Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

Summary

Nós descrevemos um método para medir diretamente a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis e fatigabilidade de músculos esqueléticos isolados em um

Abstract

Descrito aqui é um método para medir a contratilidade dos músculos esqueléticos isolados. Parâmetros, tais como a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis, fatigabilidade ea recuperação após a fadiga pode ser obtido para avaliar aspectos específicos do acoplamento excitação-contração (ECC) do processo, como a excitabilidade, máquinas contrátil e Ca ^{2 +} capacidade de manipulação. Este método remove o suprimento nervoso e sangue e se concentra sobre o músculo esquelético isolado em si. Rotineiramente usar esse método para identificar os componentes genéticos que alteram a propriedade contrátil do músculo esquelético embora modulação Ca ^{2 +} vias de sinalização. Aqui, nós descrevemos um fenótipo do músculo esquelético recentemente identificado, isto é, a alternância mecânico, como um exemplo de várias informações e rico que pode ser obtida utilizando o ensaio in vitro a contractilidade do músculo. Combinação deste ensaio com ensaios de célula única, as abordagens genéticas e bioquímicasensaios Stry pode fornecer importantes insights sobre os mecanismos de ECC no músculo esquelético.

Introduction

Os músculos esqueléticos anexar a ossos do esqueleto e gerar forças contrácteis sob o controlo do sistema nervoso central. Acoplamento excitação-contração (ECC) refere-se ao processo de conversão de um estímulo eléctrico a uma resposta mecânica. Ca ^{2 +} de sinalização é um componente essencial da função contráctil do músculo esquelético. Eficaz a mobilização de Ca ^{2 +} do retículo sarcoplasmático (RS) é um componente importante para ECC em células musculares ^{1, 2,} e mudanças no Ca ^{2 +} intracelular de sinalização estão subjacentes à disfunção contráctil correspondente numa série de doenças musculares ^3-5. Avaliação adequada da contratilidade muscular é essencial e complementar ao Ca ^{2 +} de imagem e outros ensaios para obter insights sobre a função do músculo esquelético, não apenas no nível de contração, mas também ao nível cinética. Força e velocidade também pode ser obtido a informar a propriedade importante deforça muscular e do estado do processo de ECC em diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas.

Este campo fecundo de pesquisa tem uma história muito rica e muitas teorias de contração muscular apareceu mais de dois milênios ^6. Pesquisa muscular moderna provavelmente começa em 1674-1682 com a observação microscópica de cross-estrias e miofibrilas nas fibras musculares por Leeuwenhoek ^6. Quase um século depois, Luigi Galvani observou que os contratos musculares sapo vigorosamente quando seu nervo é tocado com bisturi durante uma descarga de centelha de uma máquina elétrica distante ^7-9. Contracção pode também ser produzida através da ligação do nervo para o músculo da perna por meio de um condutor metálico. Os detalhes do mecanismo de sinalização elétrica complexa defendidas por Galvani foram eventualmente formulado por Hodgkin, Huxley e Katz em sua famosa equação ^{10, 11,} que se tornou a base de eletrofisiologia. As observações notáveis ​​de Ringer sobre os efeitos do Ca ^{2 +} extracelular sobre a contractilidade do coração e músculos esqueléticos rã ^12-15 representam o primeiro passo importante no reconhecimento de Ca ^{2 +} como um regulador chave da contractilidade do músculo ^{16, 17.} A partir da década de 1980 até os dias atuais uma explosão de descobertas no campo da contratilidade muscular foi realizado devido à introdução de contratilidade muscular e protocolos fatigabilidade em murinos músculos esqueléticos ^18. Jones e Edwards foram os primeiros a sugerir que a fadiga de baixa freqüência intermitente (induzida pelo exercício diminuição da força) ¹⁹ foi associado a alterações no maquinário ECC e não o aparato contrátil. No final dos anos 1980 e início de 1990, Kolkeck et al ^20, Kolbeck e Nosek ^21, e Reid ²² foram usar o músculo diafragma de modelos de roedores para estudar os efeitos da teofilinas, cortiosterone, e radicais livres sobre a contratilidade muscular, enquanto Brooks e Faulkner foram os primeiros a informar sobre as medidas de força repetida e medições de potência em fast-e-lento músculos de ratos ^22. Além disso, Lannegren, Westerblad, Cordeiro e Westerblad foram os primeiros a ligar diretamente contratilidade ex vivo com Ca ^{2 +} intracelular regulação e começou a questionar o papel da acidose em fadiga muscular ^{23, 24.}

