Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Summary

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in een

Abstract

Hier beschreven is een methode om contractiliteit van geïsoleerde skeletspieren meten. Parameters zoals spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek, vermoeidheid, en herstel na vermoeidheid kan worden verkregen tot specifieke aspecten van de excitatie-contractie koppeling (ECC) proces, zoals prikkelbaarheid, contractiele machines en Ca ^{2 +} wendbaarheid te beoordelen. Deze methode verwijdert de zenuw en bloedtoevoer en richt zich op de geïsoleerde skeletspieren zelf. We routinematig gebruik van deze methode om genetische componenten die de contractiele eigendom van de skeletspieren te veranderen hoewel modulerende Ca ^{2 +} signaalwegen te identificeren. Hier beschrijven we een nieuw geïdentificeerde skeletspier fenotype, dat wil zeggen mechanische alternantie, als voorbeeld van de diverse en rijke informatie die kan worden verkregen met de in vitro assay spierflexibiliteit. Combinatie van deze assay met enkele cel assays, biochemische en genetische benaderingenstry assays kunnen belangrijke inzichten in de mechanismen van ECC in skeletspieren.

Introduction

Skeletspieren hechten aan botten van het skelet en contractiele krachten te genereren onder de controle van het centrale zenuwstelsel. Excitatie-contractie koppeling (ECC) verwijst naar het proces van het omzetten van een elektrische stimulus op een mechanische respons. Ca ^{2 +-signalering} is een essentieel onderdeel van de contractiele functie in skeletspieren. Effectieve Ca ^{2 +} mobilisatie van sarcoplasmatisch reticulum (SR) is een belangrijke component voor ECC in spiercellen ^{1, 2,} en veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 +} signalering de desbetreffende contractiele disfunctie grondslag liggen in een aantal spierziekten ^3-5. Goede beoordeling van de spier contractiliteit is essentieel en complementair aan Ca ^{2 +} imaging en andere tests om inzicht te krijgen in de skeletspier functie, niet alleen op de contractiele niveau, maar ook op de kinetische niveau. Kracht en snelheid kan ook worden verkregen op de belangrijke eigenschap van de hoogtespierkracht en de status van de ECC proces onder verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

Dit vruchtbare gebied van onderzoek heeft een zeer rijke geschiedenis en vele theorieën van spiercontractie verscheen meer dan twee millennia ^6. Moderne spier onderzoek begint waarschijnlijk in 1674-1682 met de microscopische observatie van cross-strepen en myofibrillen in spiervezels door Leeuwenhoek ^6. Bijna een eeuw later, Luigi Galvani opgemerkt dat kikker spier samentrekt krachtig wanneer de zenuw wordt aangeraakt met scalpel tijdens een vonkontlading uit een ver elektrische machine ^7-9. Krimp kan ook worden vervaardigd door het verbinden van de poot zenuw naar de spier door een metalen geleider. De details van de complexe elektrische signaal-mechanisme bepleit door Galvani werden uiteindelijk geformuleerd door Hodgkin, Huxley en Katz in hun beroemde formule ^{10, 11,} dat werd de basis van elektrofysiologie. De opmerkelijke observaties van Ringer vertegenwoordigen over de effecten van extracellulaire Ca ^{2 +} op de contractiliteit van de kikker hart-en skeletspieren ^{12 tot 15} van de eerste grote stap in de erkenning van Ca ^{2 +} als een belangrijke regulator van de spier contractiliteit ^{16, 17.} Van de jaren 1980 tot heden een uitbarsting van ontdekkingen in het spierflexibiliteit veld werd gerealiseerd door de invoering van spierflexibiliteit en vermoeidheid protocols in murine skeletspieren ^18. Jones en Edwards waren de eersten die dat lage frequentie intermitterende vermoeidheid (door inspanning veroorzaakte vermindering van kracht) suggereren ¹⁹ werd geassocieerd met veranderingen in de ECC machines en niet het contractiele apparaat. In de late jaren 1980 en begin 1990 werden Kolkeck et al. ^20, Kolbeck en Nosek ²¹ en Reid ²² met behulp middenrif van diermodellen om de effecten van theophyllines, cortiosterone en vrije radicalen te bestuderen op skeletspieren contractiliteit, terwijl Brooks en Faulkner waren de eerste om te rapporteren over de metingen van herhaalde kracht en macht metingen in snel-en langzaam-spieren van muizen ^22. Daarnaast Lannegren, Westerblad, Lam en Westerblad waren de eersten die ex vivo contractiliteit direct te koppelen met intracellulaire Ca ^{2 +} regeling en begon vraagtekens bij de rol van acidose bij spiervermoeidheid ^{23, 24.}

