Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zur direkten Messung der Muskelkraft, Muskelkraft, kontraktile Kinetik und Ermüdbarkeit der isolierten Skelettmuskulatur in einem

Abstract

Hier beschrieben ist ein Verfahren, um die Kontraktilität von isolierten Skelettmuskeln messen. Parameter wie Muskelkraft, Muskelkraft, kontraktile Kinetik, Ermüdbarkeit und Erholung nach Ermüdung erhalten, um spezifische Aspekte der Erregung und Kontraktion Kupplung (ECC) Verfahren wie Erregbarkeit, kontraktilen Maschinen und Ca ^{2 +} Handhabbarkeit zu beurteilen. Diese Methode entfernt die Nerven und Blutversorgung und konzentriert sich auf die isolierten Skelettmuskel sich. Wir routinemäßig verwenden diese Methode, um genetische Komponenten, die die kontraktilen Eigentum der Skelettmuskulatur zu verändern, obwohl modulierenden Ca ^{2 +} Signalwege zu identifizieren. Hier beschreiben wir ein neu identifiziertes Skelettmuskel Phänotyp, dh mechanische Alternans, als Beispiel für die verschiedenen und vielfältigen Informationen, die unter Verwendung der in vitro-Assay kann Muskelkontraktilität werden. Kombination dieses Assays mit einzelnen Zell-Assays, genetische Ansätze und biochemistry Assays können wichtige Einblicke in die Mechanismen der ECC in der Skelettmuskulatur bieten.

Introduction

Skelettmuskeln Knochen des Skeletts befestigt und erzeugen kontraktilen Kräfte unter der Kontrolle des zentralen Nervensystems. Elektromechanische Kopplung (ECC) bezieht sich auf den Prozess der Umwandlung eines elektrischen Stimulus an eine mechanische Reaktion. Ca ^{2 +-Signal} ist eine wesentliche Komponente des kontraktilen Funktion in der Skelettmuskulatur. Effektive Ca ^{2 +} Mobilisierung von sarkoplasmatischen Retikulum (SR) ist ein wichtiger Bestandteil für die ECC in den Muskelzellen ^{1, 2,} und Veränderungen in der intrazellulären Ca ^{2 +-Signalisierung} unterliegen den entsprechenden kontraktile Dysfunktion in einer Reihe von Muskelerkrankungen ^3-5. Sachgemäßen Beurteilung Muskelkontraktilität ist wichtig und komplementär zu Ca ^{2 +-Imaging} und andere Assays, um Einblicke in Skelettmuskeln Funktion zu erhalten, nicht nur bei der kontraktilen Ebene, sondern auch auf dem kinetischen Niveau. Kraft und Geschwindigkeit kann auch erhalten, um die wichtige Eigenschaft informierenMuskelkraft und der Status der ECC-Prozess unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen.

Diese fruchtbare Gebiet der Forschung hat eine sehr reiche Geschichte und viele Theorien der Muskelkontraktion erschien über zwei Jahrtausende ^6. Modernes Muscle Research beginnt wahrscheinlich in 1674-1682 mit der mikroskopischen Beobachtung der Querstreifung und Myofibrillen in Muskelfasern durch Leeuwenhoek ^6. Fast ein Jahrhundert später, bemerkte Luigi Galvani that frog Muskel kontrahiert kräftig, wenn ihre Nerven mit Skalpell während einer Funkenentladung von einem entfernten elektrischen Maschine ^7-9 berührt. Kontraktion könnte auch durch die Verbindung des Beines Nerv zum Muskel durch einen metallischen Leiter hergestellt werden. Die Einzelheiten des komplexen elektrischen Signalisierung Mechanismus, durch Galvani befürwortet wurden schließlich von Hodgkin, Huxley und Katz in ihrem berühmten Gleichung ^{10, 11,} die das Fundament der Elektrophysiologie wurde formuliert. Die bemerkenswerte Beobachtungen von Ringer über die Auswirkungen von extrazellulärem Ca ^{2 +} auf die Kontraktilität der Frosch Herz-und Skelettmuskulatur ^12-15 stellen den ersten großen Schritt in der Anerkennung der Ca ^{2 +} als zentraler Regulator der Muskelkontraktilität ^{16, 17.} Von den 1980er Jahren bis in die Gegenwart ein Platzen der Entdeckungen in der Muskelkontraktilität Feld wurde durch die Einführung der Muskelkontraktilität und Ermüdbarkeit Protokolle in murine Skelettmuskulatur ¹⁸ realisiert. Jones und Edwards waren die ersten, dass niederfrequente intermittierende Müdigkeit (exercise-induzierte Reduktion in Kraft) schlagen ¹⁹ mit Veränderungen in der ECC Maschinen und nicht die kontraktilen Apparates verbunden war. In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren wurden Kolkeck et al ^20, Kolbeck und Nosek ²¹ und Reid ²² mit Zwerchfell von Tiermodellen, die Auswirkungen der Theophyllinen, cortiosterone und freie Radikale auf die Skelettmuskulatur Kontraktilität studieren, während Brooks und Faulkner waren die ersten, die auf Messungen der wiederholten Kraft und Leistungsmessungen in schnell und langsam Muskeln von Mäusen ²² hinweisen. Darüber hinaus waren Lannegren, Westerblad, Lamb und Westerblad die erste direkte Verbindung ex vivo Kontraktilität mit intrazellulären Ca ^{2 +-Regulation} und begann Infragestellung der Rolle der Azidose bei Muskelermüdung ^{23, 24.}

