Summary
En este protocolo, se muestran cómo construir cámaras personalizados que permitan la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa para activar el tiempo de imágenes a intervalos de cerebro adulto derivado translocación célula precursora neural durante galvanotaxia.
Abstract
El descubrimiento de células madre neurales y células progenitoras (colectivamente denominadas células precursoras neurales) (CPN) en el cerebro adulto de mamíferos ha conducido a un cuerpo de la investigación dirigida a la utilización de las propiedades multipotentes y proliferativa de estas células para el desarrollo de estrategias neuroregenerativas. Un paso crítico para el éxito de tales estrategias es la movilización de NPCs hacia un sitio de la lesión después de un trasplante exógeno o para aumentar la respuesta de los precursores endógenos que se encuentran en la región periventricular del SNC. Por consiguiente, es esencial para comprender los mecanismos que promueven, orientar y mejorar la migración NPC. Nuestro trabajo se centra en la utilización de los campos eléctricos de corriente directa (dcEFs) promover y migración NPC directa - un fenómeno conocido como galvanotaxia. Endógenos campos eléctricos funcionan como señales fisiológicas esenciales para la migración celular durante el desarrollo normal y la reparación de heridas. Interrupción farmacológica de latrans-neural en embriones de potencial tubo axolotl provoca graves malformaciones en el desarrollo 1. En el contexto de la cicatrización de heridas, la tasa de reparación de córnea heridos se correlaciona directamente con la magnitud del potencial de heridas epiteliales que surge después de la lesión, como se muestra por la mejora farmacológica o la interrupción de este dcEF 2-3. Hemos demostrado que los adultos NPCs subependimales someterse a migración catódica rápida y dirigida in vitro cuando se exponen a un dcEF aplicada externamente. En este protocolo se describen técnicas de nuestro laboratorio para la creación de un ensayo de galvanotaxia simple y eficaz para la alta resolución, observación a largo plazo de la translocación dirigida cuerpo celular (migración) en un nivel de una sola célula. Este ensayo sería adecuado para la investigación de los mecanismos que regulan la transducción de dcEF en la motilidad celular mediante el uso de ratones transgénicos o knockout, ARN corto de interferencia, o agonistas / antagonistas de receptores específicos.
Protocol
Todos los procedimientos que impliquen la manipulación de animales fueron aprobados por la Universidad de Toronto Comité de Cuidado de Animales de acuerdo con las directrices institucionales (Protocolo n º. 20009387). Los siguientes métodos se debe realizar utilizando instrumentos estériles y técnicas, en una campana de flujo laminar en su caso.
En el texto siguiente protocolo, la frase "EFH-SFM" se refiere a medio libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico y la heparina. EFH-SFM se utiliza en la investigación de la galvanotaxia de NPCs no diferenciados debido a que estos mitógenos mantener NPCs en su estado indiferenciado 4. Al investigar la galvanotaxia de NPCs inducidas a diferenciarse en tipos de células maduras, "FBS-SFM" se refiere a medio libre de suero suplementado con suero fetal bovino al 1%. FBS promueve la diferenciación de NPCs en maduros fenotipos neurales 5.
1. Aislamiento y cultivo de precursores neurales (Nose muestra en vídeo)
- Anestesiar un ratón CD1 (6-8 semanas) con isofluorano y el sacrificio por dislocación cervical.
- Apaga la cabeza en 70% de etanol y decapitar al animal con tijeras de disección cortante.
- Mientras sostiene la cabeza con fórceps quirúrgico, quitar la piel en la superficie dorsal para exponer el cráneo.
- Utilizando un escalpelo y no. 11 blade, anotar el cráneo en el seno frontal a lo largo del eje mediolateral, y también a lo largo de la sutura sagital en la dirección rostrocaudal.
- Pelar los huesos parietales lejos de la cabeza con no. 7 pinzas curvas, teniendo cuidado de no perforar el tejido cerebral.