Nossos laboratórios têm contribuído significativamente desde o início de 2000 para a compreensão de novos genes com modulador e funções de regulação no músculo ECC com papéis críticos da contratilidade muscular, cansaço e envelhecimento, usando uma combinação de intactas rato estudos de contratilidade muscular, intracelular de Ca ² monitoramento ⁺ em intactas e sem pele fibras musculares e molecular-genéticos manipulações ^{3-5, 25-29.}

Aqui nós mostramos o protocolo experimental para medir a contratilidade de murinos sóleo isolados e longus extensor dos dedos (EDL) dos músculos, o que corresponde a uma maior parte slow-oxidativo (tipo I e IIa fibras musculares) e um músculo principalmente fast-glyocolytic (tipo IIb e fibras musculares IIx) com distintas propriedades contrácteis. Neste protocolo, intactas músculo-tendão complexos foram isolados e banhado numa Radnotti PowerLab ADI sistema de câmara fornecido com ou oxigénio puro ou uma mistura de oxigénio (95%) _e CO2 (5%). Forças contrácteis foram gerados por estímulos eléctricos a partir de um estimulador Grass e detectado utilizando um transdutor de força que foi integrado com um sistema de PowerLab/400 ADI, o que permite a personalização de rotinas de macro para controlar a aquisição, a recolha, a digitalização e armazenamento de dados. Esta configuração pode medir a força muscular, força muscular, assim como a relação força versus frequência, fadiga muscular, a recuperação da fadiga muscular, velocidade e propriedades cinéticas totais de contração muscular. Além disso, os efeitos de drogas sobre a contração do músculo pode ser monitorado através destas experiências. As vantagens deste método reside na remoção dos componentes neuronais e vasculares de distância a partir do músculo esquelético, o que permite avaliar directamente as propriedades intrínsecas de contrair o músculo. Além disso, os ensaios de contratilidade ex vivo permite que a manipulação do meio extracelular em torno dos músculos isolados, o que permite o uso de manipulações farmacológicas de vários canais de iões e transportadores de permeação, de modo a definir os seus papéis fisiológicos para a função do músculo esquelético.

Este sistema ex vivo nos permitiu descobrir recentemente um comportamento distinto alternano em certas preparações de músculo mutantes, que estavam ligados a alteração do Ca ^{2 +} intracelular manipulação propriedades ^4. Alternans são definidos como episódios de ruptura flutuação de força contrátil durante a fase de declínio do perfil fatigante. Durante esses eventos forças contráteis aumentar momentaneamente acima de seu nível anterior de força durante estimulação cansativo, talvez porque seja mais Ca ^{2 +} está sendo lançado ou a maquinaria contrátil tornou-se mais sensível ao Ca ^{+ 30 2.} Tratamento de ciclopiazônico ácido (CPA), um bloqueador reversível da sarcoplasmático-retículo endoplasmático cálcio ATPase (SERCA), cafeína, um agonista de rianodina canal (RYR) e repetiu fatigante estímulos podem induzir a alternância mecânica ^4, sugerindo que a alternância estão diretamente relacionados à modulação do processo de acoplamento CE. Demonstração do método de induzir e gravar alternância mecânico in vitro configuração contratilidade serve como um exemplo para mostrar os parâmetros diversificados experimentais que poderiam ser obtidos com este sistema ou similares, com base em interesses de pesquisa individuais.

Este método pode ser de interesse para os investigadores que estudam a fisiologia muscular. Configuração similar pode também ser usado para os complexos isolados de outros muscle-tendon/ligament esqueléticoslocalizações anatómicas, assim como para as fibras individuais e as tiras musculares.

Protocol

Composição da solução:

2,5 mM de Ca ^{2 +} solução de Tyrode: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2,5 _mM, MgCl2 ₂ mM e 10 mM de glicose

0 mM de Ca ^{2 +} solução de Tyrode: 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de HEPES, 2 mM _de MgCl2, 0,1 mM de ácido etileno-glicol tetraacético (EGTA) e 10 mM de glicose

Nota: A solução de banho deve ser saturada com 100% O _2, se utilizar a solução acima, mas com _95% de O2 5% de CO _2, se utilizar bicarbonato à base de tampões para manter o pH constante. 2,5 mM ^de Ca2 ⁺ é adicionado ao tampão de banho para recapitular o nível de Ca ^{2 +} encontrado no espaço extracelular e 10 mM de glicose é importante uma vez que as mitocôndrias são ainda funciona nestes músculos para produzir continuamente ATP na presença de glucose.