Onze laboratoria hebben aanzienlijk bijgedragen sinds de vroege 2000's naar begrip van nieuwe genen met modulerende en regulerende functies op spier ECC cruciale rol in spierflexibiliteit vermoeidheid en veroudering door een combinatie van intacte muizen spierflexibiliteit studies, intracellulaire Ca ^{2 +} monitoring intact en huid spiervezels en moleculair-genetische manipulaties ^{3-5, 25-29.}

Hier hebben we gedetailleerd het experimentele protocol voor het meten van de contractiliteit van muizen-geïsoleerde soleus en m. extensor digitorum longus (EDL) spieren, die overeenkomen met een overwegend langzaam oxidatieve (type I en IIa spiervezels) en meestal snel glyocolytic spier (type IIb en IIx spiervezels) met verschillende contractiele eigenschappen. In dit protocol werden intacte spier-pees complexen geïsoleerd en gebaad in een ADI PowerLab Radnotti kamersysteem voorzien hetzij zuivere zuurstof of een mengsel van zuurstof (95%) en CO ₂ (5%). Contractiele krachten werden gegenereerd door elektrische prikkeling van een Gras stimulator en gedetecteerd met behulp van een krachtopnemer die is geïntegreerd met een ADI PowerLab/400 systeem, waardoor aanpassing van macro routines aan de verwerving, inning, digitalisering en opslag van gegevens te controleren. Deze configuratie meten spierkracht, spierkracht, evenals de kracht-frequentierelatie, spiervermoeidheid, herstel van spiervermoeidheid, snelheid en algemene kinetische eigenschappen van spiercontractie. Bovendien kunnen de effecten van geneesmiddelen op spiercontractie worden gecontroleerd door deze experimenten. Voordelen van deze werkwijze liggen in het verwijderen van de neuronale en vasculaire componenten weg van de skeletspieren, waardoor directe beoordeling van de intrinsieke eigenschappen van verdragsluitende spier. Bovendien ex vivo assays kunnen contractiliteit manipulatie van het extracellulaire milieu rond de geïsoleerde spieren, die het gebruik van farmacologische manipulatie van diverse permeatie ion kanalen en transporters om hun fysiologische functies definiëren skeletspierfunctie maakt.

Deze ex vivo systeem heeft ons toegestaan ​​om onlangs ontdekt een duidelijke alternan gedrag in bepaalde mutant spier preparaten, die werden gekoppeld aan veranderde intracellulaire Ca ^{2 +} verwerkingseigenschappen ^4. Alternans worden gedefinieerd als fluctuerende uitbarsting afleveringen van contractiele kracht tijdens de daling fase van de vermoeiend profiel. Tijdens deze evenementen contractiele krachten tijdelijk te verhogen boven het vorige niveau van kracht dijdens vermoeiend stimulatie, misschien omdat ofwel meer Ca ^{2 +} wordt losgelaten of de contractiele machine gevoeliger geworden voor Ca ^{2 + 30.} Behandeling van cyclopiazonic zuur (CPA), een reversibele blokker van sarcoplasmatisch-endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA), cafeïne, een agonist van ryanodine kanaal (RyR) en herhaalde vermoeiend stimulaties kunnen allemaal leiden tot mechanische alternans ^4, wat suggereert dat alternans zijn direct gerelateerd aan modulatie van het EG koppelingsproces. Demonstratie van het te induceren en mechanische alternantie nemen in in vitro contractiliteit setup als voorbeeld de gevarieerde experimentele parameters die kunnen worden verkregen met dit systeem of soortgelijke, op basis van individuele onderzoeksinteresses tonen.

Deze methode kan van belang zijn voor onderzoekers bestuderen spierfysiologie. Gelijkaardige opstelling kan ook worden gebruikt voor geïsoleerde skelet muscle-tendon/ligament complexen van andereanatomische locaties, en voor enkelvoudige vezels en spierstrips.

Protocol

Oplossing samenstelling:

2,5 mM Ca ^{2 +} Tyrode oplossing: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM _CaCl2, 2 mM _MgCl2 en 10 mM glucose

0 mM Ca ^{2 +} Tyrode oplossing: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, 0,1 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA) en 10 mM glucose

Opmerking: badoplossing worden verzadigd met 100% O ₂ als met de bovenstaande oplossing, maar met 95% O ₂ met _5% CO2 bij gebruik bicarbonaat gebaseerde buffers pH constant te houden. 2,5 mM Ca ^{2 +} toegevoegd aan de baden buffer om het niveau ^van Ca2 ⁺ herhalen in de extracellulaire ruimte 10 mM glucose is belangrijk omdat mitochondria nog steeds functioneren in deze spieren continu ATP produceren in aanwezigheid van glucose.