- Insertar una espátula fina debajo del cerebro a partir de debajo del cerebelo y avanzando hacia los bulbos olfatorios. Mientras sostiene el cráneo en su lugar con pinzas, tire suavemente del cerebro del cráneo y de inmediato se coloca en el hielo frío artificial líquido cefalorraquídeo (ver recetas a continuación).
- Bajo un microscopio de disección, usando estériltijeras y pinzas de disección del cerebro cortar por la mitad a lo largo de la línea media. Gire cada hemisferio a fin de que la media (corte) de la superficie hacia arriba.
- Seleccione un hemisferio, y con la superficie medial hacia arriba, busque el esplenio del cuerpo calloso (región posterior del cuerpo calloso).
- Hacer una incisión en la superficie de la corteza de la rodilla del cuerpo calloso a lo largo del eje dorsoventral.
- Pelar la corteza incisa hacia el bulbo olfatorio para exponer las paredes medial y lateral del ventrículo lateral.
- Girar el hemisferio para que la superficie dorsal esté orientada hacia arriba, y el uso de micro tijeras curvadas para cortar y recoger las paredes expuestas medial y lateral, que contienen la región periventricular NPCs donde residen 6.
- Repita los pasos 1.8 a 1.11 para el otro hemisferio.
- Pipetear el tejido aislado en 7 ml de solución de tripsina (ver receta a continuación) en un tubo de 15 cc, y coloque el tubo en un rockero en un 37 ° Cincubadora durante 25 min.
- Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender el tejido en 2 ml de solución de inhibidor de tripsina (véase la receta a continuación).
- Suavemente se tritura el tejido con una pipeta Pasteur de pequeñas perforaciones 30-50 veces con cuidado para evitar burbujas de aire.
- Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender en 1-2 ml de SFM (ver receta más abajo) triturando el pellet 3-5 veces.
- Centrifugar el tubo a 1.500 rpm durante 3 min, aspirar el sobrenadante y se resuspende en 1 ml de SFM + EFH.
- Contar vivir densidad de células con un hemocitómetro y la placa de las células en un matraz de cultivo T25 a una densidad de 10 células por microlitro en SFM + EFH.
- Deje que la cultura a crecer durante 7 días no perturbados para producir flotan libremente neuroesferas primarias compuestas de NPCs.
2. Galvanotaxis cámara de preparación
- Coloque 3 cristal cuadrado no. Un cubreobjetos (22 x 22 x 0,17 mm) ina botella de ácido clorhídrico 6 N durante la noche.
- El día siguiente, utilizar una punta de diamante de cristal del cortador para cortar 6 tiras rectangulares (22 x 5 x 0,17 mm) de vidrio de no cuadrado. Un cubreobjetos.
- Transfiera los resbalones cuadrados lavados con ácido e injertos rectangulares en una campana de flujo laminar. Lavar las tiras rectangulares y cuadradas primero con 70% de etanol, luego con el cultivo de tejidos de grado agua tratada en autoclave, y permitir que se seque en un Kim Wipe (para esterilidad añadido, el cristal se puede permitir que el aire seco).
- Aplicar grasa de vacío para el perímetro de una superficie de las placas de vidrio cuadrados, y los sella a la base de 60 mm de placas Petri de plástico.
- Aplicar grasa de vacío a lo largo del eje largo de una superficie de las tiras rectangulares de vidrio, y sellar los bordes opuestos de las placas de vidrio cuadrados (de forma que son paralelas entre sí) con el fin de crear un canal central.
- UV-esterilizar las cámaras durante al menos 15 min en la campana de flujo laminar.
- Pipetear 250-300 l de poli-L-Lysine en el canal central de las cámaras y se incuban a temperatura ambiente durante 2 h.
- Aproximadamente 15 min antes de la finalización del periodo de incubación, preparar la solución de Matrigel (ver receta más abajo).
- Aspirar el poli-L-lisina, se lavan los canales centrales con 1 ml de agua esterilizada, y la pipeta 250-300 l de solución de Matrigel en las depresiones centrales.
