Summary
כדי לטהר זיגוטות של
Abstract
זיגוטות הן ביניים מהותיים בין הפלואידים ומדינות דיפלואידיים במחזור החיים של אורגניזמים רבים, כולל שמרים (איור 1) 1. S. cerevisiae זיגוטות תוצאה מהאיחוי של תאים מסוג ההפלואידים הזדווגות מובחן (מאטה, MATalpha) ולהצמיח diploids היציב המקביל שיוצרים ברציפות רבה כמו 20 צאצאי דיפלואידי כתוצאה מחטיבות mitotic להדהים הסימטריות 2. היווצרות הזיגוטה היא בניצוחו של רצף מורכב של אירועים: בתהליך זה, גורמי הזדווגות מסיסות נקשרים לקולטנים מאותו המקור, מפעילים מפלי איתות קולטן בתיווך המאפשרים הפסקה של מחזור התא ומגיע לשיא באיחוי תאי תאים. זיגוטות עשויות לשמש מודל למולידו או תפקוד של תאי גזע.
למרות שדברים רבים כבר למד על היווצרות זיגוטות ולמרות זיגוטות שמשו כדי לחקור שאלות תא מולקולרית של כללי significance, כמעט כל המחקרים נעשה שימוש בתערובות הזדווגות שבזיגוטות מעורבבות עם רוב אוכלוסייה של תאי ההפלואידים 3-8. היבטים רבים של הביוכימיה של היווצרות הזיגוטה והחיים המתמשכים של הזיגוטה לכן יישארו לא נחקרו.
דיווחים על טיהור זיגוטות שמרים לתאר פרוטוקולים המבוססים על תכונות שיקוע 9, אולם, הליך המבוסס על שקיעה זו לא הניב כמעט 90% טוהר בידות שלנו. יתר על כן, יש לו את החסרון שתאים נחשפים לסורביטול hypertonic. לכן פתחנו הליך טיהור תכליתית. לצורך כך, זוגות של תאי ההפלואידים מבטאים חלבוני ניאון אדומים או ירוקים היו שותף מודגרות-לאפשר היווצרות הזיגוטה, שנקטף בזמנים שונים, וכתוצאה מכך זיגוטות טוהרו באמצעות פרוטוקול מיון cytometry מבוסס זרימה. טכניקה זו מספקת הערכה חזותית נוחה של טוהר והתבגרות. הטוהר הממוצעשל השבר כ 90%. על פי העיתוי של קציר, זיגוטות בדרגות שונות של בשלות ניתן לשחזר. את הדגימות המטוהרות מספקות נקודה נוחה של יציאה ללימודים "omic", להתאוששות של צאצאים ראשוניים, ולחקירה שיטתית של תאי אב זה.
Protocol
1. צמיחת תאי הפלואידים
- לגדול ס תאי cerevisiae מרקע S288C (BY4741) בתנאים רגילים 10.
- להפוך haploids להביע אחד משני סמנים בולטים ניאון 10. הסמנים של בחירה הם GFP מסיס הביע בציטופלסמה (pEG220, URA3/YIp, לינארית עם 11 BglII) וחלבון ריבוזומלי יחיד, RPL25, התמזג עם mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, מא ג'ונסטון). אנו מצפים כי פרוטוקולי טיהור מקבילות בשני צבעים שיכולים לעשות שימוש בחלבוני ניאון בוהקים אחרים המסונתזים על ידי תאי הורי ההפלואידים. לחלופין, דופן התא יכולה להיות מתויגת עם קטיני ניאון.
- ביום שלפני טיהור הזיגוטה, לחסן 5 מיליליטר תרבויות של כל סוג תא ולגדל אותם בניעור בלילה ב23 ° C כדי להגיע A600 אינו עולה 1.0. לגדול transformants GFP (ATY4442) במדיום סינטטי מלא כולל 2% גלוקוז (CSM-גלוקוז)transformants nd RPL25-mCherry (ATY4552) במצע סלקטיבי סינטטי חסר אורציל 10. לשמור על תרבויות מקבילות של כל סוג תא עם הרעד בטמפרטורת חדר.