1. Oprichting van de Ex Vivo contractiliteit experiment met behulp vande ADI PowerLab System

1. Een schematische tekening van een 4-kanaals ex vivo contractiliteit wordt getoond in figuur 1. Een computer stuurt een stimulator met vierkante golf pulsen die worden gefilterd door de isolatie-eenheid een paar platinadraad rond elke geïsoleerde spier-pees complex bereiken genereren. Dit wordt ook wel veldstimulatie. Contractie van de spier reactie op de stimulatie werd gemeten door een krachtopnemer, gegenereerde signaal waarvan werd geamplificeerd, gefiltreerd en weer aan de computer door een A / D converter (meetversterker). Het signaal wordt gedigitaliseerd en kan worden opgeslagen voor later analyse.
2. Voorbereiding op een ex vivo experiment contractiliteit eerste beurt op het veld stimulator, de A / D converter (in dit geval ADI vermogen Lab) of een soortgelijke software (bijv. LabView), gevolgd door de computer.
3. Open Chart4 software (of andere software versie die compatibel is met het systeem) en initiatea 4-kanaals taak; goede communicatie van de software en de hardware wordt aangegeven door het starten van de configuratie van de hardware en de START-knop op de software operationeel wordt (live), de 4-kanaals-functie maakt gelijktijdige meting van een paar van de spieren van de een wildtype en mutante muizen, of 2 EDL en 2 soleusspieren van dezelfde muis, en kan worden gebruikt voor andere spieren, zoals het membraan (gehele membraan, hemi-membraan of diafragma spierstrips) en de tibialis anterior; kan ook worden gebruikt voor hartspier preparaten en spierbundels, vooral als men rat spieren gebruikt. In dit geval de omvang van de spieren kan beperken zuurstofdiffusie dus spierbundels dus een betere keuze. Echter, expert dissectie technieken die nodig zijn voor spier bundel preparaten.
4. Kalibratie van de krachtopnemer: dit is de vergelijkbaarheid van dataset gegenereerd om verschillende kanalen en op verschillende tijdstippen. Eerste start de opname, Sequentially een 1-g, 2-g en 5 g-gewichten hangen het monster grove van de krachtopnemer, met opnemen, corresponderende veranderingen in mV getoond in elk kanaal van Chart4 software berekenen plotten ΔmV en het gewicht controleren en lineariteit bepalen de omrekening van het mV en gram kracht. Wij raden aan deze kalibraties ofwel aan het begin of aan het einde van elk experiment te verzekeren dat een kalibratie wordt verkregen voor elke specifieke experiment.
5. Controleer goede aansluiting van de Teflon buis afvoer vloeistof in de buis weefselbad, was de kamers driemaal of meer met ddH ₂ O en vul met 20 ~ 25 ml 2,5 mM Ca ^{2 +} Tyrode oplossing. Ca ^{2 +} en glucose worden voorzien in de badoplossing om membraanintegriteit, Ca ^{2 +} optimale belasting van de SR en een gemakkelijk beschikbare bron van energie voor het genereren van ATP door de spier te vrijwaren, aangezien mitochondria volledig blijft functioneren in deze preparaten.
6. Controleer de juiste aansluiting van de zuurstoftoevoer, opent u de zuurstoftank, en stel zuurstoftoevoer naar diffusieve en homogene borrelen van de kamer te geven. Zuurstofgehalte kan gemakkelijk worden bepaald als functie van samentrekkingskracht versus tijd. Een flow meter kan ook worden geïnstalleerd, vooral als onderzoekers zijn geïnteresseerd in het bestuderen van de effecten van hypoxie of hyperoxie. Als spieren worden hypoxische, kracht afneemt natuurlijk. Terwijl hyperoxia kan ook schade spieren, maar daarvan kan moeilijker te detecteren omdat de meeste experimenten uitgevoerd onder kunstmatige omstandigheden hyperoxische te compenseren voor het ontbreken van een normale bloedtoevoer naar de spieren. In de meeste systemen is het mogelijk om de verschillende kamers bubble met dezelfde hoeveelheid zuurstof eenvoudig door het regelen van de toevoer van zuurstof naar elke kamer constant.
7. Pas de gevoeligheid van alle kanalen naar de maximale kracht resolutie te garanderen zonder het verzadigen van de kanaal. Kanaal gevoeligheid kan aanzienlijk variëren als functie van eend leeftijd van het dier, experimentele temperatuur, genetische manipulaties, spiermassa, muisstam, en het vermogen van experimentator goed ontleden spieren zonder schade. In onze ervaring bij het meten soleus samentrekkingskracht, de gevoeligheid varieert 0,5 tot 10 mV / cm, terwijl in het geval van EDL, de gevoeligheid kan variëren 1 tot 20 mV / cm.
8. Een protocol voor het vermoeiend stimulatie moet worden vastgesteld. In de software Chart4 een macro worden gebruikt. Om een ​​nieuwe macro te programmeren: in de Chart4 software op de meting starten, klikt u op Macro, Macro Command, start de opname, begin te herhalen, kiest u de gewenste stimulus frequentie, en dan het einde herhalen. Voor een equilibratie protocol wordt herhaald stimulus elke minuut gedurende 30 minuten en vermoeiend protocol, stimulus wordt elke 2 sec gedurende 5 minuten. Deze veranderingen in de frequentie van de stimulatie direct invloed op de duty cycle, die ook een functie van de stimulatie duur. Deze parameters kunnen worden gevarieerd om verschillende aspe testencts van de contractiliteit en vermoeidheid.