Unsere Labors haben sich seit Beginn des Jahres 2000 zum Verständnis neuartiger Gene mit modulatorische und regulatorischen Aufgaben auf Muskel-ECC mit kritischen Rollen in Muskelkontraktilität, Ermüdbarkeit und Alterung durch eine Kombination von intakten Maus Muskelkontraktilität Studien beigetragen, intrazelluläre Ca ^{2 +-Überwachung} in intakt und gehäutet Muskelfasern und molekular-genetische Manipulationen ^{3-5, 25-29.}

Hier haben wir die experimentelle Protokoll für die Messung Kontraktilität murine isolierten soleus und extensor digitorum longus (ED detailliertL) Muskeln, die zu entsprechen einer meist langsam oxidative (Typ I und IIa Muskelfasern) und ein meist schnell glyocolytic Muskeln (Typ IIb und IIx Muskelfasern) mit unterschiedlichen kontraktilen Eigenschaften. In diesem Protokoll wurden intakte Muskel-Sehnen-Komplexe isoliert und badete in einem ADI PowerLab Radnotti Kammer-System mit reinem Sauerstoff oder einem Gemisch aus Sauerstoff (95%) und CO ₂ (5%) geliefert. Kontraktilen Kräften wurden von elektrischen Stimulationen von einem Grass-Stimulator erzeugt und detektiert mit einem Kraftaufnehmer, der mit einem ADI PowerLab/400 integriert wurde, so dass die Anpassung von Makro-Routinen für die Erfassung, Sammlung, Digitalisierung und Speicherung von Daten zu steuern. Dieser Aufbau kann zu messen Muskelkraft, Muskelkraft, sowie die Kraft-Frequenz-Beziehung, Muskelermüdung, Erholung von Muskelermüdung, Geschwindigkeit und insgesamt kinetischen Eigenschaften der Muskelkontraktion. Darüber hinaus können die Auswirkungen von Medikamenten auf Muskelkontraktion durch diesen Versuchen beobachtet werden. Die Vorteile dieser Methode liegen bei der Beseitigung der neuronalen und vaskulären Komponenten vom Skelettmuskel, die eine direkte Beurteilung der inhärenten Eigenschaften der kontrahierenden Muskel. Darüber hinaus ermöglichen ex vivo Assays Kontraktilität Manipulation der extrazelluläre Milieu umgebenden isolierten Muskeln, die die Verwendung von pharmakologischen Manipulationen verschiedener Ionenpermeation Kanäle und Transporter um ihre physiologischen Rollen für Skelettmuskel Funktion definieren kann.

Diese ex vivo-System hat uns erlaubt, vor kurzem entdecken eine deutliche Alternan Verhalten in bestimmten mutante Muskel-Präparaten, die zu veränderten intrazellulären Ca ² verbunden waren ⁺ Handling-Eigenschaften ^4. Alternans als schwankende Burst Episoden kontraktile Kraft während der Rückgang Phase der Ermüdung definiert. Während dieser Veranstaltungen kontraktilen Kräfte kurz über seinen früheren Kraftniveau d zu erhöhenährend ermüdend Stimulation, vielleicht, weil entweder mehr Ca ^{2 +} freigesetzt wird oder die kontraktilen Maschinerie geworden empfindlich auf Ca ^{2 + 30.} Behandlung von Cyclopiazonsäure (CPA), einem reversiblen Blocker des sarkoplasmatischen-endoplasmatischen Retikulum Calcium ATPase (SERCA), Koffein, ein Agonist des Ryanodin Kanal (RyR) und wiederholte ermüdend Stimulationen können alle mechanischen induzieren Alternans ^4, was darauf hindeutet, dass die Alternans direkt an Verwandte Modulation des EG Kopplung Prozess. Demonstration der Methode zu induzieren und aufzeichnen Mechaniker alternans in in vitro Kontraktilität Setup dient als Beispiel für die vielfältigen experimentellen Parameter, die mit diesem System oder ähnliche erhalten werden, könnten auf der Grundlage individueller Forschungsinteressen zu zeigen.