2. ניצוח צלב
- התאם את הצפיפות האופטית (A600) של כל דגימה ל -1.0 במדיום טרי. [1 יחידת צפיפות אופטית 3 X ~ 10 7 תאים / מ"ל]
- ערבב נפחים שווים של שתי התרבויות, המערבולת בקצרה 3 פעמים, ואחריו עוד אחד למערבולת 10 שניות.
- הכן את צלחות CSM-גלוקוז. הצלחות זהות לאלה המשמשים לצמיחת שגרה וכבר התייבשו 45 דקות לאחר השפיכה והתמצקות של אגר 10.
- הפץ רבים כמו עשרים טיפין 40-ML של סנטימטר התערובת 1 מהקצה של פני השטח של צלחות CSM-גלוקוז. כאשר הטיפין מיושמות לראשונה למשטח להתחיל טיימר כדי למדוד את הזמן שהחלף. ברגע שהנוזל נספג (כ 30 דקות), לכסות את הצלחות ולהשאיר אותם ללא הפרעה ברוטמפרטורה מ '.
3. הכנות קצירה
- דגימות לאחר קציר 1.75-2.5 שעות ב 23 ° C על ידי שטיפת טיפין מיובשות בודדות שוב ושוב את הצלחת באמצעות 150-CSM גלוקוז הקר מ"ל, שומר את הצלחות על קרח. שוב ושוב לשטוף את אזור הטיפה 10-20 פעמים עם אותו המדיום על מנת למקסם את ההתאוששות. איסוף ב15 צינורות מ"ל פלקון על קרח.
- לחקור את דגימות sonicate 10x במשרעת 60% עם sonicator פישר FB120 (120Watt, 120Volt, התדר 20KHz) על קרח.
- ודא במיקרוסקופ שלב שכמה או לא אגרגטים יישארו. 15-50% מהתאים צפויים יצרו זיגוטות בשלב זה.
- השאר את הצינור של תאים בעמדת מפריע על קרח למשך 10 דקות כאמצעי זהירות נוסף (כדי לאפשר אגרגטים להתיישב) אנכית.
- שחזור 90% העליונים של הנפח ולסנן אותו דרך רשת ניילון (צינור פוליפרופילן BD פלקון עם מסננת כובע (Ref 352235)). בניסוי טיפוסי, 10 7 תאיםהתאושש מצלחת אחת היו בנקודה זו דוללה ל 4 מ"ל של CSM-גלוקוז.
4. זרימת cytometry
- תאי מיין באמצעות Cytometer סוני iCyt השתקפות דגם הזרימה, (מיין מקביל מאוד אוטומטי) HAPS1 עם טיפ מיקרון 100. עבור עירור GFP, השתמש הכחול ארגון יון, ליזר 250 milliwatt ב488 ננומטר. עבור עירור mCherry, השתמש בליזר 100 milliwatt ב561 ננומטר. למרות שאין לנו ניסיון עם מכונות אחרות, אנו צופים כי הקיטון דיקינסון FACSAria, זרם הקיטון דיקסון או Beckman Coulter MoFlo XDP יהיה בסדר כשהוא מצויד בלייזרים הנכונים.
- בסיס מיון פרמטרים על מגרש פיזור קדימה לעומת אחורי כדי שער בתאי קיימא. להקים עלילת פליטה של 615 + / - 30 ננומטר bandpass מסנן (mCherry) לעומת 525 + / - 25 ננומטר bandpass מסנן (GFP) לחלק את האירועים לארבעה רבעים, "אדום + הירוק", "אדום + ירוק +", "אדום ירוק ", ו" + אדום ירוק" (איור S2). השתמש בתאי nonfluorescent כF סטנדרטיאו קביעה של "אדום ירוק" ברבע.
- תאי מיין עם לחץ נדן של 21.5 psi, תדירות טיפה של 43,400 טיפין / שנייה, ולחץ מדגם של 20.5 psi.