2. Het voorbereiden van Intact spierbundels

1. EDL dissectie: muis wordt opgeofferd volgens NIH richtlijnen en IACUC institutionele dier protocollen. Muis is opgeofferd door cervicale dislocatie. Muis wordt vervolgens aangebracht op de laterale positie. EDL spier is een snel glycolytische spier met lichtroze-witte kleur. Het is ongeveer 10-13 mm lang en weegt 8 tot 11 mg in wild-type C57BL / 6 muis. De EDL heeft de functies van de uitbreiding van de tenen 2-5, en dorso-buigen van de voet bij de enkel. Het wordt geïnnerveerd door de peroneus. Om de EDL ontleden, maak een oppervlakkige incisie in de huid en snijd open de fascia tussen de anterior tibialis en de achterste spiergroep, en lokaliseren van de oorsprong (proximale) waar ligament wordt aan de laterale condylus van de tibia en de superieure 3/4 is aangesloten van de voorste oppervlak van fibula (interosseus marge). Snijd de ligament met fijne schaar oftalmische zo distaal mogelijk van de spier, dit procedure geeft de proximale oorsprong van de EDL spier. Houd het ligament met een stompe pincet en trek langzaam vrij te maken van de EDL. Het kan nodig zijn om een ​​aantal van de perimysium rond de EDL en andere spieren rond de EDL, een stap die is van cruciaal belang, omdat schade kan aan de EDL spier optreden tijdens deze delicate stap te snijden. Vervolgens naar de invoeging regio waar de vier distale pezen in te voegen in het midden en distale kootjes van de cijfers 2-5. Snijd de pezen zo ver mogelijk van de spieren.
2. Breng de geïsoleerde EDL spier in een dissectie schotel met isotone Tyrode oplossing. Sommige mutant, transgene en knockout diermodellen hebben zeer broos spieren en het gebruik ^van Ca2 ^+-vrije Tyrode oplossing moet ^{Ca2 +} geïnduceerde spierbeschadiging voor contractiliteit metingen te voorkomen. Vervolgens gebruikt een chirurgische knoop te strak binden aan beide uiteinden van de EDL spier als distaal van de spier mogelijk. Een goede maatregel is te binden iets boven het midden van de point lengte van het ligament of de pees. Gebruik 6-0 formaat hechtdraad voor deze procedure, en breng de EDL spier aan de O _2-verzadigde weefsel bad kamer, monteer de spieren op het monster groef van de krachtopnemer en het briefpapier haak op de bodem van het bad kamer, herhaalt u de Werkwijze voor het andere been. We zijn ook begonnen aan een nieuwe methode die de spieren houdt met klemmen in plaats van hechtingen te kunnen benutten. Als het belangrijkste doel is om kinetische eigenschappen en / studeren of spierkracht te verkrijgen, wordt aanbevolen hechtdraad zo kort mogelijk of de hechting worden vervangen door een metalen staaf.
3. Soleus dissectie: de soleus is een meestal langzaam-oxidatieve spier met rijke rode kleur. Het is ~ 1 mm korter dan de EDL maar weegt iets meer dan de EDL. Het wordt geïnnerveerd door de nervus tibialis, dan voert hij de actie van plantaire buigen de voet. Om de soleus ontleden, toegang tot de achterste laterale zijde van het been, verdringen de gastrocnemius spier die normaal gesproken dekt de soleus, en identificeren van de spier met donkerrode kleur. In de oorsprong (proximale), knip de ligamenten verbinding met de proximale helft van posterior tibia langs de lijn en soleal proximale 1/3 van de fibula posterior, vervolgens de insertie (distale), knip de calcaneus pees die inserts in de achterste calcaneus. Voorzichtig vrij te maken van de soleus en goed de m. soleus in het bad kamer als voor de EDL te monteren.