1. Criação do Experimento Contratilidade Ex Vivo Usandoa ADI Sistema PowerLab

1. Um desenho esquemático de um sistema de 4 canais contractilidade ex vivo é mostrada na Figura 1. Um computador controla um estimulador para gerar impulsos de onda quadrada, que são filtrados pela unidade de isolamento, para chegar a um par de fios de platina em torno de cada complexo musculotendínea isolado. Isto é também chamado de estimulação de campo. Contracção do músculo de responder à estimulação foi detectada por um transdutor de força, o sinal gerado a partir da qual foi amplificada, filtrada e transferido de volta para o computador através de um conversor A / D (condicionador de sinal). O sinal é então digitalizado e pode ser guardada para posterior análise.
2. Para se preparar para uma experiência ex vivo contractilidade, por sua vez, primeiro sobre o estimulador de campo, o conversor A / D (no caso de alimentação ADI Lab) ou um software semelhante (por exemplo, LabView), seguido pelo computador.
3. Abra Chart4 software (ou a versão de outro software que compatível com o sistema) e deram inícioea tarefa de 4 canais, a comunicação adequada do software e do hardware é indicado por iniciar a configuração do hardware, eo botão START no software se torne operacional (ao vivo), a função de 4 canais permite a medição simultânea de um par de músculos de um tipo selvagem e mutantes, um ratinho ou 2 EDL e dois músculos soleus do rato mesma, e pode ser utilizado para outros músculos, tais como o diafragma (diafragma inteiro, hemi-diafragma, ou tiras de músculo do diafragma) e tibial anterior; ele também pode ser usado para a preparação do músculo cardíaco e para feixes de músculos, particularmente se um for utilizando músculo de rato. Neste caso, o tamanho dos músculos podem limitar a difusão de oxigénio para que feixes musculares são, assim, uma melhor escolha. No entanto, as técnicas de dissecção peritos são necessários para a preparação do pacote de músculo.
4. Calibração do transdutor de força: isso é para garantir a comparabilidade dos conjuntos de dados gerada em canais diferentes e em tempos diferentes. Gravação primeira partida, Sequentially pendurar um 1-g, 2 g e 5 g, peso do bosque amostra do transdutor de força, parar a gravação, calcular as alterações correspondentes na mV mostradas em cada um dos canais de Chart4 software, traçar a ΔmV e o peso a verificar a linearidade e determinar o fator de conversão entre mV e gramas de força. Recomendamos executar estas calibrações ou no início ou no final de cada experiência para assegurar que uma calibração específica é obtida para cada experiência específica.
5. Verificar a ligação correcta do tubo de Teflon, drenar todo o líquido contido no tubo de banho de tecidos, lavar as câmaras de três vezes ou mais com DDQ ₂ O e encher com 20 ~ 25 ml de 2,5 mM de Ca ^{2 +} solução de Tyrode. Ca ^{2 +} e glicose são fornecidos na solução do banho para ajudar a manter a integridade da membrana, óptima Ca ^{2 +} carregamento da SR, e uma fonte prontamente disponível de energia para a geração de ATP no músculo em si, uma vez que as mitocôndrias permanecer totalmente funcional nestas preparações.
6. Verifique a conexão adequada do suprimento de oxigênio, abrir o tanque de oxigênio, e ajustar o fluxo de oxigênio para fornecer borbulhante difusa e homogênea da câmara. Os níveis de oxigénio pode ser facilmente determinado como uma função da força contráctil em função do tempo. Um medidor de fluxo também podem ser instalados, em particular se os pesquisadores estão interessados ​​em estudar os efeitos da hipoxia ou hiperoxia. Se os músculos se tornam hipóxicos, a força diminui naturalmente. Enquanto a hiperoxia também podem danificar os músculos, mas os seus efeitos podem ser mais difíceis de ser detectadas porque a maioria dos experimentos são realizados sob condições artificiais hiperóxicas para compensar a ausência de um suprimento de sangue normal para os músculos. Na maioria dos sistemas, é possível bolha câmaras diferentes, com a mesma quantidade de oxigénio simples, controlando o fluxo de oxigénio para cada câmara constante.
7. Ajuste da sensibilidade de todas as vias para assegurar a resolução de força máxima sem saturar o canal. Sensibilidade do canal pode variar consideravelmente em função de umd idade do animal, temperatura experimental, manipulações genéticas, tamanho muscular, tensão do rato, ea habilidade de experimentador corretamente dissecar os músculos livres de danos. Na nossa experiência, quando se mede a força contráctil sóleo, a sensibilidade varia de 0,5 a 10 mV / cm, enquanto que no caso de EDL, a sensibilidade pode variar 1-20 mV / cm.
8. Um protocolo para a estimulação fatigante precisa ser estabelecido. No software Chart4 uma macro podem ser usados. Para programar uma nova macro: no software Chart4, clique em iniciar a medição, em seguida, clique em Macro, comando Macro, iniciar a gravação, comece a repetir, escolha freqüência de estímulo desejado e, em seguida, repita fim. Para um protocolo de equilibração, o estímulo é repetido a cada minuto durante 30 minutos e para fatigante protocolo, o estímulo é repetido a cada 2 segundos durante 5 minutos. Estas mudanças na periodicidade da estimulação, afectam directamente o ciclo de trabalho, o que é também uma função da duração da estimulação. Estes parâmetros podem ser variados para testar diferentes aspects de contratilidade e cansaço.

