नियमित और एक Zebrafish की देखभाल और रखरखाव ( Published: November 18, 2012 doi: 10.3791/4196

DOI

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Avdesh Avdesh*^1,2, Mengqi Chen*^1,3, Mathew T. Martin-Iverson^1,2,4, Alinda Mondal^1,3, Daniel Ong¹, Stephanie Rainey-Smith^1,3, Kevin Taddei^1,3, Michael Lardelli⁵, David M. Groth⁶, Giuseppe Verdile^1,3, Ralph N. Martins^1,2,3,7

¹Centre of Excellence for Alzheimer's Disease Research and Care, School of Medical sciences, Edith Cowan University, ²Centre for Clinical Research in Neuropsychiatry, Graylands Hospital, University of Western Australia, ³McCusker Alzheimer's Research foundation, ⁴School of Medicine and Pharmacology, University of Western Australia, ⁵Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Adelaide, ⁶School of Biomedical Sciences, Curtin University of Technology, ⁷School of Psychiatry and Clinical Neurosciences, University of Western Australia

* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल नियमित रखरखाव और देखभाल करने के लिए zebrafish खेती - किसानी के लिए इष्टतम स्थिति बनाए रखने की रूपरेखा. वीडियो प्रणाली रखरखाव, नियमित रूप से आवास, भोजन, प्रजनन, और zebrafish लार्वा की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल दिखाता है.

Abstract

इस प्रोटोकॉल नियमित देखभाल और एक zebrafish प्रयोगशाला के रखरखाव का वर्णन करता है. Zebrafish अब आनुवंशिकी, औषधीय और व्यवहार अनुसंधान में लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं. एक हड्डीवाला के रूप में, zebrafish शेयर काफी मनुष्यों और आनुवंशिक अनुक्रम समानता विभिन्न मानव रोग की स्थिति के लिए एक पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है. zebrafish की अन्य आम हड्डीवाला मॉडल की तुलना में लाभ उच्च उपजाऊपन, कम रखरखाव लागत, पारदर्शी भ्रूण, और तेजी से विकास शामिल हैं. Zebrafish अनुसंधान, को स्थापित करने और एक उत्पादक zebrafish आवास सुविधा को बनाए रखने की जरूरत में ब्याज की प्रेरणा के कारण भी बढ़ रही है. हालांकि साहित्य एक zebrafish प्रयोगशाला के रखरखाव के लिए उपलब्ध है, एक संक्षिप्त वीडियो प्रोटोकॉल की कमी है. इस वीडियो को नियमित रूप से आवास के लिए प्रोटोकॉल दिखाता है, भोजन, प्रजनन और zebrafish लार्वा की स्थापना. शोधकर्ताओं ने इस प्रक्रिया को प्राकृतिक व्यवहार और zebrafis का इष्टतम स्थितियों को समझने में मदद मिलेगीघंटे पशुपालन और इसलिए प्रायोगिक मुद्दों है कि मछली के पालन की स्थितियों से उत्पन्न समस्याओं का निवारण. इस प्रोटोकॉल एक zebrafish प्रयोगशाला स्थापित करने के लिए, और भी स्नातक छात्रों को, जो एक पशु मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने का इरादा कर रहे हैं करने के लिए योजना बना शोधकर्ताओं के लिए बहुत मदद की हो जाएगा.

