外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

Summary

このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。

Abstract

哺乳類成体脳における神経幹細胞および前駆細胞の発見（以下総称して呼ばれる神経前駆細胞）（NPCは）神経再生戦略の開発のため、これらの細胞の多能性や増殖特性を利用することを目的とした研究の本体につながっている。そのような戦略の成功のための重要なステップは、外因性の移植後の病変部位に向かってNPCの動員であるかCNSの脳室周囲白質領域で発見された内因性の前駆体の応答を増強する。したがって、それは、推進導き、NPCの移行を強化するメカニズムを理解することが不可欠です。走電性として知られている現象 - 私たちの仕事は、NPCの移行を促進し、指示するために直流電界の利用（dcEFs）に焦点を当てています。内因性の生理的な電界が正常な発達と創傷修復中に細胞遊走のための重要な手がかりとして機能する。の薬理学的混乱アホロートル胚におけるトランス神経管電位は重度の発達奇形^1を引き起こします。このDCEF ^2-3の薬理強化や中断によって示されるように、創傷治癒のコンテキストでは、傷ついた角膜の修復速度が直接、損傷後生じる上皮創傷電位の大きさと相関している。我々は、外部から印加されたDCEFにさらされたときに成人上衣下NPCが試験管内で迅速かつ監督陰極移行を受けることを明らかにした。このプロトコルでは、高分解能、単一細胞レベルでディレク細胞体転座（マイグレーション）の長期観測のためのシンプルで効果的な走電性アッセイを作成するために私たちの研究室の手法について説明します。このアッセイは、トランスジェニックやノックアウトマウスでは、短鎖干渉RNA、または特定の受容体アゴニスト/アンタゴニストの使用を介して細胞の運動性にdCEFの伝達を制御するメカニズムを調査に適しているであろう。

Protocol

動物の取り扱いに関係するすべての手順は、制度ガイドライン（プロトコルはありません。20009387）に従い、トロント動物ケア委員会の大学によって承認された。次のメソッドは、該当する場合、層流フードで、無菌のツールやテクニックを使用して実行されるべきである。

以下のプロトコルのテキストでは、フレーズ "EFH-SFMは"上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子とヘパリンを補充無血清培地を指します。これらのマイトジェンは、未分化状態の⁴のNPCを維持するため、未分化NPCの走電性を調査するときEFH-SFMは使用されています。成熟細胞型に分化するように誘導NPCの走電性を調べるときは、 "FBS-SFMは、" 1％ウシ胎児血清を添加した無血清培地を指します。 FBSは、成熟した神経表現型⁵にNPCの分化を促進する。