2. Preparando feixes musculares intactas

1. Dissecção EDL: mouse é sacrificado seguindo diretrizes do NIH e IACUC protocolos institucionais animais. Rato é sacrificado por deslocamento cervical. Rato é, então, dispostos em posição lateral. Músculo EDL é um músculo rápido glicolítica com a cor rosa-branco pálido. É cerca de 10-13 mm de comprimento e pesando 8-11 mg de tipo selvagem C57BL / 6 mouse. O EDL tem as funções de estender os dedos 2-5, e dorso-flexão do pé no tornozelo. É inervado pelo nervo fibular. Para dissecar o EDL, fazer uma incisão na pele superficial e cortou a fáscia entre o tibial anterior e do grupo muscular posterior, e localizar a origem (proximal), onde ligamento é ligado ao côndilo lateral da tíbia e superior de 3/4 do anterior superfície da fíbula (margem interóssea). Cortar o ligamento com uma tesoura oftálmicas delicados como distalmente possível do músculo, o que procedure liberta a origem proximal do músculo EDL. Segure o ligamento com uma pinça sem corte e puxar lentamente para liberar o EDL. Pode ser necessário cortar alguns dos perimísio envolve os músculos EDL e outro em torno do EDL, uma medida que é crítica uma vez que podem ocorrer danos no músculo EDL durante esta etapa delicada. Em seguida, passar para a região de inserção onde os quatro tendões distais inserir nas falanges médias e distais de 2-5 dígitos. Cortar os tendões, tanto quanto possível, a partir dos músculos.
2. Transferir o músculo EDL isolado em um prato de dissecação contendo solução de Tyrode isotónica. Alguns modelos animais mutantes, transgénicos e knockout tem músculos muito frágeis e utilização de Ca ^{2 +-solução} de Tyrode livre é necessário para evitar Ca ^{2 +} induzida por lesão muscular antes das medições da contractilidade. Em seguida, utilizar um nó cirúrgico para amarrar firmemente em ambas as extremidades do músculo EDL como distalmente a partir do músculo do possível. Uma boa medida é amarrar um pouco acima do meio-point longitudinal do ligamento ou tendão. Use 6-0 tamanho para este procedimento, e transferir o músculo EDL para a câmara de banho de O _2-saturado tecido, montar o músculo no sulco da amostra do transdutor de força e o gancho de papelaria no fundo da câmara de banho, repetir o processo para o outro pé. Também estamos começando a utilizar um novo método que mantém os músculos com pinças em vez de suturas. Se o objectivo principal é o de estudar as propriedades cinéticas e / ou para obter a força muscular, recomenda-se que a sutura seja o mais curto possível ou a sutura ser substituído por uma haste de metal.
3. Dissecção sóleo: o sóleo é um músculo em sua maioria de baixa oxidativo com vermelho rico. É ~ 1 mm mais curto do que o EDL mas pesa um pouco mais do que o EDL. É inervado pelo nervo tibial e ele executa a ação de flexão plantar do pé. Para dissecar o sóleo, acessar o lado lateral posterior da perna, colocar de lado o músculo gastrocnêmio, que normalmente cobre a soleus, e identificar o músculo com a cor vermelho escuro. Na origem (proximal), corte os ligamentos que ligam a metade proximal da tíbia posterior ao longo da linha soleal e 1/3 proximal da fíbula posterior; seguinte, no local de inserção (distal), cortar o tendão que se insere na posterior calcâneo. Cuidadosamente liberar o sóleo e devidamente montar o músculo sóleo na câmara de banho como para a EDL.