Protocol

1. तंत्र अनुरक्षण

1. Zebrafish एक परिसंचारी प्रणाली है कि लगातार फिल्टर में रखा जाता है और पानी aerates प्रणाली के लिए पानी एक स्वस्थ जलीय पर्यावरण के लिए आवश्यक गुणवत्ता को बनाए रखने. परिसंचारी प्रणाली भी अतिरिक्त भोजन और मछली मलमूत्र फिल्टर करने में मदद करता है. विभिन्न कंपनियों zebrafish प्रणाली प्रदान करते हैं, लेकिन हम एक्वाटिक हमारी प्रयोगशाला में संयुक्त राज्य अमेरिका, निवास से सिस्टम का उपयोग करें. कमरे के तापमान या टैंक तापमान आम तौर पर बनाए रखा है 26-28.5 डिग्री सेल्सियस और प्रकाश व्यवस्था की स्थिति के बीच 14:10 घंटा (प्रकाश: काले). जलीय निवास से एक zebrafish प्रणाली (उदाहरण के लिए, Benchtop प्रणाली) लागत ~ 9000 अमरीकी डालर. दो अलमारियों के साथ यह benchtop प्रणाली प्रत्येक शेल्फ पर 10-लीटर छह, बारह 3 - लीटर, या बीस 1.5 लीटर टैंक पकड़ सकते हैं. मछली की कई लाइनों (जैसे, ट्रांसजेनिक, उत्परिवर्ती, जंगली प्रकार) भी एक ही सिस्टम पर रखे जा सकते हैं.
2. फिल्टर के विभिन्न प्रकार के एक सेट प्रणाली में इस्तेमाल किया जाता है. हमारी प्रणाली में सभी देहात टैंक से पानी120-माइक्रोन फिल्टर पैड, 50-माइक्रोन फिल्टर कनस्तर, जैविक फिल्टर, सक्रिय कार्बन अवशोषण फिल्टर और यूवी कीटाणुशोधन फिल्टर के माध्यम से sses से पहले वापस टैंक में परिचालित किया जा रहा है. De-chlorinated/aged पानी zebrafish प्रणाली में प्रयोग किया जाता है. जल जा सकता है कि कम से कम 48 घंटे के लिए उम्र बढ़ने de-chlorinated. आदर्श परिस्थितियों में, पानी पानी परिसंचारी इसे गर्म रहते पंप के साथ एक जलाशय में रखा जाना चाहिए, और de-क्लोरीनीकरण में तेजी लाने.
3. सिस्टम पानी की पीएच दैनिक जाँच की जानी चाहिए और 6.8 और 7.5 के बीच बनाए रखा. जब आवश्यक हो, सोडियम बिकारबोनिट पीएच बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
4. मछली टैंक को नियमित रूप से साफ किया जाना चाहिए. एक मछली टैंक को साफ करने के लिए, इस टैंक के लिए पानी का प्रवाह बंद, पीछे की ओर झुकने टैंक से अतिरिक्त पानी नाली और टैंक प्रणाली से ध्यान हटा. गंदगी और शैवाल विकास की टंकी के नीचे और पक्षों पर स्पष्ट हो जाएगा.
5. एक साफ टैंक में बाधक प्लेस, और de-chlorinated पानी (उर्फ सिस्टम वा के साथ भरने के) आतंकवाद. ध्यान से इस टैंक में एक मछली जाल के साथ मछली हस्तांतरण. ढक्कन बंद करें और टैंक के नाम टैग हस्तांतरण. ध्यान से प्रणाली में साफ टैंक जगह और पानी की आपूर्ति पर स्विच.
6. 70% इथेनॉल के साथ मछली जाल, स्प्रे विसंदूषित कर देना, पानी में कुल्ला, और इसे फिर से उपयोग करने से पहले दो सूखी. गंदे टैंक से भ्रमित निकालें और 70% इथेनॉल के साथ दोनों भागों स्प्रे. नल के पानी से अच्छी तरह कुल्ला और टैंक की अनुमति है और फिर से उपयोग करने से पहले पूरी तरह से सूखी गतिरोघक.
7. परिसंचारी प्रणाली फिल्टर करने के लिए जाँच की है और उनके समुचित कार्य सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से बदला है. ये फिल्टर नियमित रूप से परिवर्तित किया जाना चाहिए और सभी मछली टैंक के लिए उचित और स्वच्छ पानी की आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए.
8. 120-माइक्रोन फिल्टर पैड या repositioned आमतौर पर दैनिक प्रतिस्थापित, पानी के प्रवाह की दिशा में reposition करने के लिए यह एक नया एक के साथ जगह से पहले पूरी तरह से उपयोग.
9. कनस्तर फिल्टर साप्ताहिक बदला जाना चाहिए. कनस्तर फ़िल्टर बदलने के लिए, चींटी घुमा द्वारा फिल्टर यूनिट हटाएंएक रिंच या हाथ के साथ iclockwise. एक प्लास्टिक शीट या नीचे को रोकने या पानी spillage को अवशोषित तौलिया रखें. एक नया एक के साथ बदलें कनस्तर फिल्टर और फिल्टर यूनिट प्रणाली में वापस फिट, ध्यान से हाथ और यदि आवश्यक हो तो एक रिंच के साथ कस.
10. कार्बन फिल्टर पाक्षिक परिवर्तित किया जाना चाहिए (हर दो सप्ताह). कार्बन फिल्टर को बदलने के लिए, कार्बन फिल्टर इकाई सावधानी से दूर एक रिंच के साथ. प्रयुक्त सक्रिय कार्बन त्यागें और यह नया सक्रिय कार्बन के साथ की जगह. कार्बन धारक पुनः फिट और यह फिल्टर यूनिट में वापस जगह. प्रणाली में फिल्टर यूनिट वापस फिट. प्रणाली पर स्विच और है कि पानी को फिल्टर करने के लिए बह रही है. यदि आवश्यक हो, पाइप के माध्यम से कुछ पानी फ्लश प्रणाली में फिल्टर फिटिंग से पहले पाइप में गंदगी को साफ करने के लिए.
11. जैविक फिल्टर हर छह महीने साफ किया जाना चाहिए. एक जैविक फिल्टर कनस्तर और परिसंचारी प्रणाली में कार्बन फिल्टर के बीच आम तौर पर स्थित है. जैविक फिल्टर, लोकलक्षी बदलनेove प्रणाली से फिल्टर यूनिट. दबाव रिलीज बटन दबाकर फिल्टर से दबाव जारी है. एक रिंच के साथ फिल्टर खोलना. आम तौर पर इस कदम के लिए दो लोगों की जरूरत है. फिल्टर यूनिट के ढक्कन निकालें. एक sieved पानी से siporax अलग कंटेनर में फिल्टर की सामग्री खाली. नोट: Siporax एक ठीक ताकना जैव फिल्टर मीडिया है कि दोनों नाइट्रीकरण और de-नाइट्रीकरण प्रदर्शन करने की क्षमता है.
12. यदि siporax बहुत गंदा है यह नए के साथ की जगह. प्रणाली पानी (de-chlorinated पानी) के साथ फिल्टर यूनिट भरें, ढक्कन बंद, प्रणाली और पानी की आपूर्ति पर स्विच करने के लिए फिल्टर यूनिट वापस. नोट: एक आदत मछलीघर में siporax कई nitrifying बैक्टीरिया को घर होगा. इन सूक्ष्मजीवों मछलीघर के भीतर नाइट्रोजन चक्र को बनाए रखने, और जैविक फिल्टर (गंदा siporax) के लिए प्राथमिक आवास को हटाने के लिए महत्वपूर्ण हैं एक गंभीर अमोनिया कील में परिणाम सकता है एक नाइट्राट कील द्वारा पीछा करते हुए new जैविक फिल्टर (नई siporax के साथ) पुनः स्थापित. नाइट्रोजन चक्र के इन मध्यवर्ती राज्यों के दोनों जलीय जीवों को विषाक्त हो सकता है और zebrafish मार उचित अगर प्रतिक्रिया व्यक्त नहीं हो सकता है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है एक माध्यमिक जैविक फिल्टर zebrafish आवास प्रणाली (जैसे, जलीय निवास प्रणाली में संग्रह टैंक में) में कहीं नए siporax पर इन महत्वपूर्ण सूक्ष्मजीवों की तेजी repopulation की अनुमति.
13. यूवी फिल्टर प्रणाली जैविक contaminants (जैसे बैक्टीरिया के रूप में) को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है और हर नौ - दस महीनों प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यूवी फिल्टर कीटाणुशोधन खुराक दर ~ 110 / MJ दीपक जीवन की शुरुआत में ² सेमी और समय के दौरान अधिक खुराक दर कम हो जाती है, इसलिए यह जरूरी है कि दुनिया की जगह जब भी यह करने के लिए अभी भी प्रतीत होता है कार्यात्मक.