Diese Methode kann von Interesse für die Forscher studieren Muskelphysiologie sein. Ähnliche Setup kann auch für isolierte Skelett muscle-tendon/ligament Komplexen von anderen verwendet werdenanatomischen Stellen, sowie für einzelne Fasern und Muskelstreifen.

Protocol

Zusammensetzung der Lösung:

2,5 mM Ca ^{2 +} Tyrodelösung: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl ₂ und 10 mM Glucose

0 mM Ca ^{2 +} Tyrodelösung: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, ₂ mM MgCl 2, 0,1 mM Ethylenglykol tetraessigsäure (EGTA) und 10 mM Glucose

Anmerkung: Badelösung sollte mit 100% O _2, wenn mit dem oben genannten Lösung, aber mit 95% O ₂ und 5% CO ₂ gesättigt werden, wenn unter Verwendung von Bicarbonat-basierten pH-Puffern zu halten konstant. 2,5 mM Ca ^{2 +} in die Bade-Puffer zugegeben, um das Niveau von Ca ^{2 +} gefunden rekapitulieren im Extrazellulärraum und 10 mM Glucose ist wichtig, da noch Mitochondrien funktionsfähig sind in diesen Muskeln um kontinuierlich ATP in Gegenwart von Glukose.

Ein. Setting-up der Ex Vivo Kontraktilität Experiment mitDer ADI PowerLab-System

1. Eine schematische Zeichnung eines 4-Kanal-ex vivo Kontraktilität System ist in Abbildung 1 gezeigt. Ein Computer steuert, um einen Stimulator Rechteckimpulse, die von der Trenneinheit gefiltert werden, um ein Paar aus Platindraht umgebenden jede isolierte Muskel-Sehnen-Komplex erreichen erzeugen. Dies wird auch als Feld Stimulation. Kontraktion des Muskels als Reaktion auf die Stimulation durch einen Kraftaufnehmer, das Signal erzeugt, aus der amplifizierten, wurde filtriert und zurück an den Computer durch einen A / D-Wandler (Signalkonditionierung) übertragen abgefühlt. Das Signal wird dann digitalisiert und können zur späteren Analyse gespeichert werden.
2. Um für eine ex vivo Experiment Kontraktilität, erste Windung auf dem Feld Stimulator, der A / D-Wandler (in diesem Fall ADI Power Lab) oder einer ähnlichen Software (zB LabView), gefolgt von dem Computer herzustellen.
3. Öffnen Chart4 Software (oder andere Software-Version, die mit dem System kompatibel) und initiatea 4-Kanal-Aufgabe, richtige Kommunikation der Software und der Hardware wird durch Starten Konfiguration der Hardware angezeigt, und die START-Taste auf der Software in Betrieb genommen wird (live), die 4-Kanal-Funktion ermöglicht die gleichzeitige Messung von zwei Muskeln ein Wildtyp und eine mutierte Mäuse oder 2 EDL und Soleus 2 aus der gleichen Maus, und es kann für andere Muskeln wie die Membran (Diaphragma gesamte, hemi-Membran oder Diaphragma Muskelstreifen) und der Tibialis anterior eingesetzt werden; es kann auch für Herzmuskel Zubereitungen und für Bündel von Muskeln verwendet werden, insbesondere, wenn man unter Verwendung von Ratten Muskeln. In diesem Fall wird die Größe der Muskeln kann zu begrenzen Sauerstoffdiffusion so Muskelbündel sind daher die bessere Wahl. Allerdings sind Experten Dissektion Techniken für Muskelbündel Vorbereitungen nötig.
4. Kalibrierung des Kraftaufnehmers: Dies ist die Vergleichbarkeit der Datensatz auf verschiedenen Kanälen und zu verschiedenen Zeitpunkten generiert gewährleisten. Erster Start der Aufnahme Sequentially hängen ein 1-g, 2-g und 5-g-Gewichte auf die Probe Hain von dem Kraftaufnehmer, stoppen Sie die Aufnahme, berechnen die entsprechenden Änderungen in mV in jedem Kanal Chart4 Software gezeigt, zeichnen die ΔmV und das Gewicht, um die Linearität zu überprüfen und bestimmen den Umrechnungsfaktor zwischen mV und Gramm Kraft. Wir empfehlen Durchführen dieser Kalibrierungen entweder zu Beginn oder am Ende jedes Experiments, um sicherzustellen, dass eine spezifische Kalibrierung für jeden spezifischen Experiment erhalten wird.