- Incubar las cámaras a 37 º C durante 1 hr.
- Aspirar la solución Matrigel y lavar suavemente los valles centrales con 1-2 ml de SFM.
- Añadir 100 l de EFH-SFM SFM-FBS o en los valles centrales y la transferencia de las cámaras Galvanotaxis en el escenario de un microscopio contando.
- Ml pipeta 3-4 de la cultura neurosphere que contiene en una placa de Petri de 60 mm y transferir la placa de Petri para la etapa del recuento con microscopio.
- En un objetivo de visión de 5x, utilizar una pipeta para transferir P10 5-8 neuroesferas enteros (hasta cuatro a la vez) en el canal central de cada galvanotaxiacámara sin disociar, y extiende con cuidado las neuroesferas alrededor de la depresión central sin interrumpir el sustrato Matrigel.
- Añadir un adicional de 150-200 l de EFH-SFM SFM-FBS o en los valles centrales.
- Transferir las cámaras Galvanotaxis en un 37 ° C, 5% de CO 2, 100% incubador humidificado durante 17-20 horas (si el análisis de NPCs indiferenciadas) para permitir que las neuroesferas para adherirse al sustrato Matrigel y se disocian en células individuales como se muestra en la Figura 1 . Si el análisis de NPCs diferenciados, el período de incubación debe ser extendido a 69-72 horas para permitir la diferenciación de las células.
3. Vivo Celular Time-lapse de imágenes
- Permitir que el sistema de células de imágenes en vivo se equilibre a 37 ° C, 5% de CO 2 durante un mínimo de 30 min antes de la iniciación de la grabación de lapso de tiempo.
- Corte dos piezas de 12 cm de diámetro a 1 mm Plata alambre, la bobina de un lado, y colocarlos en Clorox blixiviación durante 20 minutos para formar Ag / AgCl electrodos.
- Transferir las cámaras Galvanotaxis sobre la platina de un microscopio contar y seleccionar qué cámara se utilizan para análisis en vivo de células migración de imagen basado en los siguientes criterios: i) las neuroesferas debe ser casi completamente disocia en células individuales y ii) las células deben poseer morfologías circulares con poco o ningún proceso que se extiende desde los cuerpos celulares.
- Transferir la cámara galvanotaxia seleccionado en una campana de flujo laminar, junto con un no cuadrado separado. 1 vaso cubreobjetos y grasa de vacío.
- Lavar la tapa de deslizarse primero con 70% de etanol, luego con agua tratada en autoclave, y aplicar una tira de grasa de vacío en dos bordes paralelos de la hoja de cubierta.
- Aspirar los medios de cultivo de la cubeta central de la cámara, a continuación, colocar rápidamente la hoja de la cubierta (grasa-lado que mira hacia abajo) en la cámara de tal manera que el resto grasa tiras de las dos tiras paralelas rectangulares de vidrio, creando efectivamente un techoa la cámara.
- Añadir 100 l de nuevo EFH-SFM SFM-FBS o en la pila central a través de la acción capilar.
- Use grasa de vacío para crear bordes de piscinas de medios de cultivo en cada extremo de la cubeta central, como se muestra en la Figura 2.
- Cortar dos piezas de 15 cm de tubo de PVC, y utilizar una jeringa de 10 cc con una aguja de calibre 18 para inyectar cuidadosamente una solución de agarosa en el tubo, asegurándose de que no se forman burbujas en los tubos, y permitir que el gel solidifique durante 5 min.
- Transferir la cámara galvanotaxia al sistema de células de imágenes en vivo, junto con los tubos de gel de agarosa, Ag / AgCl, y un par de vacío 60 mm placas de Petri que serán utilizados como medios de cultivo embalses y contendrá el Ag / AgCl. Permitir la cámara galvanotaxia a descansar dentro de la 37 ° C, 5% de CO 2 ambiente durante 20-30 min.