2. भोजन

1. Zebrafish सूखी (लार्वा टी के लिए खाना खाना आकार 100 microns से के साथ खिलाया जा सकता है300 ओ / वयस्क) मछली या जी भोजन (नमकीन चिंराट) के लिए 400 microns. नमकीन चिंराट अंडे (Artemia सपा) स्थानीय पालतू दुकानों से उपलब्ध हैं और सरल नीचे वर्णित चरणों का पालन करके प्रयोगशाला में रची जा सकता है.
   1. वृद्ध पानी में नमक के साथ बेहतर विलेयता के लिए एक चुंबकीय दोषी पर एक बीकर रखने के द्वारा लाल समुद्री नमक भंग. वैकल्पिक रूप से, यह वातन ट्यूब के साथ aerating नमक पानी में भंग किया जा सकता है. त्वरित सागर नमक भी एक अंडे सेने के समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर लाल समुद्री नमक के लिए उपलब्ध नहीं है. नमकीन चिंराट लवणता की एक विस्तृत श्रृंखला बर्दाश्त कर सकते हैं, लेकिन हम 30-35 ग्राम / एल लाल समुद्री नमक पानी में हमारे नमकीन चिंराट (10-15 ग्राम) हैच. नोट: मामले में नमकीन चिंराट अंडे स्थानीय पालतू दुकानों में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, तो समझाया नमकीन चिंराट भी उन्हें चिंराट मछली पालने का जहाज़ को जोड़ने से पहले उन्हें "decapping" बैचों में करने के बाद किया जा सकता है. यह भी पालतू जानवर की दुकान के लिए लगातार यात्राएं से बचने के लिए हो सकता है.
   2. सा के साथ नमकीन चिंराट हैचर भरेंलेफ्टिनेंट पानी और 1.2 tablespoons / लीटर की एकाग्रता में चिंराट अंडे जोड़ें. हैचर सख्ती और एक हवाई पंप के साथ Aerate नमकीन चिंराट अंडे छोड़ने के लिए ~ 48 घंटा के लिए हैच.
      नोट: ऐसा लगता है कि संयुक्त राष्ट्र समृद्ध नमकीन चिंराट पोषण का महत्व हर घंटे के बाद अंडे सेने खोना चाहिए. इसलिए, यह या तो 24 घंटे से अधिक पक्षियों के बच्चे के लिए उपयुक्त हो सकता है या नमकीन चिंराट से अधिकतम पोषण मूल्य प्राप्त करने के लिए आदेश में 48 घंटे से अधिक समृद्ध करने के लिए हो सकता है.
   3. अंडे सेने के सिस्टम से अपशिष्ट जल संगरोध बर्बाद करने के लिए जोड़ा है, ब्लीच के साथ कीटाणुरहित किया हुआ हो सकता है और बाद में निपटाया जाता है.
2. नमकीन चिंराट इकट्ठा करने के लिए, हवा पाइप हटाने और संस्कृति लेकिन 4-5 मिनट के लिए 10 मिनट से अधिक के लिए समझौता नहीं करने के लिए अनुमति देते हैं. रची नमकीन चिंराट हैचर के नीचे इकट्ठा होते हैं.
   1. नमकीन हैचर के नीचे नल का उपयोग चिंराट ले लीजिए. प्रारंभिक प्रवाह है, जो संयुक्त राष्ट्र रची नमकीन चिंराट अंडे होते हैं त्यागें.
   2. नमकीन चिंराट नमकीन पानी से अलग, एक नमकीन चिंराट संग्रह शुद्ध (~ 350 माइक्रोन नायलॉन जाल) का उपयोग. प्रणाली में पानी का उपयोग कर कंटेनर में नेट से नमकीन चिंराट कुल्ला.
3. एकत्र नमकीन चिंराट आम तौर पर कर रहे हैं कंटेनर के नीचे में यह एक बल्कि नारंगी रंग देने के उच्च एकाग्रता में उपस्थित थे.
4. Zebrafish एक विंदुक या एक बोतल / squeezy dropper का उपयोग करने के लिए नमकीन चिंराट फ़ीड. तिरस्कृत भोजन की राशि व्यक्तिगत टैंकों की जनसंख्या के आकार पर निर्भर करता है. zebrafish के लिए आमतौर पर स्वीकार किए जाते हैं अनुपात प्रति दिन भोजन में शरीर के वजन के 4% प्राप्त है. Zebrafish के रूप में इस पानी में नाइट्रेट का स्तर बढ़ाने के लिए, संभवतः उनके प्रजनन, या व्यवहार्यता को प्रभावित करने, के रूप में कुछ ज्यादा खा के कारण मछली मर सकता है किया जा सकता है कभी नहीं overfed चाहिए.
   1. में भोजन इंजेक्शन लगाने परपानी, भूख मछली नमकीन चिंराट पकड़ने तैरना.
5. सूखी खिला एक जलीय पारिस्थितिकी तंत्र / जलीय निवास सरल मछली वसंत आधारित खाद्य औषधि का उपयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, शुष्क खिला एक सरल चम्मच का उपयोग किया जा सकता है या एक प्लास्टिक dropper तिरछे कैंची के साथ करने के लिए यह एक छोटा चम्मच के एक स्वरूप देने के काटने के द्वारा.