1。神経前駆細胞の単離および培養（ない）映像に示すように

1. 頸椎脱臼経由イソフルランと犠牲とCD1マウス（6-8週齢）Anaesthetize。
2. 70％エタノールでヘッドを消すと鋭い解剖ハサミで動物を斬る。
3. 外科手術用鉗子で頭を押さえながら、頭蓋骨を露出するために背側表面に皮膚を削除します。
4. メスとNOを使用。 11ブレードは、中外軸に沿って、またrostrocaudal方向に矢状縫合に沿って前頭洞で頭蓋骨を獲得。
5. 離れていないと頭から頭頂骨をはがします。 7曲がった鉗子ではなく、ピアス脳組織に世話をして。
6. 小脳の下から開始し、嗅球に向かって進ん脳の下の薄いへらを挿入します。鉗子で適所に頭蓋骨を押さえながら、そっと頭蓋骨から脳を引くとすぐに氷のように冷たい人工脳脊髄液（以下のレシピを参照してください）​​に入れてください。
7. 解剖顕微鏡下では、無菌の使用解剖用はさみや鉗子は正中線に沿って半分に脳を切った。内側（カット）面が上方を向くようにそれぞれの半球を回転させます。
8. 半球を選択して、内側面を上に向けて、脳梁（脳梁の後部領域）の膨大部を見つけます。
9. 皮質の表面からの背腹軸に沿って脳梁膨大部への切り込みを入れる。
10. 側脳室の内側と外側の壁を露出させるために嗅球に向かって切開皮質ピール。
11. 背面が上方を向くように半球を回転させたり、切り取ってNPCが^6に存在する脳室周囲白質領域が含まれている露出した内側と外側の壁を収集するために湾曲したmicroscissorsを使用しています。
12. 他の半球の手順1.8から1.11までを繰り返します。
13. 15ccのチューブ内のトリプシン溶液（下記レシピを参照してください）​​の7ミリリットルに単離された組織をピペットで、37°C​​でロッカー上にチューブを配置25分間インキュベーター。
14. 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、上清を吸引し、（下のレシピを参照してください）​​トリプシンインヒビター溶液2mlに組織を再懸濁する。
15. ゆっくり気泡を避けるために慎重に小さなボーリング孔パスツールピペット30から50回で組織をひいて粉にする。
16. 、5分間1,500 rpmでチューブを遠心し上清を吸引し、ペレットを3-5回摩砕することにより、SFM中1-2ミリリットル（下のレシピを参照してください）​​に再懸濁します。
17. 3分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、SFMの1ミリリットル+ EFHで清と再懸濁を吸引除去する。
18. SFM + EFHでμlあたり10細胞の密度でT25培養フラスコ内の血球とプレート細胞と生細胞密度をカウントします。
19. 文化はNPCに成る自由浮動プライマリーニューロスフィアを得るのに邪魔されずに7日間成長することができます。

2。走電性商工会議所の準備

1. NO 3正方形のガラスを置きます。 1カバースリップ（22×22×0.17ミリメートル）は、i一晩の6N塩酸Naのボトル。
2. 翌日には、正方形の無からのガラスの6短冊（22×5×0.17ミリメートル）をカットするダイヤモンドチップガラスカッターを使用しています。 1カバースリップ。
3. 層流フード内に酸洗浄した正方形と長方形のスリップスリップを転送します。組織培養グレードの水でオートクレーブした後、70％エタノールを持つ最初の長方形と正方形のストリップを洗い、拭いてキムに乾燥することができます（追加された不妊のため、ガラスは空気乾燥させることができる）。
4. 正方形のガラススライドの一方の面の周囲に真空グリースを塗布し、60ミリメートルプラスチックペトリ皿の底にそれらを封印。
5. 長方形のガラス片の一方の面の長軸に沿って、真空グリースを塗布し、中央の谷を作成するために正方形のガラススライドの反対側のエッジ（彼らが互いに平行となるように）にそれらを封印。
6. 層流フード内に少なくとも15分間のチャンバを紫外線殺菌。
7. ポリ-L-lysiの250から300μlのピペット2時間室温でインキュベート室及び中央トラフの上にね。
8. 潜伏期間の終了前の約15分間は、（下のレシピを参照してください）​​マトリゲル溶液を調製します。
9. ポリ-L-リジンを吸引除去し、オートクレーブ滅菌水1ml、中央谷の上にマトリゲル溶液をピペット250から300μlで中央の谷を洗います。
10. 1時間37℃でチャンバーをインキュベートする。
11. マトリゲルの液を除き、穏やかに、SFM中1-2 mlの中央谷を洗う。
12. 中央の谷へEFH-SFMまたはFBS-SFMの各々100μL添加し、カウントを顕微鏡のステージ上に走電性チャンバーを転送します。
13. ピペット3月4日60ミリメートルペトリ皿に神経球含有培養mlのはカウント顕微鏡のステージにシャーレを転送します。
14. 5倍の視聴目的で、それぞれの走電性の中心トラフに5月8日全神経球（最大4時）に転送するためにP10のピペットを使用それらを解離させずにチャンバー、慎重マトリゲル基板を中断せずに、中央の谷の周りの神経球を広げた。
15. 中央の谷にEFH-SFMまたはFBS-SFMの追加の150から200μlを添加する。
16. 37℃、5％CO _2、17から20時間後には100％の加湿インキュベーターに走電性チャンバを転送（もし未分化のNPCを分析）を図1に示すように、ニューロスフィアは、マトリゲル基板に付着し、単一細胞に解離できるようにする。差別化されたNPCを分析する場合、潜伏期間は、細胞の分化を可能にするために69から72時間に延長すべきである。