3. Het meten van de contractiliteit van het geïsoleerde skeletspieren

1. Zodra de spieren zijn gemonteerd in afzonderlijke weefsel bad kamers, start de opname. De meeste vergelijkbare systemen kunnen op nul zetten van de basislijn van kracht opname. Deze functie wordt meestal geassocieerd met de versterker, in het specifieke geval van de PowerLab systeem als functie van de brugversterker. Het vergemakkelijkt observatie van de basislijn wijzigingen en biedt een handige manier voor alle spiersamentrekkingen te analyseren van nul. Geïsoleerde spieren worden vervolgens gestimuleerd met het kwadraat-golf pulsendie sterk kan variëren als functie van de kamer grootte, platina draden dikte, afstand tussen de draden, en zelfs de samenstelling van de experimentele oplossing. Wij hebben gebruik gemaakt stroom van 60 mA (we hebben opgemerkt dat de stromen boven 350 mA lijken te zijn schadelijk voor spier preparaten) en stimulerende treinen van 350, 500, en 1000 ms, afhankelijk van de doelstellingen van een specifiek protocol. De individuele blokgolf pulsen moeten duur zijn, variërend 0,3 tot 1 ms.
2. De volgende stap is het selecteren van een frequentie van stimulatie in staat een gesmolten tetanische stimulatie (ex: ~ 100 Hz tot productie van maximale kracht toe in EDL spier en ~ 60 Hz in soleus) terwijl langzaam en voorzichtig rekken van de spieren om de identificatie optimale lengte van deze spieren. Als spieren worden zorgvuldig uitgerekt, wacht 30 s en stimuleren bij 100 Hz, wacht 30 s en strek opnieuw, en herhaal de stimulatie, tot het punt waar de kracht niet meer te verhogen.
3. Deze spieren hebben undergone significante veranderingen in de omgeving. Het wordt aanbevolen dat de spieren worden toegestaan ​​aan de nieuwe omgeving, een stap in onze protocollen genoemd "evenwicht". Equilibreren deze spieren met dezelfde frequentie van de stimulatie tijdens het strekken fase 100 Hz voor 20-30 min, tot ten minste 5 opeenvolgende tetanische contracties volledig stabiel zijn (niet verminderen, niet toeneemt, stabiele basislijn). Frequentie van de stimulerende treinen (100 Hz, 500 ms duur, 1 ms individuele puls) in evenwicht is 1 min, wat overeenkomt met een duty cycle van 1,66%, een niet vermoeiende stimulatie. In dit verband een duty cycle van 1,66% betekent dat meer dan in totaal 100%, spieren 1,66% van de tijd werken, doordat de duty cycle spieren kan eventueel worden geïnduceerd vermoeidheid. Indien anders spieren van gezonde, wildtype muis n vermoeiende profiel tijdens deze periode evenwicht, is het mogelijk dat zij beschadigd tijdens dissectie, is hypoxie zich in de kamers / spieren of overmatige electrolysis door de stimulerende elektroden genereert vrije radicalen. Westerblad eerder gesuggereerd dat stromen groter dan 400 mA de vorming van vrije radicalen ²³ induceren. Uiteraard is de hoogste kwaliteit platina gesuggereerd, aangezien andere metalen zal zeker leiden tot vorming van vrije radicalen en spier toxiciteit.
4. Verkrijgen is de kracht-frequentierelatie (FF) door het stimuleren van de spieren met de volgende stimulatiefrequenties: 1-140 Hz (in stappen van 5-10 Hz) met een frequentie van 30-60 s bij het uitvoeren van experimenten bij 25 ° C. Bij het uitvoeren van experimenten bij 37 ° C, verlengen FF hogere frequenties tot 300 Hz voor middenrif, 180-200 Hz voor soleus, en 220-250 Hz voor EDL. Vervolgens bepalen de frequentie van maximale stimulatie die tetanische kracht (T _max) en ongeveer ½ maximale tetanische kracht (1/2 T _max) genereert, soms is het moeilijk om de exacte ½ T _max verkrijgen voor zowel EDL en tongons spieren als slechts een stimulator bron wordt gebruikt vanwege de intrinsieke verschillen tussen deze spieren. Een werkbare oplossing is het identificeren van een frequentie die 30-70% van de T _max produceert. De reden voor deze frequenties van stimulatie is dat T _max belangrijke informatie van contractiele machines evenementen / modulatie voorziet, terwijl de ½ T _max geeft informatie zinvoller zijn de Ca ^{2 +} regeling en de ECC-proces. Om zeker te zijn dat maximale kracht is bereikt, kan 10-20 mm cafeïne toegevoegd aan de badoplossing en stimuleert de spier. Als maximale kracht is bereikt, zal werking niet toenemen in de aanwezigheid van cafeïne. De FF wordt verschoven naar rechts en krachten de neiging iets hoger bij hogere temperaturen experimenteel. Met dit systeem kan elke andere stimulatie frequenties worden uitgevoerd indien gewenst. De verschillende contractiele profiel van een fast-glycolytische EDL spier en een slow-oxidatieve soleus spier isgetoond in figuur 2.
5. Na equilibratie vermoeidheid de spieren bij ½ T _max gedurende 5 min, met stimulatie interval van 2 seconden en 25% duty cycle (figuur 3). Deze specifieke vermoeiende protocol wordt verondersteld om beter weer te geven van de bijdrage van het sarcoplasmatisch reticulum Ca ^{2 +} release voor spier contractiliteit ^31.