3. प्रजनन

1. प्रकाश की शुरुआत में प्रजनन आरंभ zebrafish. निषेचित अंडे टैंक में प्रजनन या जोड़ो में प्रजनन के माध्यम से भी प्राप्त कर सकते हैं. जबकि टैंक प्रजनन अधिक श्रम कुशल है और हमारी प्रयोगशाला में नियमित रूप से भ्रूण संग्रह के लिए लागू है, जोड़ो में प्रजनन जब जीन या परिवर्तन व्यक्तिगत मछली से जांच की जानी हैं पसंद है.
2. प्रजनन के लिए टैंक में टैंक, ब्रीडर को इकट्ठा और मछली टैंक में प्रकाश की शुरुआत के बाद धीरे धीरे ड्रॉप. वैकल्पिक रूप से, टैंक में प्रजनन सेट अप मछली टैंक में रात भर छोड़ा जा सकता है.
3. एलeave चारों ओर 15 मिनट के लिए टैंक में ब्रीडर मछली ब्रीडर टैंक से हटाने और अंडे का संग्रह से पहले संभोग करने के लिए अनुमति देने के लिए.
4. Pairwise प्रजनन आमतौर पर देर से दोपहर में खिलाने के बाद निर्धारित किया है.
5. इकट्ठा प्रजनन टैंक और यह आयु वर्ग प्रणाली पानी के साथ भरने.
6. प्रजनन टैंक के विपरीत दिशा में एक महिला और एक पुरुष स्थानांतरण. महिलाओं उनके बड़े underbelly की वजह से पुरुषों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. नर भी महिलाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है क्योंकि वे अधिक पतला और गहरे रंग में महिलाओं की तुलना में कर रहे हैं. इसके अलावा, पुरुषों महिलाओं (चित्रा 1 देखें) की तुलना में गुदा फिन में अधिक पीला रंगाई है. जब महिला zebrafish में अंडनिधानांग (4 चित्र देखें) के लिए संदेह देखो में.
7. विभक्त अगली सुबह निकालें प्रकाश की शुरुआत के बाद शीघ्र ही. 20 मिनट के लिए या undisturbed होते हैं जब तक भ्रूण की पर्याप्त संख्या की टंकी के नीचे रखी हैं संभोग करने की अनुमति दें.
8. प्रजनन के बाद,अपने टैंक के लिए मछली वापस. एक झरनी का उपयोग अंडे ले लीजिए.
9. भ्रूण अच्छी तरह धो प्रणाली पानी के साथ.
10. उर्फ EM3 (NaCl, 13.7 मिमी, KCl, 0.54 मिमी, MgSO _4, 1.0 मिमी, ₂ CACL, 1.3 मिमी, ना _{2 4} HPO, 0.025 मिमी, एक पेट्री डिश भ्रूण भ्रूण माध्यम से झरनी rinsing द्वारा स्थानांतरण ₂ KH ₄ पीओ, 0.044 मिमी, ₃ NaHCO, 4.2 मिमी).
11. भ्रूण एक खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है. निषेचित अंडे तो unfertilized अंडे एक सुई और एक विंदुक (चित्र देखें 3) का उपयोग कर से अलग हो रहे हैं.