- Durante este tiempo, preparar las tapas de las cajas de Petri vacías 2 y la tapa de la cámara de cápsula de Petri galvanotaxia por los agujeros de perforaciónen ellos con una herramienta Dremel o similar como se muestra en la Figura 3.
- Pipetear 1-1.5 ml de EFH-SFM o FBS SFM-en ambos lados de la depresión central, y 7-8 ml de SFM en cada placa de Petri vacía. Colocar una placa de Petri en cada lado del canal central de la cámara de galvanotaxia y coloque un electrodo Ag / AgCl en cada plato. Salvar la distancia entre la cámara de galvanotaxia y las placas Petri a establecer la continuidad eléctrica con los puentes en gel de agarosa, tal como se muestra en la Figura 4.
- Conecte los electrodos de Ag / AgCl a una fuente de alimentación externa, con un amperímetro en serie para medir la corriente eléctrica y encienda la fuente de alimentación. Use un voltímetro para medir la fuerza del campo eléctrico directamente a través de la depresión central, y ajustar la salida de la fuente de alimentación hasta que la fuerza deseada de campo eléctrico se consigue (los ensayos realizados en este laboratorio utilizan una fuerza dcEF de 250 mV / mm con corriente eléctrica entre 1 y 1,5 mA).
- IniciativaTE el módulo de lapso de tiempo en el sistema de células de imágenes en directo, y permitir el experimento para funcionar para la cantidad de tiempo deseada. Después de completar el ensayo, fijar las células en 4% de paraformaldehído para el análisis de inmunotinción estándar.
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Representative Results
Análisis cinemático revela que en presencia de un 250 mV / mm dcEF, NPCs indiferenciadas exponer galvanotaxia altamente dirigidos y rápido hacia el cátodo (Figura 5A, Película 1). En ausencia de un dcEF, movimiento al azar de las células se observó (Figura 5B, Película 2). En esta intensidad de campo,> 98% de NPCs indiferenciadas migrar para toda 6-8 hr para los que se explora, y ya que las células muertas no migran esto sugiere que permanecen viables durante este período en la ausencia o presencia de un dcEF.
Fenotipos diferenciados someterse a migración insignificante tanto en presencia como en la ausencia de un dcEF (Películas 3, 4). Los subconjuntos de células diferenciadas extender los procesos que tienden a alinear perpendicularmente a la dirección de la dcEF, pero no translocación celular cuerpo notable se observa.
La inmunotinción verifica que los NPCs mantener positivo expression de la nestina precursor marcador neuronal después de 6 horas de exposición dcEF (Figura 6A). En los ensayos que implican NPCs inducidas a diferenciarse en fenotipos maduros, la mayoría de las células expresar el marcador de astrocitos maduros proteína ácida fibrilar glial (GFAP) después de 6 horas de exposición dcEF (Figura 6B).
Los anticuerpos primarios usados en estos análisis fueron los siguientes: monoclonal de ratón anti-nestina (1:400, Millipore, Canadá), y anticuerpo policlonal de conejo anti-GFAP (1:500, Sigma, Canadá). Los anticuerpos secundarios utilizados en estos análisis fueron los siguientes: de cabra anti-ratón conjugado con Alexafluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Canadá), y de cabra anti-conejo conjugado con Alexafluor 488 (1:400, Invitrogen-Gibco , Canadá).
Figura 1. Neuroesferas se adhieren al sustrato Matrigel y disociaciónComimos en células individuales después de 17 h de incubación a 37 ° C / 5% de CO 2, el 100% de humedad en EFH-SFM.
Figura 2. Ilustración de la cámara galvanotaxia. Tiras de grasa de vacío se utilizan para crear una piscina de medios de cultivo a cada lado de la depresión central.