3。細胞タイムラプスイメージングを生きる

1. ライブセルイメージングシステムは、37℃で平衡化させ℃、5％前タイムラプス撮影開始までの30分の最小のCO _2。
2. 一方の端部から直径1mmのシルバーワイヤー、コイルふたり12cmの部分をカットし、クロロックスbにそれらを配置する銀/塩化銀電極を形成するために、20分間浸出する。
3. 計数顕微鏡のステージ上に走電性室を移し、次の基準に基づいてライブセルイメージングの移行解析のために使用される室を選択します：i）ニューロスフィアは、単一細胞にほぼ完全に解離しなければならないと、ii）細胞が持っている必要があり少しツーないプロセスと丸い形態は、細胞体から伸びる。
4. 別の方形な​​いとともに、層流フードに選択された走電性チャンバーを転送します。 1ガラスカバースリップと真空グリース。
5. オートクレーブした水で、次に70％エタノールを用いて第一滑り、カバースリップの2つの平行な辺に真空グリースのストリップを適用するカバーを洗う。
6. 、室の中央トラフから培地を吸引除去した後すぐに2つの平行な矩形状のガラス片にグリスストリップの残りの部分は、効果的に屋根を作成するようなチャンバー上にカバースリップ（グリース側を下に向け）を配置室へ。
7. 毛細管現象を介して中央の谷に新鮮EFH-SFMまたはFBS-SFMの各々100μL添加します。
8. 図2に示すように、中央の溝の両端に培地のプールの境界線を作成するために真空グリースを使用しています。
9. PVCチューブの2 15cmの部分をカットし、丁寧に泡がチューブ内に形成されないの確保、チューブにアガロース溶液を注入する18ゲージの針で10ccのシリンジを使用し、ゲルを5分間凝固させる。
10. アガロースゲルチューブ、銀/塩化銀電極、および培養培地リザーバーとして使用される空の60ミリメートルペトリ皿のペアと一緒に、ライブセルイメージングシステムへの走電性チャンバーを転送したAg / AgCl電極を含んでいます。走電性チャンバーは37内に物を置か℃、20〜30分間、5％CO ₂環境。
11. この時間の間に、ドリルで穴を開けることによって2つの空のペトリ皿のふたと走電性室のペトリ皿の蓋を準備それらの中に、図3に示すように、ドレメルまたは同様のツールを持つ。
12. ピペット中央谷の両側の上EFH-SFMまたはFBS-SFMは1〜1.5 mlを加え、それぞれの空のシャーレにSFM 7-8 mlであった。各皿に走電性チャンバーの中央トラフと場所1 Ag / AgCl電極の両側に1つ配置シャーレ。 図4に示すように、アガロースゲルブリッジとの電気的導通を確立するために、走電性チャンバー、ペトリ皿とのギャップを埋める。
13. 電流を測定するために直列に電流計で、外部電源に銀/塩化銀電極を接続し、電源をオンにします。所望の電界強度が達成されるまで、直接中央谷を横切って電界強度を測定し、電源の出力を調整するために電圧計を使用します（このラボで行わアッセイはで250 mVの/ mmのdCEFの強みを活かし1と1.5ミリアンペア）の間に電流。
14. イニシアTEは、タイムラプスライブセルイメージングシステム上のモジュール、および実験は、目的の時間のために実行することができます。検定終了後、標準の免疫染色解析のため、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。

Representative Results

キネマティック解析は、250 mVの/ミリメートルDCEFの存在下で、未分化なNPCが陰極に向かって非常に導かれ、急速な走電性（ 図5A、映画1）を示すことが明らかになった。 DCEFの非存在下では、細胞のランダムな動きが（ 図5B、ムービー2）が観察された。この電界強度では、未分化のNPCの> 98％が撮像されているために全体の6〜8時間のために移行し、死細胞は移行されませんので、これは彼らがdCEFの非存在下または存在下で、この期間中に生き続けることを示唆している。