4. लार्वा की स्थापना

1. निषेचित अंडे एक मशीन (28.5 ° ~ सी) 72 घंटे के लिए जब तक लार्वा रची हैं में रखा जाता है.
2. अब लार्वा जरायु और तैराकी के बाहर हैं आज़ादी से वे एक मुख्य मछली टैंक को स्थानांतरित करने के लिए तैयार कर रहे हैं. लार्वा के लिए 5 दिनों से पोस्ट निषेचन (DPF) खिलाया जा जरूरत है और भ्रूण माध्यम में रखा जाता है (रचना में वर्णितभाग 3, 10) या सिस्टम पानी. लार्वा ~ 50% या पानी की अधिक उसमें एक दैनिक आधार पर बदल के साथ दौर व्यंजनों में रखा जा सकता है. पानी परिवर्तन मृत या रोगग्रस्त लार्वा और किसी भी अन्य मलबे को हटाने को शामिल करना चाहिए.
3. एक छोटे आकार भ्रमित (300-400 चारों ओर microns) युक्त टैंक में लार्वा धीरे स्थानांतरण. मृत और रोगग्रस्त लार्वा और हटाया जाना चाहिए और एक दैनिक आधार पर पानी की कुछ मिलीलीटर धीरे से जोड़ा जाना चाहिए.
4. 14 दिनों के बाद, लार्वा टैंक प्रणाली में हटाया हो सकता है, कर सकते हैं और साइकिल चालन के पानी की एक छोटी सी स्ट्रीम (प्रति सेकंड 1-2 बूँदें) के साथ आपूर्ति की है. के रूप में लार्वा बढ़ती है, पानी के प्रवाह बढ़ सकता है. चकरा के विभिन्न आकारों (जैसे बाधक 300-400 आकार, 500, 700-750, और 1000 microns) लार्वा और एक सामान्य प्लास्टिक बाधक के आकार के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है और वयस्क मछली के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
5. यह आमतौर पर 3 महीने के लिए भ्रूण यौन परिपक्व वयस्क में विकसित करने के लिए लेता है.

Representative Results

Zebrafish आवास और रखरखाव आसान और पारंपरिक कृंतक मॉडल की तुलना में सस्ता है. कई हजार zebrafish एक छोटी प्रयोगशाला में रखा जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का एक परिणाम के रूप में, शोधकर्ताओं ने एक zebrafish सुविधा है जो स्वस्थ शर्तों zebrafish प्रदान करेगा प्रबंधन करने में सक्षम हो जाएगा. इसके अलावा, निम्न चित्र की पहचान निषेचित अंडे, वयस्क zebrafish, और उनके भोजन में मदद मिलेगी. एक पुरुष (चित्रा 1 ए) zebrafish और महिला zebrafish (चित्रा 1B और 1C) का एक उदाहरण दिखाया गया है मदद करने के लिए शोधकर्ताओं ने उद्देश्य प्रजनन के लिए एक पुरुष और एक महिला zebrafish के बीच भेद चित्रा 2 एक की सूक्ष्म दृश्य दर्शाया गया है, 12X पर नमकीन चिंराट (चित्रा 2A), 90X (चित्रा 2B) में एक नमकीन चिंराट, और 90X (चित्रा 2C) में एक unfertilized नमकीन चिंराट अंडे. इस सहारा लिए unfertilized और निषेचित नमकीन चिंराट के बीच अंतर को समझने में मदद मिलेगीएर खिला प्रयोजनों. निषेचित और unfertilized अंडे 3 चित्र में दिखाया जाता है चित्रा 3A निषेचित और unfertilized भ्रूण के एक सूक्ष्म दृश्य दिखाता है. Unfertilized भ्रूण आम तौर पर अपारदर्शी और / या जरायु अंदर उठी (ओं) सेल (काला तीर) whilst निषेचित भ्रूण बरकरार है और अगले कोशिका विभाजन राज्य के लिए बढ़ रहा है (zebrafish भ्रूण के विभिन्न चरणों की विस्तृत पढ़ने के लिए ¹ देखें) प्रकट होता है के साथ कर रहे हैं. एक निषेचित और एक unfertilized अंडे चित्रा 3B में दिखाया गया है और 3C क्रमशः चित्रा 4 के उच्च बढ़ाई दृश्य एक महिला zebrafish मदद करने के लिए शोधकर्ताओं ने एक पुरुष और एक महिला zebrafish के बीच भेद अंडनिधानांग दिखाता है.