Figura 3. Esquema de agujeros que deben ser perforados en las tapas de la cámara de galvanotaxia y los depósitos de medio de cultivo. Los orificios de 7 mm de diámetro en ambas tapas se utilizan para insertar los tubos de gel de agarosa. Los agujeros 4 mm de diámetro en la tapa de la cámara de galvanotaxia se utiliza para medir el potencial eléctrico directamente a través de la depresión central con un voltímetro. El 4 mm de diámetro en la tapa de la re medio de cultivoservoir es permitir que el electrodo de Ag / AgCl para sobresalir de la tapa de la placa para la conexión a la fuente de alimentación.
Figura 4. Ilustración del conjunto de la cámara galvanotaxia para time-lapse. La cámara de galvanotaxia es la central de placa de Petri, en el que las células son colocadas. Los medios de comunicación dentro de la caja de Petri plato central de la cámara de galvanotaxia es o SFM + EFH o SFM + 1% de SFB. Las placas de Petri a cada lado de la cámara de galvanotaxia se llenan con SFM, y también contienen los electrodos de Ag / AgCl. Estos electrodos están conectados a una fuente de alimentación externa, y cerrando las tres placas de Petri con gel de agarosa puentes forma un circuito completo.
Figura 5. En la presentaciónce de una NPCs indiferenciadas dcEF someterse a migración galvanotactic rápido hacia el cátodo (A), mientras que en ausencia de un dcEF las células se someten a la migración aleatoria radial (B).
Figura 6. Inmunotinción verifica que los NPCs permanecer nestina positivas precursores indiferenciadas después de 6 horas de exposición dcEF (A), y que los NPCs inducidas a diferenciarse principalmente expresar el marcador de astrocitos GFAP madura después de 6 horas de exposición dcEF (B).
Película 1. Time-lapse video de NPCs indiferenciados expuestos a un dcEF. NPCs sembraron en cámaras Galvanotaxis durante 17 horas en SFM + EFH, y luego se expusieron a un 250 mV / mm migración exposición dcEF rápido y dirigido hacia el cátodo. 1 segundo de video = 15 minutos de tiempo real. Haga clic aquí para ver la movie.
Movie 2. Time-lapse video de NPCs no diferenciados en ausencia de un dcEF. NPCs chapada en galvanotaxia cámaras durante 17 horas en SFM + EFH, y luego reflejado en la ausencia de un dcEF aplicada someterse a la migración aleatoria. 1 segundo de video = 15 minutos de tiempo real. Haga clic aquí para ver la película .
Movie 3. Time-lapse video de NPCs diferenciados expuestos a un dcEF. NPCs sembraron en cámaras Galvanotaxis de 69-72 hr en SFM + FBS, y después se expone a un 250 mV / mm migración exposición dcEF muy poco en cualquier dirección. 1 segundo de video = 15 minutos de tiempo real. Haga clic aquí para ver la película .
Movie 4. Time-lapse video de NPCs diferenciados en ausencia de un dcEF. NPCs chapada en galvanotaxia chambers de 69-72 hr en SFM + FBS, y luego con imagen en la ausencia de un dcEF aplicada exhiben muy poca migración en cualquier dirección, de forma similar a los NPCs diferenciadas que están expuestos a un dcEF. 1 segundo de video = 15 minutos de tiempo real. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
Este protocolo ha sido adaptado de los métodos bien establecidos de estudios previos 7-9. Galvanotactic cámaras pueden construirse utilizando una variedad de técnicas diferentes, incluyendo la construcción de un vaso separado bien para el confinamiento de la siembra de células, o el uso de CO 2 ablación con láser para la microfabricación de la depresión central 10,11. Algunas técnicas pueden ser más laborioso o costosos que otros. Se ha descrito un ensayo simple y rentable para la construcción de una cámara de NPC galvanotaxia utilizando materiales comúnmente encontrados en la mayoría de los laboratorios de biología celular. Nuestro protocolo incluye una calentado, humidificado, CO 2 incubadora regulada que rodea el sistema de formación de imágenes en vivo de células para mantener las células en condiciones óptimas para continuo a largo plazo de imagen. La falta de tal aparato es una limitación de algunas técnicas previamente publicados 9,12.