6. Herstel de spier ½ T _max gedurende 30 minuten of totdat de kracht stabiel op 1 min interval. Een extra protocol vermoeiend nu worden uitgevoerd met T _max stimulatie, waarvan wordt aangenomen dat de status van de contractiele machine ³¹ weerspiegelen. Een andere optie is om de vermoeiende protocol breiden tot stimulerende treinen intercaleren dat T _max en T _max ½ genereren tijdens vermoeidheid en de spieren herstellen met hetzelfde type stimulatie.
7. Herhaal de FF, zoals beschreven in stap 3.4, de reden is dat fenotypische verschillen tussen different stammen ziektemodellen of medicijnbehandelingen kan worden vastgesteld door analyse van de FF voor en na vermoeiing. We hebben bijvoorbeeld eerder beschreven dat na vermoeiing de FF jonge wildtype spieren naar links, terwijl in spieren leeftijd spieren, wordt verschoven naar rechts wijst differentiële modulerende effecten van skeletspier vermoeidheid als functie van veroudering.
8. Om de bijdrage van het ^{extracellulair} Ca2 ⁺ opname in spierflexibiliteit sonde, kan badoplossing worden veranderd in een oplossing die geen Ca ^{2 +} maar 0,1 mM EGTA (0 mM Ca ^{2 +} Tyrode oplossing) ^32. Alternatief kunnen verschillende blokkeerders van store bediende kanaal toegepast in de badoplossing. Enkele voorbeelden zijn: 2-aminoethyl diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-bis (trifluormethyl) pyrazool 2 (BTP-2) en azumolene, etc. ^{33, 34.} Cafeïne kan worden gebruikt om de functie van de ryanodine receptor probe en KCl kan worden gebruikt om de totale beoordelendepolarisatie van deze preparaten. Andere geneesmiddelen kunnen ook worden gebruikt om de belangrijke modulatie van werking te onderzoeken tijdens vermoeidheid van de Na ^+, K ^+, Na ⁺ en K ^{+-pompen 35.} De meeste van deze geneesmiddelen hebben relatief kleine afmetingen en lijkt snel diffunderen deze spier preparaten zoals blijkt uit hun directe effecten. Het ontbreken van een effect door een bepaalde drugs betekent niet noodzakelijk dat het geneesmiddel effectief is en aanvullende tests waarbij dosis veel hoger dan die gebruikt in enkele spiervezel experimenten soms noodzakelijk.
9. Een unieke toepassing van deze ex vivo systeem heeft geleid tot de recente ontdekking van monteur alternantie in tric-a ^{- / -} spieren ^{4, 30.} Alternans worden gedefinieerd als fluctuerende uitbarsting afleveringen van contractiele kracht tijdens de daling fase van de vermoeiend profiel. Tijdens deze evenementen contractiele kracht kan tijdelijk stijgen boven het vorige niveau van geweld tijdensvermoeiend stimulatie, omdat die ofwel meer Ca ^{2 +} wordt losgelaten of de contractiele machine gevoeliger geworden voor Ca ^{2 +.} De contractiekracht uitbraak moet 50% hoger dan de voorgaande kracht en de uitbraken worden gezien tenminste 10 maal gedurende de 5 min vermoeidheid stimulatie proces. Monteur alternans zijn niet gebruikelijk in skeletspieren van de wildtype muizen, maar kunnen ook in bepaalde mutant spieren verstoring van de intracellulaire Ca ^{2 +} signaleringsproces zoals trimere Intracellulaire kationenkanaal type A (tric-a) ^{- / -} spier ^4. Mechanic alternans kan worden geïnduceerd door middel van vermoeiend stimulaties, behandeling met cafeïne en cyclopiazonic zuur (CPA), zie figuur 3 voor een representatieve opname van deze mechanische alternans. De aard van dit fenomeen is heel intrigerend, terwijl een spier die is vermoeiend lijkt in staat om tijdelijk meer kracht. In onze vorige publicatie, Gecombineerd met enkele cel Ca ^{2 +} analyse blijkt dat het uiterlijk van alternantie is een gevolg van SR Ca ^{2 +} overbelasting en instabiele SR. Wij geloven dat een beter begrip van alternantie kan leiden tot een beter begrip van de ECC proces.
10. Aan het eind van het experiment gemeten lengte en gewicht van de individuele spieren met geijkte caliper en de analytische balans, knipperen de spier bevroren in vloeibare stikstof en opslaan bij -80 ° C, aangezien biochemische analyses worden uitgevoerd in deze spieren. Deze spieren kunnen ook mechanisch huid voor gedetailleerde sonderen van de ECC proces of chemisch worden gevild bepaling van essentiële contractiele eigenschappen bij gebreke van ECC regulatiemechanismen.
11. Opgenomen spierkracht (mV) wordt eerst omgezet in gram dwingen op basis van kalibratieresultaten en genormaliseerd naar de fysiologische doorsnede (PCSA) volgens de volgende formule: spierkracht (N / cm ²⁾ = (kracht (g) x spier length (cm) x 1,06) / (spier gewicht (g) x 0,00981) ^5,36. Als alternatief kan spierkracht worden genormaliseerd om de totale eiwit of totale actine inhoud van de individuele spieren met behulp van Bradford eiwit assay / Commossie blauwkleuring kwantificering. Onder bepaalde voorwaarden dat spiermassa kunnen ernstig aangetast door ziekten, veroudering, behandelingen met geneesmiddelen, normalisatie werking gebaseerd op spiermassa, eiwit en / of actine inhoud kan een stabiele aanwijzing geven.