कई महत्वपूर्ण समस्याओं है कि एक zebrafish प्रयोगशाला में उत्पन्न हो सकती है / व्यक्तिगत आवास प्रणाली में सभी टैंक, गरीब पानी की गुणवत्ता, और या पाइप परिसंचारी प्रणाली के जलाशय में रिसाव के लिए पानी की आपूर्ति की रुकावट शामिल हैं. इसके अलावा,प्रजनन से भ्रूण को प्राप्त करने में समस्याओं का एक और चिंता का विषय हो सकता है. इन मुद्दों के विघ्ननिवारण नीचे चर्चा की है.

चित्रा 1 एक पुरुष (A) zebrafish और महिला zebrafish (बी, सी) का एक उदाहरण है.

चित्रा 2 (ए) 12X, 90X (बी) पर एक नमकीन चिंराट, और 90X (सी) में एक unfertilized नमकीन चिंराट अंडे में एक नमकीन चिंराट के सूक्ष्म दृश्य.

चित्रा 3 निषेचित और unfertilized अंडे, जहां केवल दो अंडे unfertilized सूक्ष्म दृश्य (16x), unfertilized अंडे काले तीर के साथ संकेत कर रहे हैं, (ए). उच्च वृद्धिदृश्य (90X) एक निषेचित (बी) और एक unfertilized अंडे (सी).

चित्रा 4. एक महिला zebrafish (काला तीर के साथ संकेत) अंडनिधानांग चित्रण.

प्राचल	इष्टतम रेंज
क्षारीयता	50-150 मिलीग्राम / एल Caco 3
पीएच	6.8-7.5 (6.0-8.5 सहन)
तापमान	26-28.5 डिग्री सेल्सियस
कठोरता	50-100 मिलीग्राम / एल Caco 3
अन - ionized अमोनिया	<0.02 मिलीग्राम / एल
नाइट्रेट (कोई 3)	<50 मिलीग्राम / एल
नाइट्राइट (सं - 2)	<0.1 मिलीग्राम / एल
घुलित ऑक्सीजन	> 6.0 मिलीग्राम / एल
लवणता	0.5-1 ग्राम / एल
प्रवाहकत्त्व	300 -1500 μS

तालिका 2. जल की गुणवत्ता के मानकों का जल की गुणवत्ता के मानकों. Zebrafish ¹¹ मछलीघर में पर्यावरणीय मानकों का इष्टतम रेंज.

Discussion

उत्तरी भारत में गंगा नदी से उत्पन्न zebrafish और अनुसंधान के क्षेत्र में लोकप्रिय दोनों अपने वयस्क और लार्वा चरण ² में, बनने Spence एट अल द्वारा समीक्षा ^3.. Zebrafish उच्च उपजाऊपन, रखरखाव में आसानी, भ्रूण के ऑप्टिकल निकासी, तेजी से भ्रूण के विकास, और कम रखरखाव लागत के रूप में इस तरह के अन्य पशु मॉडल पर कई फायदे के अधिकारी. वे आनुवंशिक ⁶ हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी है और उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग ^{4,5 के} लिए उपयुक्त हैं. उनका निषेचन बाहरी, जो विकासात्मक जीव द्वारा अपने उपयोग के लिए फायदेमंद है. इन अनुकूल विशेषताओं के कारण, zebrafish आनुवंशिकी ^{7, 8,} औषधीय, और व्यवहार अनुसंधान ^9,10 में लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं. वहाँ एक zebrafish सुविधा और zebrafish पालन बनाए रखने के भ्रूण को प्राप्त करने के लिए चुनौतियों में से एक नंबर रहे हैं. के साथ साथ, हम इन चुनौतियों और ओ को संबोधित में अपने अनुभवों और सिफारिशों का वर्णनप्रणाली के रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल, भोजन, प्रजनन और लार्वा की स्थापना utline.