Un trabajo reciente de otro grupo demostró galva similaresnotactic comportamiento de las células de una línea celular de hipocampo 13, usando un protocolo diferente y una mayor mano de obra diseño de la cámara galvanotaxia. Nuestro ensayo es particularmente elegante ya que permite un análisis de la población de partida idéntico de células - cultivos celulares primarios de NPCs neuroesferas indiferenciadas derivados - que han sido expuestos a condiciones distintas permitiendo así una comparación de las propiedades migratorias de ambas células indiferenciadas y diferenciadas, simplemente mediante la modificación de los factores utilizados para suplementar el medio de cultivo dentro de la cámara galvanotaxia.
El ensayo se presenta en este protocolo es una herramienta poderosa para seguimiento a largo plazo y el análisis de galvanotaxia NPC, y posiblemente otros tipos de células que se someten a la migración galvanotactic 14,15. Al igual que con todos los protocolos, los matices en la preparación y ejecución de medidas de seguridad de este protocolo puede llevar a resultados infructuosos. Las siguientes pautas y sugerencias al igual queSIST en la ejecución exitosa de este protocolo:
- Para evitar que las células de someterse a la corriente eléctrica asociada a la muerte del calor, las dimensiones de la cámara galvanotaxia se han calculado para minimizar los efectos de calentamiento de Joule 16. El calor generado en la cámara es proporcional al cuadrado de la corriente que fluye a través de él, que a su vez es proporcional al área de la sección transversal de la cámara de galvanotaxia. Aconsejamos mantener el área de la sección transversal de la cámara como 2,04 mm 2 (12 mm x 0,17 mm).
- Después de 7 días de neuroesferas de cultivo puede ser recogida, se disocia en células individuales y se volvieron a sembrar en condiciones de factor de crecimiento-(un proceso conocido como 'pases') para producir neuroesferas secundarias. Se obtienen los mejores resultados utilizando nuestros neuroesferas que han sido sometidos a menos de tres pasajes (máximo 21 días en cultivo), con una disminución visible en las capacidades migratorias utilizando neuroesferas que han sido passaged una Numbe mayorr de veces. Esto es consistente con nuestro trabajo anterior que demuestra que a largo plazo las culturas alterar la cinética celular 17.
- Cuando se selecciona una cámara que contiene galvanotaxia NPCs para la observación, es importante seleccionar una cámara en la que las células neuroesferas derivados se han disociado bien con el fin de permitir análisis precisos cinemáticas. Si las neuroesferas no se han disociado bien (NPC se adhieren entre sí y no pueden ser delineadas), el análisis del comportamiento de células migratorias individuo será casi imposible. Los cultivos se debe permitir más tiempo para disociar antes de la observación. Además, las células que están en estrecha proximidad entre sí físicamente puede obstruir la migración de las células vecinas. Nuestros análisis han demostrado que las células situadas al menos un cuerpo celular lejos de su celda vecina más cercana migrar a velocidades significativamente mayores que las células que se agrupan cerca del centro de la neuroesfera disociado, aunque con extrema igualesctedness.
- Si hay una gran cantidad de procesos que se extienden desde los NPC, esto es un indicador de que las células han comenzado a diferenciarse y por lo tanto no son una representación verdadera de una población indiferenciada. Un beneficio de la preparación de las cámaras de Galvanotaxis por triplicado es que las dos cámaras restantes que no están seleccionados para la imagen de lapso de tiempo se puede fijar inmediatamente después de su período de placas se incubaron (Paso 2,16), y se inmunotiñeron para verificar el perfil de la diferenciación de las células.
- Para obtener resultados óptimos de los medios de cultivo deben estar recién preparada y completada en todos los días que sea necesario.
- Las imágenes con lapso de tiempo y subsecuentes análisis cinemáticos son muy sensibles a la perturbación de la muestra. El microscopio de formación de imágenes de células vivas se debe colocar en una mesa de aire para minimizar las vibraciones, y el sistema no debe ser perturbado durante la experimentación.