4. Representatieve resultaten

Typische kamertemperatuur samentrekkende krachten van EDL en soleus reageren op lage, gemiddelde en hoge frequentie stimuli worden getoond in Figuur 2. De EDL krimp veroorzaakt door 5 Hz stimulus blijft als individuele samentrekkingen als gevolg van de snelle actie van de SERCA Ca ^{2 +} ATPase en de intrinsieke Ca ^{2 +} gevoeligheid eigenschappen van contractiele machines, terwijl de soleus krimp met 5 Hz begint te smelten (langzamer ATPase eend hogere gevoeligheid voor Ca ^{2 +} van het contractiele machine), maar de piek krachten nog gescheiden. Bij 20 Hz stimulatie worden EDL contracties gedeeltelijk gesmolten terwijl die van de soleus vormt een geheel gefuseerd tetanische kracht. De frequentie van stimulatie die T _max stimulatie, die bij kamertemperatuur variëren van 80 tot 110 Hz EDL en 60-90 Hz voor soleus, snel opgaande en snelle ontspanning van de tetanische kracht EDL worden opgemerkt, dat anders dan produceert de langzame kenmerken van de soleus. Figuur 2B toont aan dat de kracht-frequentie van de curve EDL spier naar rechts ten opzichte van de soleus, wat aangeeft dat soleusspieren gevoeliger zijn voor Ca ^{2 +} ontgrendeling gegeven frequentie van stimulatie door de aanwezigheid van de trage myosine en troponine isovormen. Bovendien reageert de contractiele machine relatief meer kracht in soleus bij lagere frequenties. Figuur 3 toonsa normale vermoeidheid profiel van de EDL (bovenste paneel) en soleus spier (middelste paneel). Let op de snellere afname van de samentrekkingskracht onder vermoeiend stimulatie in de EDL spier en de grotere daling die op het eind van de 5-min vermoeidheid protocol. Tenslotte werd een typische mechanische alternan profiel van een mutant spier getoond in figuur 3 (onderste paneel), dat als tijdelijke werking uitbraken gedefinieerd tijdens de dalende fase van spiervermoeidheid profiel. De contractiekracht uitbraak moet 50% hoger dan de voorgaande kracht en de uitbraken worden gezien tenminste 10 maal gedurende de 5 min vermoeidheid stimulatie proces.

Figuur 1. Schematische tekening van een 4-kanaals ex vivo systeem contractiliteit. Blokvormige pulsen worden gegenereerd door een computer die een Grass stimulator. Twee stimulatie isolatie-eenheden filteren de stimulus afkomstig van de elektrische stimulator unit om fluctuaties in het elektrische signaal te verwijderen en een stabiele blokgolfsignaal stellen. Dit gefilterde elektrische signaal wordt naar de vier baden kamertjes met de platinadraad elektroden rondom elke geïsoleerde spier. Uiteindelijk is de stroom over de twee elektroden (veldstimulatie genoemd) dat een actiepotentiaal genereren induceren van de contractie van de spier. Deze contractie wordt gedetecteerd door een specifiek krachtopnemers, die aan de brug versterkers, gefiltreerd, gemiddeld (signaalconditionering) en geregistreerd door computer software via een A / D converter.

Figuur 2. . Representatieve contractiele kracht van EDL en soleus (A) contractiele krachten geïnduceerd door 5 Hz (bovenste paneel), 20 Hz (middelste paneel) en de maximale tetanische kracht (T _max) (onderste paneel), inlaat toont een spoor van een samentrekkingskracht beschadigde spieren, (B) eenvertegenwoordiger te stellen die de individuele samentrekkingen van een kracht versus frequentie relatie in EDL (FF, bovenste paneel) en de geplotte curve als gevolg van de FF (onderste paneel). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Vertegenwoordiger vermoeiend profiel en mechanische alternans. Een typische snelle daling vermoeiend profiel van de EDL spier (bovenste paneel) en de langzame daling vermoeiend profiel van de soleus spier (middelste paneel). Vermoeiend stimulatie leidt tot het verschijnen van mechanische alternantie in een tric-a ^{- / -} spier met gestoorde Ca ^{2 +} verwerkingseigenschappen (onderste paneel).