तंत्र अनुरक्षण

एक स्वस्थ हालत में zebrafish को बनाए रखने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए उन्हें एक ठीक से काम मछलीघर प्रणाली में एक स्वच्छ वातावरण के साथ उपलब्ध कराने के. इस का एक महत्वपूर्ण हिस्सा प्रणाली फिल्टर बदल रहा है नियमित रूप से इतना है कि सभी टैंक उचित जल प्रवाह और साफ पानी प्राप्त करते हैं. यह महत्वपूर्ण है अवरुद्ध प्रणाली पाइप के कारण प्रत्येक टैंक के लिए साइकिल चालन के पानी की आपूर्ति की विफलता से बचने के लिए. पाइप एक सामान्य पानी के दबाव की तुलना में अधिक है और प्रवाह का उपयोग कर साफ किया जा सकता है अगर रुकावट होती है. आदर्श रूप में, सिस्टम के पानी की 10% के आसपास अच्छा पानी की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए दैनिक प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, पानी जबकि कनस्तर या कार्बन फिल्टर बदल प्रतिस्थापित किया जा सकता है. यह सुनिश्चित करता है कि इन फिल्टर को जोड़ने पाइप में जमा गंदगी को हटा दिया जाता है. पानी की गुणवत्ता में एक नियमित आधार पर जाँच की जानी चाहिए. क्षारीयता, पीएच, temperat के रूप में इस तरह के मानकोंure, कठोरता, अमोनिया, भंग ऑक्सीजन, लवणता, चालकता और प्रणाली (विवरण के लिए 2 टेबल देखें) पानी की गुणवत्ता का प्रतिनिधित्व करने में महत्वपूर्ण कारक के रूप में माना जाना चाहिए. बहुत कम से नाइट्रेट, पीएच, तापमान, और आवास zebrafish के लिए अच्छा पानी की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के के लिए एक नियमित आधार पर निगरानी की जानी चाहिए. उच्च अगर इन स्तरों परिसंचारी प्रणाली में प्रणाली ताजा पानी के साथ पानी की जगह से कम किया जा सकता है, आदर्श नाइट्रेट स्तर (सं ³⁾ <50 मिलीग्राम / एल ¹¹ कभी कभी, फिल्टर अच्छी तरह से फिट नहीं है और रिसाव तो यह एक फिल्टर परिवर्तन के बाद किसी भी लीक की जांच करने के लिए सिफारिश की है. यदि मुख्य जलाशय से पानी के प्रवाह में या तो पानी पंप बदलने या एक फिल्टर को बदलने के बाद से अवरुद्ध है, पानी के प्रवाह या तो ढीला या कुछ सेकंड के लिए फिल्टर को दूर करने के लिए किसी भी पाइप में उत्पन्न किया जा रहा निर्वात जारी द्वारा बहाल किया जा सकता है. फिल्टर को बदलने के लिए आवश्यक समय कुल जैविक लोड ओ के रूप में विभिन्न कारकों पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैंn प्रणाली, अन्य फिल्टर की सफाई और गंदगी पाइप में जमा है. इसलिए, फिल्टर तुरंत अगर वे गंदे दिखाई देते हैं या अगर सभी टैंक सही पानी की आपूर्ति नहीं प्राप्त कर रहे हैं बदल जाना चाहिए. यह भी सिफारिश की है कि मछली शुद्ध 70% इथेनॉल के साथ साफ किया जाना है, और पानी में rinsed यह संक्रामक रोगाणुओं से मुक्त करना है, और करने के लिए किया जा रहा है फिर से इस्तेमाल करने से पहले सूखे की अनुमति दी है. सुखाने जो अन्यथा मछली के लिए विषाक्त है इथेनॉल के वाष्पीकरण को सुनिश्चित करता है.

Zebrafish प्रणालियों के अधिकांश de-chlorinated नल का पानी का उपयोग करें, लेकिन, कुछ सिस्टम विआयनीकृत जल का उपयोग करें. यह महत्वपूर्ण है के 300 और ~ 1500 μS बीच प्रणाली पानी की चालकता रखने के रूप में इस मछली के शरीर में लवण को बनाए रखने की जरूरत है कि ऊर्जा को कम कर देता है. इसलिए, zebrafish deionised पानी में नहीं रखा जब तक लवण इष्टतम चालकता का स्तर बनाए रखने के लिए जोड़ रहे हैं कर सकते हैं. संभव प्रणाली पानी में उच्च तांबे की सांद्रता के एक जोखिम है यदि नल का पानी क्योंकि कार्बन फिल्टर तांबे को दूर नहीं करता है के लिए प्रयोग किया जाता है. इसलिए, यूsers तांबे की सांद्रता के लिए जांच और तांबे पाइपिंग जहां संभव से बचने चाहिए.

भोजन

Zebrafish के रूप में इस पानी में नाइट्रेट का स्तर बढ़ाने के लिए, संभवतः उनके ¹¹ प्रजनन, या व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं, के रूप में कुछ ज्यादा खा के कारण मछली मर सकता है कभी नहीं overfed चाहिए. हम मछली के टैंक से 10 मिनट के भीतर खत्म कर सकते हैं किसी भी एक भोजन के दौरान कोई अधिक भोजन उपलब्ध कराने की सलाह देते हैं. यह बहुत महत्वपूर्ण है नमकीन चिंराट से पहले उन्हें zebrafish को खिलाने के रूप में अधिक नमक एकाग्रता मौत का कारण बनता है नमक निकालने के लिए. अगर अधिक zebrafish अंडे आवश्यक हैं, मछली तीन बार एक दिन में खिलाया जा सकता है. ब्रीडर मछली टैंक दैनिक सफाई भी अंडा उत्पादन के स्तर में सुधार है.