- מיין ראשוני ("שחזור מצב"): איסוף דגימות לתוך צינורות מצוננים Eppendorf המכילים 250 מ"ל של CSM-גלוקוז קר. משקעי 10 שניות במהירות שיא בmicrofuge קירור (טומי MRX-150, 15000 סל"ד) ולשאוב את פתרון הזרימה (Flow cytometry פתרון נדן (PBS עם mM EDTA 1) BioSure מספר 1027). Resuspend ב 500 CSM-גלוקוז הקר מ"ל.
- סוג שני ("מצב טוהר"): התנהגות מהסוג כלמיון הראשוני, באמצעות האפשרות "המצב הטוהר". משקעים מטוהרים ותאי resuspend את הכדורים ב 500 המ"ל CSM-גלוקוז-1.0 מ"ל. Shake במשך 15 דקות בצלחות 24 גם ב23 ° C כדי לאפשר התאוששות מטבולים.
5. מיקרוסקופיה DeltaVision
- הכן רפידות agarose כדלקמן: תביא השעיה של 1.5% agarose (ultrapureAgarose, Invitrogen, קטלוג # 15510-07) בCSM-גלוקוז לרתיחה, בקצרה מערבולת, ולאחר מכן להחיל 0.3 דגימות מ"ל של פתרון agarose אל פני השטח של שקופיות זכוכית הרגילות אופקיות ולכסות אותם בפעם אחת עם שקופית שנייה (ללא הפעלת לחץ).
- לאחר הקירור למשך 10 דקות, בעדינות להסיר את השקופית העליונה על ידי החלקתו בצורה אופקית, דואג להשאיר את משטח חלק ולא להפריע לשכבת agarose. (כאשר השקופית העליונה הוסרה, הדגימה של תאים צריכה להיות מיושמת בתוך 1-2 דקות. כאשר שמרו בתא לח בטמפרטורת חדר מבלי להסיר את השקופית העליונה, כריות ניתן לאחסן עד יום לפני השימוש.)
- דגימות משקעות ופקדון 1 aliquots מ"ל של הגלולה בפנקסי agarose (בלי לגעת במשטח). מייד לכסות את המדגם עם coverslip כיכר מס '1. לחתוך agarose העודף עם סכין גילוח חד משמעי. לאטום את ההכנות עם וזלין חלקו ממזרק.
- תמונה באמצעות DeltaVision (יישומי Precision) עם מטרת 100x שמן טבילה ללא binning (אולימפוס UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
- Deconvolve Z-ערימות באמצעות 5.0.0 תכנית softWoRx (http://www.api.com/softworx.asp) ולעבד בצורה מינימאלית. מטוסי z רצופים נאספו בדרך כלל במרווחי 0.2-0.4 מיקרון.
6. נציג תוצאות
רמות עוצמת קרינה בתאי ההפלואידים שינו: רמת קרינה באת haploids מודגמת באיור S1. לפני שצלב הבדיקה, epifluorescent הראתה שלמעשה כל transformants GFP היו ירוק ושכל transformants mCherry, אם כי לעתים קרובות חלש, היו אדום. כדי להבטיח שכל התאים המשמשים לצלב אכן ניאון, השתמשתי בתת אוכלוסיות עם אות הניאון הבוהקת.
תשואה:חרה המיון הראשוני, אדום + הירוק + המדגם (איור S2) כולל בדרך כלל 8-20% ממספר הקלט של תאים ומספר מוגזם של תאי ההפלואידים, אולי בגלל הידבקות עיקשת תאי תאים. מאז העשרה גבוהה לא יושג במין אחד, המדגם המטוהר חלקית צריך להיות בדיקת sonicated פעמים במשרעת 60% ואחריו מחדש מיון. (מיני שחזור נמשך בדרך כלל בין 1-2 שעות, ואילו הסוג השני דורש רק 15 דקות.) של התאים נתונים לסוג השני, אדום + הירוקות + הדגימות כללו 23-52% מתאי הקלט.