差別化された表現型は、両方の存在およびdCEFの不在（ 作品3、4）は無視できるマイグレーションを受ける。分化した細胞のサブセットは、dCEFの方向に対して垂直に整列する傾向があるプロセスを拡張しますが、目立った細胞体の転座は観察されない。

免疫染色では、NPCが正expressioを維持していることを検証N DCEF露光（ 図6A）の6時間後の神経前駆マーカーネスチンの。成熟した表現型に分化するように誘導NPCを含むアッセイでは、細胞の大多数は、dCEF露光（ 図6B）の6時間後に成熟したアストロサイトマーカーグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を発現する。

これらの分析で使用した一次抗体は以下の通りであった：マウスモノクローナル抗ネスチン（1:400、ミリポア、カナダ）、およびウサギポリクローナル抗GFAP（1:500、Sigma社、カナダ）。 Alexafluor 568（1:400、インビトロジェン-Gibco社、カナダ）とヤギ抗マウスコンジュゲート、およびヤギ抗ウサギ共役Alexafluor 488と（1:400、インビトロジェン-ギブコ：これらの分析に使用される二次抗体は以下のとおりであった、カナダ）。

図1は、ニューロスフェアマトリゲル基板とdissociに付着37℃/ 5％CO _2で 、EFH-SFMで湿度100％でのインキュベーションの17時間に続いて単一細胞に食べました。

図2走電性チャンバーのイラスト。真空グリースのストリップは、中央の谷の両側に培地のプールを作成するために使用されます。

図3走電性蓋チャンバおよび培地の貯水池にあけなければならない穴の模式図。両方の蓋で直径7mmの穴をアガロースゲルチューブを挿入するために使用されています。走電性チャンバーの蓋に直径4mmの穴が電圧計を使用して、中央の谷を横切って直接電位を測定するために使用されます。培地の再の蓋に直径4mmの穴servoirはAg / AgCl電極を電源に接続するための皿の蓋から突出するようにすることです。

図4タイムラプスイメージングのための走電性チャンバアセンブリのイラスト。走電性チャンバーは、細胞がメッキされている中央のシャーレです。中央のシャーレハウジング内部にメディアが走電性チャンバーは、SFM + EFHまたはSFM + 1％FBSのどちらかです。走電性チャンバーの両側にペトリ皿をSFMで満たされ、また、銀/塩化銀電極を含んでいます。これらの電極は、外部電源に接続され、アガロースゲルブリッジと3ペトリ皿を埋めることは、完全な回路を形成している。

図5。プレゼンでdCEFの非存在下で細胞がランダム放射状移動（B）を受けるのに対し、未分化DCEF NPCのceは、カソード（）に向かって急速galvanotacticの移行を受けています。

図6：免疫染色では、そのNPCがdCEFの露光（）の6時間後にネスチン陽性未分化前駆体のままであり、主に分化するように誘導され、そのNPCがdCEFの露光（B）の6時間後に成熟したアストロサイトマーカーGFAPを発現するかどうかを検証します。

DCEFにさらされる未分化のNPCの動画1。タイムラプスビデオ。 NPCは、SFM + EFHで17時間走電性チャンバー上に播種し、次に陰極に向かって250 mVの/ミリメートルDCEF展示迅速かつ監督移行にさらされる。ビデオの1秒= 15分リアルタイムで。 moを表示するにはここをクリック争う。

dCEFの非存在下で未分化のNPCのムービー2。タイムラプスビデオ。 NPCは、SFM + EFHで17時間走電性チャンバー上に播種し、次に応用DCEFの不在で結像される、ランダムな移行を受ける。ビデオの1秒= 15分リアルタイムで。 ムービーを見るにはここをクリック 。

DCEFにさらされ、差別のNPCのムービー3。タイムラプスビデオ。 NPCは、SFM + FBS中で69から72時間走電性チャンバー上に播種した後、任意の方向に250 mVの/ミリメートルDCEFの展示はほとんど移行にさらされる。ビデオの1秒= 15分リアルタイムで。 ムービーを見るにはここをクリック 。