3. Medindo Contratilidade dos músculos isolados esqueléticas

1. Uma vez que os músculos são montados em câmaras de banho individuais de tecido, iniciar a gravação. A maioria dos sistemas semelhantes permitir zerar da linha de base da gravação vigor. Esta função é geralmente associada com o amplificador, no caso específico do sistema PowerLab, como função do amplificador de ponte. Ela facilita a observação de mudanças de linha de base e fornece uma maneira conveniente para todas as contrações musculares para ser analisado a partir de zero. Músculos isolados são então estimulados com pulsos de onda quadradaque pode variar amplamente em função da dimensão da câmara, da espessura fios de platina, a distância entre os fios, e mesmo a composição da solução experimental. Nós empregamos corrente de 60 mA (notamos que as correntes acima de 350 mA parecem ser prejudicial para preparações de músculo) e trens estimulatórios de 350, 500 e 1000 ms, dependendo dos objetivos de um protocolo específico. Os pulsos de onda quadrada individuais devem ter duração variando 0,3-1 ms.
2. O próximo passo é seleccionar uma frequência de estimulação capaz de produzir uma estimulação tetânica fundido (ex: ~ 100 Hz para permitir a produção de força máxima no músculo EDL e ~ 60 Hz no músculo sóleo) enquanto lentamente e cuidadosamente esticar os músculos para identificar o comprimento ideal dos músculos. Como os músculos são cuidadosamente esticado, aguarde 30 s e estimular a 100 Hz; esperar 30 s e esticar novamente, e depois repetir o estímulo, até o ponto onde a força não aumenta mais.
3. Estes músculos têm undergonde e mudanças significativas no meio ambiente. Recomenda-se que os músculos ser permitida para se adaptarem ao novo ambiente, um passo em nossos protocolos denominado "equilíbrio". Equilibrar estes músculos com a mesma frequência de estimulação utilizada durante a fase de estiramento, 100 Hz durante 20-30 minutos, até que pelo menos 5 consecutivas contrações tetânicas são completamente estáveis ​​(não redutor, não aumentar, de linha de base estável). Periodicidade dos comboios estimuladoras (100 Hz, duração de 500 ms, 1 ms indivíduo pulso) durante 1 min de equilibração é, o que equivale a um ciclo de trabalho de 1,66%, um estímulo não cansativa. Neste contexto, um ciclo de trabalho de 1,66% significa que, ao longo de um total de 100%, os músculos estão trabalhando 1,66% das vezes, através do aumento dos músculos de ciclo de trabalho pode, eventualmente, ser induzidas a fadiga. Se de outro modo os músculos de rato saudável, tipo selvagem mostram um perfil de fadiga, durante este período de equilíbrio, é possível que eles foram danificados durante a dissecção, hipoxia ocorre nas câmaras / músculos, ou elementos excessivoctrolysis através dos eléctrodos de estimulação está a gerar radicais livres. Westerblad sugeriu anteriormente que correntes maiores do que 400 mA induzir a formação de radicais livres ^23. Obviamente, a platina de alta qualidade é sugerido, uma vez que os outros metais, certamente, levar à formação de radicais livres e de toxicidade muscular.
4. Obter a relação força versus frequência (FF), estimulando os músculos, com as frequências de estimulação seguintes: 1-140 Hz (em incrementos de 5-10 Hz), com uma periodicidade de 30-60 s quando realizando experiências a 25 ° C. Ao realizar experimentos a 37 ° C, estender o FF para freqüências mais altas de até 300 Hz para o músculo diafragma, 180-200 Hz para sóleo, e 220-250 Hz para EDL. Em seguida, identificar a freqüência de estimulação que gera força tetânica máxima (T _max) e cerca de ½ força tetânica máxima (1/2 T _max), às vezes é difícil obter o _máximo exata ½ T para o EDL e úniconos músculos se apenas uma fonte de estimulador está sendo usado, por causa das diferenças intrínsecas entre estes músculos. Uma solução viável é identificar uma frequência que produz 30-70% de o T _max. A justificativa para essas freqüências de estimulação é que _Tmax fornece informações importantes de eventos contráteis máquinas / modulação, enquanto o ½ T _max fornece informações mais pertinentes ao ² Ca ⁺ regulação e do processo de ECC. Para ter a certeza de que a força máxima foi alcançada, 10-20 mM de cafeína pode ser adicionado à solução do banho enquanto estimulam o músculo. Se a força máxima foi alcançada, a força não aumentará, na presença de cafeína. O FF é deslocado para a direita e as forças tendem a ser ligeiramente superior a mais altas temperaturas do ensaio. Usando este sistema, as outras frequências de estimulação pode ser realizado se desejável. O perfil distinto contrátil do músculo rápido glicolítica EDL e uma lenta oxidativo músculo sóleo émostrado na Figura 2.
5. Após o equilíbrio, a fadiga dos músculos da ½ T _max de 5 min, com intervalo de estimulação de 2 s e ciclo de trabalho de 25% (Figura 3). Este protocolo fatigante específico é acreditado para refletir melhor a contribuição do retículo sarcoplasmático Ca ^{2 +} de lançamento para ³¹ contratilidade muscular.