בחינת שלב מיקרוסקופית: בדיקה על ידי מיקרוסקופ לעומת השלב הראתה כי טוהר הכנת הזיגוטה הסופית בממוצע כ 90% מעל 21 הכנות (החל מ 86% ל 91%). המזהמים היו או haploids ירוק או אדום, או זוגות haploids שהיו בקשר אחד עם השני. איור 3 tabulates אחוזים מזיגוטות שיש לילא ניצן, ניצנים המדיאלי (Med), ניצנים צדדיים (LAT) או ניצני מסוף (טווח), מספר haploids לזווג של אותו הצבע ("2Same") או צבע אחר ("2Hap"), כמו גם haploids הבודד ( האפ). כאשר תאים נקצרו לאחר 1.75 שעות, יותר מ 50% היו unbudded וקטגוריות המשנה האחרות (עם, לרוחב, או מסוף ניצנים המדיאלי) היו לא פחות מיוצגות. לאחר 2.5 שעות היו מספרים שווים, בערך, של זיגוטות בכל אחת מארבע קטגוריות (unbudded, עם ניצנים המדיאלי בצירה או במסוף).
תצפיות מיקרוסקופיות (איור 4):
מבנה זיגוטות מופיע להישאר ללא שינוי במהלך טיהור. על פי משך הזמן של הצלב, האוכלוסייה לממדים שונים של זיגוטות unbudded ונוצן, כמוסבר לעיל. מאז שני haploids הירוק והאדום הראה וריאציה ניכרת בעוצמת אות ניאון, כמה זיגוטות היו בעיקר אדומות, בעוד שאחרים היו בעיקר ירוקים, כפי שנצפה על ידי comparin גרם את התמונות יחידות צבע על התמונות המשולבות באיור 4. שימו לב גם כי GFP (MW 26kDa) נכנס לגרעין וניתן למצוא בגרעין גם כשהגרעינים לא התמזגו. Vacuoles עומד בתור כדורים שחורים שאינם ניאון.
התוצר הסופי של טיהור מניב אוכלוסייה מגוונת בשלבים שונים של פיתוח. זיגוטות כותרת היתוך לא עבר. זיגוטות סוג B נמצאים unbudded. הסוג C יש ניצן קטן. הסוג D יש ניצן גדול יותר, וזיגוטות E סוג עומדות לעבור cytokinesis. שימו לב גם שרבים מזיגוטות הקודמות עדיין להפגין קו חלוקה המדיאלי שאינו ניאון (*), וכי "מבנה הירושה" vacuolar (אני) 12 לעתים קרובות ניתן לראות להאריך מהזיגוטה לניצן. במקרים מסוימים, את האות הירוקה מחדש לשותף במידה הרבה יותר גדולה שהאיתות האדומה. זה משקף עיכוב של העברה המאפיין polysomes (Tartakoff, בהכנה).
תחת = "jove_content"> החל עם זוג 5 תרבויות לוגריתמי מ"ל של תאי ההפלואידים, אנחנו מחלצים כ 1-2 10 6 זיגוטות x, שזה מספיק לimmunoblots רב, תוך שימוש בנהלי איתור chemiluminescent. באמצעות פרוטוקולי בידוד פנול כלורופורם לחלץ אנחנו כ 1.5 מ"ג של רנ"א ממספר זה של תאים.
מאז זיגוטות המטוהרות היו מצוננות, לפני ניתוח נוסף אנו ממליצים הדגרה ב 23 מעלות צלזיוס במדיום גידול.
איור 1. כרונולוגיה של היווצרות הזיגוטה. זיגוטות כביניים בין haploids וdiploids. תרשים זה מראה את ההפעלה הקלסית (shmooing) של haploids, ההיתוך שלהם, והיווצרות של הניצן הראשוני. ניצנים יכולים להיות המדיאלי (M), רוחב (L) או מסוף (ט).
איור 3. זנים של זיגוטות בתערובות ההזדווגות המטוהרות שברים. נקצרו לאחר 1.75 או 2.5 שעות להתאושש שברים מועשרים בזיגוטות יחסית מוקדמות יחסית לעומת יותר בוגרות. שמונה ניסויים עצמאיים, מסומן בצבעים השונים, שבוצעו עבור כל נקודת זמן. הגרפים מציינים את המספרים היחסיים של זיגוטות שחהve דפוסים ברורים מרחבית של היווצרות ניצן. בהינתן המשך הקצר של הדגירה (פחות מ -2.5 שעות בטמפרטורת חדר) כל הניצנים שנצפו הם אירועי ניצנים zygotic ראשוניים.