DCEFに不在で差別化されたNPCのムービー4。タイムラプスビデオ。走電性chaの上にメッキのNPC応用DCEFの不在下で撮像された後、SFM + FBS中で69から72時間、mbers、とは、dCEFに晒されており、差別化のNPCと同様に、任意の方向にはほとんど移行を示す。ビデオの1秒= 15分リアルタイムで。 ムービーを見るにはここをクリック 。

Discussion

このプロトコルは、先行研究^7-9のよく確立された方法の中から適応されています。 Galvanotactic室は、細胞播種の閉じ込めのためのよく独立したガラス張りの建設を含むさまざまなテクニック、のさまざまな方法を使って、または中央トラフ^10,11の微細加工にCO ₂レーザーアブレーション法を用いて構築することができる。いくつかのテクニックは他よりも面倒でコストのかかるかもしれません。我々は一般的にほとんどの細胞生物学研究室で見つかった材料を使用してNPCの走電性チャンバーを構築するための簡単​​かつ費用対効果の高いアッセイを記載している。我々のプロトコルは、継続的な長期的イメージングのために最適な条件で細胞を維持するために、ライブセルイメージングシステムを囲む、加湿、加熱されたCO ₂インキュベーターレギュが含まれています。このような装置の欠如は、いくつかの以前に発行された技術は^9,12の制限です。

別のグループによる最近の研究では同様のガルバを実証異なるプロトコルや、その他の労働集約型の走電性チャンバー設計を使用して海馬細胞ライン¹³からの細胞の挙動notactic、。未分化神経球由来のNPCの初代細胞培養 - - それによって未分化細胞および分化の両方の細胞の遊走特性の比較を可能にする明確な条件にさらされてきた、我々のアッセイは、細胞の同一の出発集団の分析を可能にするという点で、特にエレガントです単に走電性チャンバ内の培地を補うために使用される要素を変更することによって。

このプロトコルで提示アッセイは、NPC走電性、およびおそらくgalvanotactic移行^14,15を受ける他の細胞型の長期追跡および分析するための強力なツールです。任意のプロトコルと同様に、このプロトコルの特定のステップの準備と実行のニュアンスは、失敗の結果につながる可能性があります。次のガイドラインおよび推奨事項は、すべきであるこのプロトコルの実行が成功にSIST：

• 電流に関連する熱死を受けてから細胞を防ぐために、走電性チャンバーの寸法は¹⁶ジュール加熱の影響を最小限に抑えるために計算されています。チャンバー内で発生した熱は、走電性室の断面積に比例した順番になって、それを流れる電流の二乗に比例する。我々は2.04ミリメートル^2（12ミリメートル×0.17ミリメートル）のような室の断面積を維持することをお勧めします。
• 文化ニューロスフィアの7日は、収集された単一細胞に解離し、二次ニューロスフェアを得るために増殖因子の条件（ "継代"と呼ばれるプロセス）に再播種することができた後。大きいnumbeを継代されたニューロスフィアを使用するときに我々は、渡り鳥の能力に見える衰退未満で、3つの通路（培養で最大21日間）を受けた神経球を使用して最善の結果を得る回のr。これは長期的な文化が細胞動態^17を変えることが実証さ我々の前の仕事と一致している。
• 観察のためにNPCを含む走電性室を選択する際には、神経球由来の細胞は、正確な運動学的分析を可能にするためによく解離持っているチャンバを選択することが重要です。ニューロスフィアはよく解離（NPCには、相互に接着されており、線引きすることはできません）をお持ちでない方は、個々のセルの移動行動の分析はほぼ不可能になります。培養物は、観察前に解離させるために多くの時間を許可する必要があります。また、互いに非常に近接している細胞が物理的に隣接する細胞の移動を妨害することができます。我々の分析では、離れた場所に最も近い隣接セルからの少なくとも1つの細胞体を配置細胞は等しく悲惨ではあるが、解離した神経球の中心付近にまとめてクラスタ化された細胞よりも有意に大きい速度で移行することが示されているctedness。
• NPCから伸びる過程の豊富さがある場合、これは細胞が分化し始めているので、それらが未分化集団の真の表現ではないことを示すインジケータです。三重で走電性室を準備することの利点はタイムラプスイメージングのために選択されていない残りの2室は、それらのインキュベートメッキ期間（ステップ2.16）の直後に固定されており、細胞の分化·プロファイルを確認するために免疫染色することができることである。
• 最適な結果を得るための培地は新鮮にそれが必要であることをそれぞれの日に準備し、補わなければなりません。
• タイムラプス画像とその後の運動学的分析は、サンプルの摂動に非常に敏感である。ライブセルイメージング顕微鏡は振動を最小限に抑えるために空気のテーブルの上に置かれるべきであり、システムは、実験中に乱されてはいけません。