6. Recuperar o músculo em ½ T _max de 30 min ou até que a força é estável, em intervalos de 1 min. Um protocolo de fadiga adicional pode ser realizada usando agora T _max estimulação, o que acredita-se que reflectem o estado da maquinaria contrátil ^31. Outra opção consiste em alargar o protocolo de fadiga de intercalar trens estimulatórios que geram T _max e T _max durante ½ a fadiga e para recuperar os músculos, com o mesmo tipo de estimulação.
7. Repita o FF tal como descrito no passo 3.4, a razão sendo que as diferenças fenotípicas entre diffestirpes erent, modelos de doenças ou tratamentos medicamentosos podem ser observadas através da análise do FF antes e depois da fadiga. Temos por exemplo anteriormente relatado que, após a fadiga FF de jovens músculos do tipo selvagem é deslocada para a esquerda, enquanto que no músculo dos músculos envelhecidos, é deslocado para a direita, o que sugere efeitos diferenciais modulatórios da fadiga do músculo esquelético, como uma função da idade.
8. Para investigar a contribuição do Ca ^{2 +} extracelular entrada na contractilidade do músculo, solução de banho pode ser alterado dentro de uma solução que não contém Ca ^{2 +} 0,1 mM de EGTA, mas (0 mM de Ca ^{2 +} solução de Tyrode) ^32. Alternativamente, os bloqueadores diferentes de armazenamento de accionamento do canal pode ser aplicado na solução de banho. Alguns exemplos são: 2-aminoetil diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-bis (trifluorometil)-pirazole 2 (BTP-2) e azumolene, etc ^{33, 34.} A cafeína pode ser usado para sondar a função do receptor de rianodina, e KCl pode ser usada para avaliar o conjuntopropriedades despolarização desses preparados. Outros fármacos podem também ser utilizados para investigar a modulação importante da força durante a fadiga por Na ^+, K ^+, Na ⁺ e a K ^{+-bombas 35.} A maioria dessas drogas têm tamanhos relativamente pequenas e parecem rapidamente espalhar para essas preparações de músculo como evidenciado pelos seus efeitos imediatos. A falta de um efeito de quaisquer fármacos administrados, não significa necessariamente que o medicamento é ineficaz e testes adicionais utilizando dose muito mais alta do que a utilizada em experiências de fibras musculares individuais são por vezes necessárias.
9. Uma aplicação única deste sistema ex vivo conduziu à descoberta recente de alternância mecânico em tric-a ^{- / - 4, 30} músculos. Alternans são definidos como episódios de ruptura flutuação de força contrátil durante a fase de declínio do perfil fatigante. Durante esses eventos força contrátil pode aumentar momentaneamente acima de seu nível anterior de força durantefatigante estimulação porque que ou mais de Ca ^{2 +,} ou está a ser libertado a maquinaria contrátil tornou-se mais sensível a Ca ^{2 +.} O surto força contráctil tem de ser 50% mais elevada do que a sua força anterior e os focos deve ser visto, pelo menos, 10 vezes durante o processo de estimulação de 5 min a fadiga. Alternans mecânico não são comuns no músculo esquelético dos ratinhos do tipo selvagem, mas pode ser visto em alguns músculos mutantes com perturbação da intracelular de Ca ^{2 +} processo de sinalização, tais como o tipo de canais de catiões trimérico Intracelular A (tric-a) ^- músculo ^{- / 4.} Alternans mecânico pode ser induzida através de estímulos fatigantes, o tratamento com ácido e cafeína ciclopiazônico (CPA), ver a figura 3 para uma gravação representativa destas alternans mecânicas. A natureza deste fenômeno é bastante intrigante, enquanto um músculo que é fatigante parece capaz de produzir mais força momentaneamente. Em nossa publicação anterior, Combinação com uma única célula de Ca ^{2 +} análise revela que a aparência de alternância é um resultado de SR Ca ^{2 +} SR sobrecarga e instável. Cremos que uma compreensão mais profunda da alternância poderá conduzir a uma melhor compreensão do processo de ECC.
10. No final da experiência, medir o comprimento e peso dos músculos individuais usando paquímetro e balança analítica calibrada, rapidamente congelados do músculo em azoto líquido e guardar a -80 ° C, uma vez que as análises bioquímicas podem ser realizados nestes músculos. Estes músculos pode também ser mecanicamente descascado para sondagem detalhada do processo de ECC, ou ser quimicamente esfolados essenciais para a determinação de propriedades contrácteis na ausência de mecanismos de regulação de ECC.
11. Força muscular registada (mV) é primeiro convertido em grama força com base em resultados de calibração e, em seguida normalizado para a área da secção transversal fisiológica (PCSA) utilizando a seguinte fórmula: a força muscular (N / cm ²⁾ = (a força (g) x muscular length (cm) x 1,06) / (peso muscular (g) x 0,00981) ^5,36. Alternativamente, a força do músculo pode ser normalizada para a proteína total ou conteúdo total de actina do músculo individual, utilizando ensaio de proteína de Bradford / Commossie quantificação coloração azul. Sob certas condições, enquanto que a massa muscular pode ser severamente afectada devido a doenças, senescência, tratamentos medicamentosos, a normalização força com base na massa muscular, a proteína e / ou o conteúdo de actina pode proporcionar uma leitura mais estável.