Nuestro laboratorio de rutina imágenes NPC galvanoteje de 6-8 horas, aunque hasta el 15-hr análisis se han realizado. Durante los períodos de 15-hr, la dcEF través de la cámara se redujo de 250 mV / mm a 227 mV / mm (9,2% de disminución). Los períodos más largos de formación de imágenes inevitablemente modificar el pH de los medios de comunicación en la cámara, además de modificar el campo eléctrico. Por lo tanto, se recomienda sustituir los medios aproximadamente cada 6 horas. Sin embargo, hemos realizado 8-hr NPC ensayos Galvanotaxis sin el reemplazo de medios y no han observado ninguna muerte celular apreciable (células muertas no migran) o disminución de la motilidad celular; las células a mantener su velocidad de migración durante todo el experimento. El investigador también puede reducir la profundidad de la cámara para aumentar la estabilidad de la dcEF 10.
Después de formación de imágenes, de una sola célula de análisis de seguimiento de cinemática se realiza sobre un subconjunto de las células utilizando imágenes módulo de seguimiento Zeiss Axiovision software. Las células se seleccionan para el análisis si se localizan más cerca del borde dela neuroesfera disociado y al menos un cuerpo de célula aparte de su celda más cercana. La razón detrás de esto es reducir al mínimo la probabilidad de que las células se superponen entre sí durante el seguimiento, lo que haría que el seguimiento de las células individuales casi imposible. Se analizan las siguientes cuatro parámetros de la migración:
- Eje X de desplazamiento - la distancia de una célula migra en la dirección del eje, que es paralelo a la dirección de la dcEF.
- Velocity - la distancia en línea recta entre las posiciones inicial y final de células dividido por el tiempo transcurrido.
- Direccionalidad - x-eje de desplazamiento dividido por la distancia en línea recta entre las posiciones de celda inicial y final.
- Tortuosidad - la distancia total de la ruta recorrida por la célula dividida por la distancia en línea recta entre las posiciones inicial y final de células.
Los últimos dos parámetros son indicadores de la forma recta de la vía de migración es en una dirección particular.
18. Un medio apropiado de sustrato y la cultura tendría que ser seleccionada para otros tipos de células, y la duración de la siembra de células antes de la imagen se debe ajustar según sea necesario. En particular, las dimensiones de la cámara puede necesitar ser modificada dependiendo del espesor del tejido que se examinaron (por ejemplo, si una lámina de tejido se coloca en la cámara). El investigador debe tener en cuenta That para un campo de juego eléctrico, el flujo de corriente a través de la cámara es directamente proporcional al área de la sección transversal de la cámara, y por lo tanto ampliaciones significativas a las dimensiones de la cámara puede resultar en aumento de la muerte celular calentamiento Joule-relacionada.
Las técnicas descritas en este informe proporcionan una herramienta poderosa para investigar el importante, pero no se ha estudiado ampliamente, fenómeno de galvanotaxia. La capacidad de las células para responder a dcEFs tiene directas implicaciones terapéuticas. La estimulación eléctrica (estimulación profunda del cerebro) ya ha demostrado ser útil en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, y se ha demostrado para promover la neurogénesis en el hipocampo en un modelo de ratón 19,20. Una completa comprensión de los mecanismos celulares responsables de la transducción de dcEF en la motilidad celular puede conducir finalmente a la utilización de la estimulación eléctrica como un medio clínico para mejorar y dirigir la migración endógeno precursor a sitios de lesión o enfermesí para facilitar el proceso de reparación. Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan una forma simple y robusta de la investigación de estos procesos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo es financiado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (subvención # 249669, 482986 y #) y Heart and Stroke Foundation de Canadá (subvención # 485508). Los autores agradecen a Youssef El-Hayek y el Dr. Qi Wan por su ayuda en la elaboración de los protocolos experimentales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
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References
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