איור 4. בדיקת DeltaVision של שברים מועשרים. תחום טיפוסי נבדקה על ידי מיקרוסקופ DeltaVision. האיורים מראים שני צבעים הם אדומים וירוקים או רווקים. אדום מתאים לתווית polysomal (Rpl25p-mCherry) והירוק לGFP cytosolic. שים לב להעשרה הגבוהה של זיגוטות, ואת תכונות subcellular הייעודי: את וקואולות (V), ניצנים (ב), גרעין, "מבנה ירושה" (n) vacuolar (אני), והמחיצה (*) המופיעה להפריד ההורים דומיינים בזיגוטות מוקדם יחסית. הצבע הכללי משתנה משקף את העצמה היחסית של haploids שהתמזג. במקרים בם שני תחומי ההורים לשמורנבדל צבע, האיזון של הסמנים (GFP cytoplasmic, mCherry בתיוג polysomes) לא היה שלם. מחקרי זמן לשגות בהתקדמות להראות שמחלק מחדש GFP מסיס לפני polysomes. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
אגדות משלימות
S1 דמות. הקרינה של תאי ההפלואידים עזב רחוק:. תאים להביע polysomes mCherry מתויג-נבדקה כדי לזהות אות ירוקה. החלון המלבני הוקם כדי למנוע את התאים השליליים. גרף תיכון: תאים להביע GFP cytosolic נותחו, מראים אוכלוסייה העיקרית מובהק הבהירה של תוצאות חיוביות. ימין קיצוני: תאים המבטאים polysomes mCherry מתויג-נותחו. המלבן (זהה לזה שבשמאל קיצוני) כולל את התאים הבהירים ומאפשר לכלתשלילים שיש להימנע. הייעוד "R2" מציין את אחוז התאים התאוששו בתוך המלבן שצוין.
איור S2. חלוקת תא במיון הראשון ושני. חלקות אלה שני צבעים מצביעה על השיעור ירוק + אדומים + תאים ברבע הימני העליון (R5). שיעור זה עולה ל 52% בסוג השני. ציר אופקי: אות ירוקה. ציר אנכי: איתות אדומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזמינות של זיגוטות מטוהרות צריכה להקל על מחקרים ביוכימיים כולל transcriptomics, פרוטאומיקה וlipidomics, כמו גם חקירה של מנגנונים שבאמצעותם זיגוטות עוברות מחזור תא כניסה מחדש, שיפוץ דופן תא, מאפייני ניצנים וירושה, וכו 'לחלופין, זיגוטות יכולות להיות שנוצרו החל עם זנים שנשאו מוטציות אופייניות באחד או שני ההורים. יתר על כן, זיגוטות המטוהרות, כמו לתאי ההפלואידים או דיפלואידי, אפשר להקפיא במדיום המכיל גליצרול 15% ולאחר מכן הפשירו לפקח היבטים של ניצנים חוזרים.
ניסויים ראשוניים באמצעות סמני ניאון אחרים מתאימים למטרות מיקרוסקופיות (למשל ההיסטונים מתויגים או חלבוני המיטוכונדריה) לא אפשרו שחזור אמין של זיגוטות, עם זאת, סביר להניח כי טיהור דומה ניתן להשיג החל מתאי ההפלואידים תא שקיר כבר מצמיד אדום או fluorophores הירוק. שלנו היו להימנענהלי UCH שכן הם יכולים להטיל עומס נוסף ולהשפיע על שלבים מוקדמים של היווצרות הזיגוטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ר 'מיכאל Sramkoski לעזרה עם cytometry זרימה, ד"ר Purnima Jaiswal וד"ר די וו עבור קלט מוקדם יותר ואיליה Aylyarov לעזרה באיורים. נתמך על ידי NIH גרנט R01GM089872 וCytometry & Core מתקן הדמיה מיקרוסקופית של קייס מרכז הסרטן המקיף (P30 CA43703).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 | |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 | |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | ||
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | ||
| Upright epifluorescence microscope | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B. Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , Cold Spring Harbor Press. (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