जब जलीय निवास सिस्टम पर खिला हम आम तौर पर पानी पंप और वायु पंप बारी करने के लिए 10 मिनट के लिए मछली खाना खाने के लिए अनुमति. यह भोजन की मात्रा कम हो जाती है कि फिल्टर में धोया है. हालाँकि, उपयोगकर्ताओं लोकलक्षी के लिए सावधान रहना चाहिएइन पंपों पर फिर बाद में बारी अंगारा.

प्रजनन

Zebrafish 3 ~ और उम्र के 18 महीनों के बीच इष्टतम प्रजनन हालत में आम तौर पर कर रहे हैं. Pairwise प्रजनन दो लगातार ¹¹ दिनों के लिए नहीं किया जाना चाहिए, लेकिन, एक टैंक के रूप में टैंक प्रजनन दैनिक प्रदर्शन कर सकते हैं कई मछली जो मछली एक पंक्ति में दो दिनों के लिए पैदा किया जा रहा है की इसी जोड़ी का मौका कम कर देता है पकड़ कर सकते हैं. प्रजनन नियमित अंतराल पर किया जाना चाहिए और यहां तक ​​कि अगर अंडे की आवश्यकता नहीं कर रहे हैं. इस प्रक्रिया में यह सुनिश्चित करेंगे कि मछली के प्रजनन चक्र को बनाए रखा है. यह सिफारिश की है कि वहाँ एक प्रजनन में पुरुषों सेट अप से अधिक महिलाएं हैं. पुरुष zebrafish एक दैनिक आधार ^{12 है} जो आगे इस सिफारिश का समर्थन करता है पर उनकी महिला साथी बदल जाते हैं. इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला के भीतर हम शुरू में प्रजनन के साथ समस्याओं का अनुभव है, तथापि, एक प्रजनन में पुरुषों की तुलना में अधिक महिलाओं को सेट अप का उपयोग करते हुए समस्या को हल करने में मदद की. इसके अलावा, एक उच्च प्रोटीन कॉन्टे साथ खिलाNT आहार और नमकीन चिंराट दो - तीन बार एक दिन, अलग (विभिन्न माता - पिता से) टैंक, 27 और 28 के बीच सेट अप डिग्री सेल्सियस, और अवरोधित अंडाशय ट्यूबों के साथ महिलाओं के पेट फैलाएंगे प्रजनन के तापमान को बनाए रखने से मिश्रण मछली हल्की मालिश आगे अंडा उत्पादन में सुधार. हम भाई बहन के बीच प्रजनन से बचने के लिए मछली लाइनों / मूल के एक रिकॉर्ड रखने की सलाह देते हैं. यह आगे भ्रूण उत्पादन में सुधार. प्रत्येक टैंक से मछली द्वारा निर्धारित भ्रूण की संख्या के रिकॉर्ड को ध्यान में रखते हुए भी सिफारिश की है. यह सबसे अच्छा प्रजनन मछली टैंक के एक ट्रैक रखने और बिछाने अंडे नहीं मछली में प्रजनन में सुधार के उपायों लेने के साथ मदद करता है.

लार्वा की स्थापना

लार्वा के दूध पिलाने 5 DPF (दिनों के बाद निषेचन) से शुरू करना चाहिए. युवा लार्वा आकार में 100 microns (जैसे, ZM100) या Paramecium और रोटीफर्स (जो विकास को बढ़ावा देने) के रूप में रहते हैं भोजन के सूखे भोजन के साथ खिलाया जा सकता है. भोजन आकार धीरे - धीरे बढ़ाया जा सकता है200 (ZM200 उदाहरण के लिए) microns या 300/400 microns (ZM300 उदाहरण के लिए). वयस्क मछली की आबादी प्रति लीटर पानी में 6-7 के आसपास मछली होना चाहिए. इस अभ्यास में बीओडी (बायोलॉजिकल ऑक्सीजन डिमांड) के टैंक को बेहतर रखरखाव के लिए सिफारिश की है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish circulating system	Aquatic Habitats, USA	AHAB stand-alone, bench-top systems
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6297
Fish food dispenser/Dry food feeder	Aquatic Habitats, USA	AH19
Microscope	Olympus	SZX12
Dry Food	ZM Fish food, UK	ZM100, ZM200, ZM300
Brine shrimp eggs	Salt Creek, Inc., USA	Premium Grade
In-tank breeders	Aquatic Habitats, USA	ITSTS-A
Activated carbon	Penn-Plax Pro-crab, USA	PBC3MF
Breeding tanks	Aquatic Habitats, USA	SBTANK (1L) Breeder Tank-2 (2L)
Red sea salt	Red sea salt, USA	Local pet store/ www.redseafish.com
Filters (Canister, filter pads, and UV)	Aquatic Habitats, USA	aquatichabitats.com
Siporax Media	Aquatic Habitats, USA	BF 820
Brine shrimp net	Aquatic Habitats, USA	BSN 1
Brine shrimp hatcher	Aquatic Habitats, USA	BS252
Baffles	Aquatic Habitats, USA	aquatichabitats.com
Table 1. Table of specific reagents and equipment used in this protocol.