弊社ラボの日常画像NPC galvanot6〜8時間の軸は、最大15時間の分析には行われてきたが。 15時間の期間にわたって、室全体でDCEFはmV /ミリメートル250〜227 mVの/ミリメートル（9.2％減）と減収となりました。長いイメージング期間は必然的にさらに電界を変更して、チャンバー内の培地のpHを変更します。従ってそれはメディアのおよそ6時間で交換することをお勧めします。しかし、我々は、メディア交換なしで8時間NPCの走電性アッセイを実行し、任意の顕著な細胞死（死んだ細胞は移行されません）、または細胞の運動性の低下が確認されていません。細胞は実験を通して、移行のその速度を維持している。捜査官はまた、DCEF ¹⁰の安定性を増すためにチャンバーの深さを減少させるかもしれません。

イメージングの後、シングルセルキネマトラッキング解析はツァイスAxioVisionのソフトウェアのトラッキングモジュールを使用して画像化された細胞のサブセットに実行されます。彼らは近いの縁に局在している場合、細胞は分析のために選択されるバラバラに最も近いセルから解離ニューロと少なくとも一つの細胞体。この背後にある理論的根拠は、不可能に近い個々の細胞を追跡するだろう、追跡中に重なり合った細胞の可能性を最小限に抑えることです。我々は移行の次の4つのパラメータを分析します。

1. X軸変位 - セルがdCEFの方向に平行な軸の方向に移動距離。
2. 速度 - 経過時間で割った最初と最後のセル位置の間の直線距離。
3. 志向 - 最初と最後のセル位置の間の直線距離で割ってx軸変位。
4. 蛇行 - 総経路距離は最初と最後のセル位置の間の直線距離で割ったセルが移動した。

後の2つのパラメータは、移動経路が特定の方向にあるどのようにストレートの指標である。

18の間に、中央トラフ内新鮮培地の連続クロス灌流を可能にするために走電性チャンバーを変更しました。適切な基板および培養培地は、他の細胞型のために選択される必要があるでしょうし、撮像前に播種細胞の存続期間は、必要に応じて調整されるべきである。特筆すべきは、チャンバーの寸法は、（組織切片をチャンバ内に配置される場合など）について検討されている組織の厚さに応じて変更する必要があります。治験責任医師は、心に留めておくべき股関節セット電界に対するt、チャンバーを流れる電流は、チャンバの断面積に正比例し、チャンバの寸法に、したがって重要な引き伸ばしは増加ジュール加熱に関連する細胞死につながることがあります。

このレポートに記載されている技術は、走電性の、重要ですが、広く研究されていない現象を調査するための強力なツールを提供します。 dcEFsに応答する細胞の能力は直接的な治療意味を持っています。電気刺激（脳深部電気刺激）はすでにパーキンソン病の治療に有用であることが証明されており、マウスモデル^19,20、海馬神経新生を促進することが示されている。細胞の運動性にDCEF伝達を担う細胞のメカニズムを完全に理解し、最終的には怪我やdiseaのサイトへの内因性前駆体の移行を強化し、導くための臨床手段として電気刺激の使用につながる可能性があります修復プロセスを容易にするために、SE。メソッドは、これらのプロセスを調査するシンプルかつ堅牢な方法を提供し、上記の。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32"ID x 5/32"OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.