4. Resultados representativos

Forças de apartamentos típicos temperatura contrácteis do EDL e soleus que respondem a estímulos de frequência baixa, média e alta são mostrados na Figura 2. A contracção induzida por 5 EDL estímulo Hz permanece como espasmos individuais devido a uma acção rápida do Ca ^{2 +} ATPase SERCA e o Ca ^{2 +} intrínseco propriedades de sensibilidade da maquinaria contráctil, enquanto que a contracção por sóleo 5 Hz começa a fundir (mais lento ATPase umad maior sensibilidade a Ca ^{2 +} da maquinaria contráctil), mas as forças de pico são ainda separadas. A 20 estimulação Hz, EDL contracções são parcialmente fundida, enquanto a do soleus forma uma força completamente fundida tetânica. Na frequência de estimulação que produz estimulação T _max, a qual pode variar em temperatura ambiente por 80-110 Hz e 60-90 Hz. EDL para sóleo, upstroke fácil e rápido o relaxamento da força tetânica em EDL são observadas, o que é contrário aos as características lentas do músculo solear. Figura 2b demonstra que a curva de força-frequência do músculo EDL é deslocada para a direita em relação ao músculo sóleo, indicando que sóleo são mais sensíveis ao Ca ^{+ 2} de libertação, em qualquer dada frequência de estimulação, devido à presença da miosina lenta e isoformas de troponina. Além disso, o mecanismo contráctil responde com mais força relativa no músculo sóleo em frequências mais baixas. Figura 3 mostramsa o perfil normal de fadiga do músculo EDL (painel superior) e solear (painel do meio). Note-se a redução mais rápida da força contráctil sob estimulação fatigante no músculo EDL e maior a diminuição em vigor no fim do protocolo de 5-min fadiga. Finalmente, um perfil típico alternano mecânica de um músculo mutante foi mostrado na Figura 3 (painel inferior), o qual foi definido como surtos de força momentâneos durante a fase de diminuição de perfil fadiga muscular. O surto força contráctil tem de ser 50% mais elevada do que a sua força anterior e os focos deve ser visto, pelo menos, 10 vezes durante o processo de estimulação de 5 min a fadiga.

Figura 1. Desenho esquemático de um sistema de 4 canais contractilidade ex vivo. De onda quadrada impulsos são gerados por um computador que controla um estimulador Grass. Duas unidades de isolamento de estímulo filtrar o estímulo proveniente da elecunidade estimulador trical para remover quaisquer flutuações no sinal eléctrico e para estabelecer um sinal de onda quadrada estável. Este sinal filtrado eléctrico é enviado para os quatro câmaras de banho contendo os eléctrodos de platina de arame em torno de cada músculo isolada. Em última análise, é a corrente entre os dois eléctrodos (chamada estimulação de campo) que geram um potencial de acção, induzir a contracção do músculo. Esta contracção é detectada por um transdutor de força específicos, transmitidos para os amplificadores de ponte, filtrado, em média (de condicionamento de sinal) e registada por um software de computador através de um conversor A / D.

Figura 2. . Representativos forças contrácteis do EDL e soleus (A) as forças contrácteis induzidas por 5 Hz (painel superior), 20 Hz (painel do meio) e força tetânica máxima (T _máx) (painel inferior); entrada mostra um traçado da força contráctil de um danos musculares, (B) umconjunto representativo mostrando as contrações individuais de uma força x relação de frequência em EDL (FF, painel superior) e da curva traçada resultante da FF (painel inferior). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. Representante fatigante perfil e alternância mecânica. Um perfil típico declínio rápido fadiga do músculo EDL (painel superior) e o lento declínio fatigante perfil do músculo sóleo (painel do meio). Fatigante estimulação leva ao aparecimento de alternância mecânica em um tric-a ^{- / -} músculo com perturbadas Ca ^{2 +} propriedades de manipulação (painel inferior).