Discussion

Meting van contractiele kracht en vermoeidheid is belangrijk voor de algehele evaluatie van de skeletspieren functie. Het belangrijkste doel van deze test is om veranderingen in spierkracht en vermoeiend eigenschappen onder bepaalde pathologische omstandigheden, zoals sarcopenie en spiervermoeidheid identificeren en het effect van drugs / reagentia op spierflexibiliteit testen. Aangezien de spierkracht is nauw verbonden met intracellulaire ^{Ca2 +} afgifte, ^{extracellulair} Ca2 ⁺ ingang en de overspraak tussen deze beide, kunnen we ook informatie verzamelen over Ca ^{2 +} signalering status in skeletspier met deze methode. Hier toonden we een uniek fenotype genoemd "monteur alternans" wanneer fluctuerende uitbarsting afleveringen van contractiele kracht tijdens de daling fase van de vermoeiende profiel werden gezien onder een overbelast en instabiel SR. Men zou kunnen verwachten dat een verscheidenheid van skeletspieren fenotypes waaronder veranderde kracht, FF, vermoeidheid, contractiele kinetiek en herstel abiliteit na vermoeiing kan worden gedetecteerd met de in vitro assay contractiliteit onder verschillende pathologische omstandigheden.

De meest kritische stap voor deze assay is het isoleren van intacte spieren (of spierbundels en spierstrips) die vrij zijn van beschadiging. Dat doel is gemakkelijker te realiseren volledige spieren preparaten. Hier laten we zien dat met genoeg gewrichtsbanden en pezen aan het geheel spieren binden is belangrijk om te voorkomen de binding van de spier zelf, wat leidt tot spierschade en uiteindelijk dood spieren. Bovendien constant borrelen van oplossingen met ofwel _100% O2 bij HEPES gebaseerde oplossingen of een mengsel _van O2 en _CO2 gedurende bicarbonaat gebaseerde oplossingen kritisch. Voorkomen hypoxie en hyperoxia belangrijk is met een debietmeter worden gebruikt. We ook in bepaalde situaties een specifieke inrichting die opgeloste zuurstof in het weefsel vloeistoffen baden meet. Onder bepaalde voorwaarden waar de spieren zijn more gevoelig voor schade, zal de behandeling van de geïsoleerde spier in ^een Ca2 ^+-vrije oplossing voor montage op de krachtopnemer helpen de spier ontspannen en spierschade voor het experiment te minimaliseren. Geneesmiddelen zoals 2,3 - butaandion monoxime (BDM) of N-benzyl-p-tolueen sulfonamide (BTS) kan ook worden toegevoegd tijdens dissectie om schade te minimaliseren, vooral als spierbundels of spierstrips bereid, hetgeen normaal is voor contractiliteit studie van het membraan ^{37, 38.} Tijdens de opname zal beschadigde voorbereidingen normaal genereren minder kracht en zijn toegenomen basislijn lawaai en fluctuaties (zie inlaat van figuur 2), en de resultaten van deze spieren kunnen worden uitgesloten van de analyse dataset, tenzij het ​​deel van het experiment om reacties van beschadigde analyseren spieren. Een ander punt dat eenvoudig kan worden genegeerd of vergeten dat de elektrische stimulatie zelf kan een bron van toxiciteit voor de spieren. Wij adviseren regelmatig reinigen van de elektroden en de chamber met een 1% hypochloriet oplossing mogelijke verontreinigingen, vuil eiwitten, oxidatie accumulatie enz. Speciale voorzorgsmaatregelen verwijderen zijn ook nodig wanneer de lengte van de spier geplaatst. Het is belangrijk te strekken in kleine stappen over-strekken als de optimale afstemming van dunne en dikke filamenten voorkomen is essentieel voor een efficiënte cross-bridge werking ^39. Bovendien wordt aanbevolen dat de relatieve positie van de gemonteerde spierbundels de veldstimulatie elektroden constant gehouden en uitgelijnd onder alle kanalen die evenveel stroom te waarborgen wordt op de geïsoleerde spieren. Onder onze experimentele omstandigheden spieren van jonge wild type muizen stabiel blijven gedurende 12 uur en zelfs langer als antibiotica, 0,2% FBS, en aminozuren worden toegevoegd aan de badoplossing.

Met zorg en een adequate controle, kan dit ex vivo systeem informatie over de correlatie tussen Ca ^{2 +} het signaleren van eend spiercontractie zonder de complexiteit van het vaatstelsel, endocriene en het zenuwstelsel. Bijvoorbeeld, het verlies van de afhankelijkheid van extracellulaire Ca ^{2 +} is een handtekening van oude skeletspieren, terwijl SR Ca ^{2 +} versie dysfunctie meestal levert lagere contractiekracht en snel vermoeiend profiel. Zoals hier exampled, optreden van mechanische alternantie geeft onstabiel SR, waarvan wij geloven niet beperkt tot tric-a ^{- / -} spieren, maar ook in andere skeletspieren in pathologische omstandigheden genereren SR Ca ^{2 +} overbelasting en instabiliteit. Deze opstelling biedt directe toegang van de spier voor diverse fysiologische en farmacologische manipulaties.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5