्छी तरह से अलग नहीं है (NPCs एक दूसरे से पालन कर रहे हैं और नहीं चित्रित किया जा सकता है), व्यक्तिगत सेल प्रवासी व्यवहार के विश्लेषण लगभग असंभव हो जाएगा. संस्कृतियों का अवलोकन करने से पहले अलग कर देना और अधिक समय दिया जाना चाहिए. इसके अलावा, कोशिकाओं है कि एक दूसरे के करीब निकटता में हैं शारीरिक रूप से पड़ोसी की कोशिकाओं के प्रवास में बाधा डालती कर सकते हैं. हमारे विश्लेषण से पता चला है कि कम से कम एक सेल शरीर उनके पास पड़ोसी सेल से दूर तैनात कोशिकाओं कोशिकाओं है कि एक साथ अलग neurosphere के केंद्र के पास clustered रहे हैं की तुलना में काफी अधिक वेग पर बराबर सख्त साथ यद्यपि, विस्थापितctedness.
- अगर वहाँ NPCs से देने की प्रक्रिया का एक बहुतायत है, यह एक संकेत है कि कोशिकाओं को अलग करने शुरू कर दिया है और इसलिए वे एक undifferentiated आबादी की एक सही प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं. तीन प्रतियों में galvanotaxis कक्षों की तैयारी का एक लाभ यह है कि शेष दो कक्षों समय चूक इमेजिंग के लिए चयनित नहीं हैं कि उनके incubated चढ़ाना अवधि (2.16 चरण) के बाद तुरंत तय कर सकते हैं, और कोशिकाओं के भेदभाव प्रोफाइल को सत्यापित immunostained.
- इष्टतम परिणामों के लिए संस्कृति मीडिया हौसले से तैयार है और प्रत्येक दिन है कि यह आवश्यक है पर पूरक होना चाहिए.
- समय चूक छवियों और बाद कीनेमेटीक्स विश्लेषण अत्यधिक नमूना की गड़बड़ी के प्रति संवेदनशील हैं. जीवित कोशिका इमेजिंग खुर्दबीन कंपन को कम करने के लिए एक हवा की मेज पर रखा जाना चाहिए, और प्रणाली के प्रयोग के दौरान परेशान नहीं करना चाहिए.
हमारी प्रयोगशाला नियमित तौर पर छवियों एनपीसी galvanot6-8 घंटे के लिए अक्ष, हालांकि 15-घंटे विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. 15-घंटे की अवधि के दौरान, चैम्बर भर में dcEF mV मिमी / 250 से 227 mV / mm (9.2% कमी) करने के लिए मना कर दिया. अब इमेजिंग अवधि अनिवार्य रूप से कक्ष में मीडिया का पीएच को संशोधित, और बिजली के क्षेत्र को संशोधित. इस प्रकार यह करने के लिए मीडिया को लगभग हर 6 घंटा की जगह के लिए सिफारिश की है. हालांकि, हम मीडिया प्रतिस्थापन के बिना 8 घंटा एनपीसी galvanotaxis assays प्रदर्शन किया है और किसी भी ध्यान देने योग्य सेल मृत्यु (मृत कोशिकाओं को पलायन नहीं करती) या सेल गतिशीलता में गिरावट देखा नहीं, कोशिकाओं के प्रयोग भर में अपने प्रवास के वेग को बनाए रखने. अन्वेषक भी चैम्बर की गहराई को कम करने के लिए 10 dcEF की स्थिरता में वृद्धि हो सकती है.
इमेजिंग के बाद, एकल कोशिका कीनेमेटीक्स ट्रैकिंग विश्लेषण imaged Zeiss AxioVision सॉफ्टवेयर ट्रैकिंग मॉड्यूल का उपयोग कोशिकाओं की एक सबसेट पर किया जाता है. कोशिकाओं को विश्लेषण के लिए चुना जाता है अगर वे के किनारे के करीब स्थानीयकृत हैंdissociated neurosphere और कम से कम एक सेल अपने निकटतम सेल से अलग शरीर. इस के पीछे तर्क के लिए ट्रैकिंग के दौरान एक दूसरे अतिव्यापी कोशिकाओं की संभावना को कम करने के लिए है, जो असंभव के पास व्यक्तिगत कोशिकाओं ट्रैकिंग करना होगा है. हम प्रवास के निम्नलिखित चार मापदंडों का विश्लेषण:
- X-अक्ष विस्थापन - दूरी धुरी है, जो dcEF की दिशा के समानांतर है की दिशा में एक सेल migrates.
- वेग - प्रारंभिक और अंतिम सेल गुजरे समय से विभाजित पदों के बीच सीधे लाइन दूरी.
- Directedness x-अक्ष विस्थापन प्रारंभिक और अंतिम सेल पदों के बीच सीधे लाइन दूरी से विभाजित.
- टेढ़ा - मेढ़ापन कुल पथ दूरी प्रारंभिक और अंतिम सेल पदों के बीच सीधे लाइन दूरी द्वारा विभाजित सेल से कूच.
बाद के दो मापदंडों कैसे सीधे माइग्रेशन मार्ग एक विशेष दिशा में संकेतक हैं.
18 प्रयोग के दौरान निरंतर केंद्रीय गर्त के भीतर ताजा संस्कृति मीडिया के पार छिड़काव की अनुमति. एक उपयुक्त सब्सट्रेट और संस्कृति मीडिया अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए चुना जाना चाहिए, और सेल इमेजिंग पहले बोने की अवधि के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, चैम्बर के आयाम ऊतक (उदाहरण के लिए, अगर एक ऊतक टुकड़ा कक्ष में रखा है) की जांच की जा रही है की मोटाई के आधार पर संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. अन्वेषक मन में रखना चाहिए थाटी, एक सेट बिजली क्षेत्र के लिए कक्ष के माध्यम से वर्तमान प्रवाह सीधे चैम्बर के पार के अनुभागीय क्षेत्र के लिए आनुपातिक है, और इसलिए चैम्बर के आयामों के लिए महत्वपूर्ण enlargements बढ़ जौल सेल हीटिंग से संबंधित मौत में परिणाम हो सकता है.
इस रिपोर्ट में वर्णित तकनीकों महत्वपूर्ण जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं, लेकिन व्यापक रूप से अध्ययन नहीं, galvanotaxis की घटना. कोशिकाओं की क्षमता को dcEFs के लिए जवाब प्रत्यक्ष उपचारात्मक प्रभाव पड़ता है. विद्युत उत्तेजना (गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन) पहले से ही पार्किंसंस रोग के उपचार में उपयोगी साबित हो, और एक माउस 19,20 मॉडल में hippocampal neurogenesis को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है. सेलुलर सेलुलर गतिशीलता में dcEF पारगमन के लिए जिम्मेदार तंत्र की एक पूरी समझ के अंत में बिजली की उत्तेजना बढ़ाने और अंतर्जात अग्रदूत माइग्रेशन निर्देशन चोट या disea की साइटों के लिए एक नैदानिक साधन के रूप में उपयोग करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंसे मरम्मत की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए. तरीकों ऊपर वर्णित इन प्रक्रियाओं की जांच करने का एक सरल और मजबूत तरीका प्रदान करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल (अनुदान 249669 # # और 482,986) और हार्ट और स्ट्रोक फाउंडेशन कनाडा (अनुदान ४८५५०८ #) द्वारा वित्त पोषित है. लेखकों प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को विकसित करने में उनकी सहायता के लिए एल हायेक Youssef और डॉ. क्यूई वान धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
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References
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