Discussion

Medição da força contráctil e fatigabilidade é importante para a avaliação global da função do músculo esquelético. O principal objetivo deste ensaio é identificar alterações na força muscular e propriedades fatigantes sob certas condições patológicas, como sarcopenia e fadiga muscular, e para testar o efeito de drogas / reagentes sobre a contratilidade muscular. Desde que a força muscular está intimamente relacionada com o Ca ^{2 +} intracelular lançamento, extracelular Ca ^{2 +} e entrada do crosstalk entre esses dois, podemos também recolher informação sobre Ca ^{2 +} status de sinalização em músculo esquelético utilizando este método. Aqui nós mostramos um fenótipo único denominado "alternância mecânica de ruptura" quando os episódios de flutuação de força contrátil durante a fase de declínio do perfil de fadiga foram vistos sob um SR sobrecarregado e instável. Pode-se esperar que uma variedade de fenótipos musculares incluindo a força alteradas, FF, fatigabilidade, cinética contráteis e ab recuperaçãoility após fadiga pode ser detectada utilizando o ensaio in vitro a contractilidade, em diferentes condições patológicas.

A etapa mais importante para este ensaio consiste em isolar os músculos inteiros intactos (ou feixes musculares e tiras do músculo) que estão livres de danos. Essa meta é mais fácil de ser alcançado em preparações de músculo inteiro. Aqui demonstramos que deixando ligamentos e tendões suficientes para amarrar os músculos inteiros é muito importante para evitar a amarrar o próprio músculo, o que leva a lesão muscular e, eventualmente, a morte do músculo. Além disso, a constante de borbulhamento com soluções ou 100% de O ₂ no caso de soluções baseadas em HEPES ou uma mistura de O ₂ e CO ₂ para bicarbonato de soluções baseadas é crítica. Hipóxia prevenção e hiperoxia é importante enquanto um medidor de fluxo pode ser usado. Utilizou-se também em certa situação de um dispositivo específico que mede o oxigénio dissolvido no líquido que banha o tecido. Em certas condições em que os músculos são more propensos a danos, a manipulação do músculo isolado em uma solução de Ca ^{2 +-livre} antes da montagem sobre o transdutor de força ajudará a relaxar o músculo e minimizar o dano muscular antes da experiência. Drogas, tais como 2,3 - butanodiona monoxime (BDM), ou N-benzil-p-tolueno-sulfonamida (BTS) também podem ser adicionados durante a dissecção para minimizar os danos, particularmente se feixes musculares ou tiras musculares são preparados, o que é comum para o estudo de contratilidade do diafragma ^{37, 38.} Durante a gravação, preparações danificadas normalmente geram menos força e aumentaram o ruído de linha de base e as variações (ver entrada da Figura 2), e os resultados destes músculos podem ser excluídos do conjunto de dados de análise, a menos que seja parte do experimento para analisar as respostas de danificado músculos. Outro ponto que pode ser facilmente ignorada ou esquecida é que a estimulação eléctrica por si só pode ser uma fonte de toxicidade para os músculos. Recomendamos limpar periodicamente os eletrodos eo Chamber com uma solução de hipoclorito a 1% para remover quaisquer contaminantes, resíduos de proteínas, oxidação de acumulação etc precauções especiais também são necessários para ajustar o comprimento do músculo montado. É importante para esticar em pequenos passos, para evitar excesso de alongamento como o alinhamento ideal de filamentos finos e grossos é crítico para um funcionamento eficiente em termos de ponte transversal ^39. Além disso, recomenda-se que a posição relativa dos feixes musculares montados para os eléctrodos de estimulação de campo é mantida constante e alinhados entre todos os canais para assegurar que a mesma quantidade de corrente eléctrica é aplicada aos músculos isolados. Sob as nossas condições experimentais, os músculos de jovens ratinhos do tipo selvagem são estáveis ​​durante mais de 12 horas, e ainda mais se antibióticos, 0,2% de FBS, e os aminoácidos são adicionados à solução do banho.

Com cuidado e controle adequado, este sistema ex vivo poderia fornecer informações sobre a correlação entre Ca ^{2 +} sinalizando umad contração muscular sem a complexidade da vasculatura, do sistema endócrino e do sistema nervoso. Por exemplo, a perda de dependência de Ca ^{2 +} extracelular é uma assinatura do músculo esquelético envelhecido enquanto SR Ca ^{2 +} libertação disfunção geralmente produz a menor força contráctil e do perfil fatigante rápido. Como exemplificado aqui, o aparecimento de alternância mecânicas indica SR instável, que acreditamos não está limitado a tric-a ^{- / -} músculos, mas também em outros músculos esqueléticos em condições patológicas geradoras SR sobrecarga de Ca ^{2 +} e instabilidade. Esta configuração permite o acesso directo do músculo para várias manipulações fisiológicos e farmacológicos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5