5. Prüfen Sie den einwandfreien Anschluss des Teflonschlauch, abtropfen lassen keine Flüssigkeit in das Gewebe Bad Schlauch, waschen Sie die Kammern dreimal oder mehr ddH ₂ O und füllen mit 20 ~ 25 ml 2,5 mM Ca ^{2 +} Tyrode Lösung. Ca ^{2 +} und Glucose werden in der Badelösung vorgesehen zur Aufrechterhaltung Membranintegrität, Ca ^{2 +} optimale Beladung des SR und eine leicht verfügbare Quelle von Energie zur Erzeugung von ATP durch den Muskel selbst, da Mitochondrien voll funktionsfähig bleiben in diesen Zubereitungen.
6. Überprüfen Sie richtigen Anschluss der Sauerstoffzufuhr, öffnen Sie die Sauerstoffflasche und stellen Sauerstoffzufuhr zum diffusive und homogene sprudelnden der Kammer stellen. Sauerstoffgehalt kann leicht als eine Funktion der Kontraktionskraft gegenüber der Zeit bestimmt werden. Ein Durchflussmesser kann auch installiert werden, insbesondere wenn die Forscher bei der Untersuchung der Auswirkungen von Hypoxie oder Hyperoxie interessiert sind. Wenn Muskeln hypoxischen geworden, Kraft natürlich abnimmt. Während Hyperoxie können auch Schäden Muskeln, aber seine Wirkung möglicherweise auch schwieriger zu erkennen, weil die meisten Experimente unter künstlichen Bedingungen hyperoxischen werden durchgeführt, um die Abwesenheit eines normalen Blutzufuhr zu den Muskeln zu kompensieren. In den meisten Systemen ist es möglich, die verschiedenen Kammern Blase mit der gleichen Menge an Sauerstoff einfach durch Steuerung der Zufuhr von Sauerstoff zu jeder Kammer konstant.
7. Passen Sie die Empfindlichkeit aller Kanäle, um die maximale Kraft Auflösung ohne Sättigung des Kanals zu gewährleisten. Kanal-Empfindlichkeit kann stark variieren Funktion eind Alter des Tieres, experimentelle Temperatur, genetische Manipulationen, Muskelmasse, Mausstamm, und die Fähigkeit der Experimentator richtig sezieren Muskeln frei von Schäden. Nach unserer Erfahrung beim Messen soleus Kontraktionskraft, variiert die Empfindlichkeit von 0,5 bis 10 mV / cm, während im Falle der EDL, könnte die Empfindlichkeit 1-20 mV / cm variieren.
8. Ein Protokoll für die ermüdenden Stimulation muss noch eingerichtet werden. Im Chart4 Software ein Makro eingesetzt werden. Um ein neues Makro-Programm: In der Chart4 Software, klicken Sie auf Start Messen, klicken Sie dann auf Makro, Makro-Befehl, die Aufnahme zu starten, beginnen zu wiederholen, wählen Sie die gewünschte Reizfrequenz, und dann Ende wiederholen. Für eine Äquilibrierung Protokoll wird Stimulus jede Minute für 30 Minuten wiederholt und ermüdenden Protokoll Stimulus wird alle 2 Sekunden für 5 min wiederholt. Diese Änderungen in der Periodizität der Stimulation, unmittelbar auf das Tastverhältnis, das auch eine Funktion der Stimulierung Dauer. Diese Parameter können variiert werden, um verschiedene aspe testencts der Kontraktilität und Ermüdbarkeit.

2. Vorbereiten Intact Muscle Bundles

1. EDL Dissektion: Maus nach NIH-Richtlinien und IACUC institutionellen Tier-Protokolle geopfert. Die Maus wird durch Genickbruch getötet. Maus wird dann an der seitlichen Position angeordnet ist. EDL Muskel ist ein schnell glykolytischen Muskeln mit rosa-weiße Farbe. Es ist etwa 10-13 mm lang und wiegt 8-11 mg in Wildtyp C57BL / 6 Maus. Die EDL hat die Funktionen der Erweiterung Zehen 2-5 und dorso-Beugung des Fußes am Knöchel. Es wird von der peroneal innerviert. Um die EDL zerlegen, einen oberflächlichen Hautschnitt und schnitt den Fascia zwischen der vorderen und der Tibialis posterior Muskelgruppe, und Lokalisieren des Ursprungs (proximalen) wobei Ligament zur lateralen Kondyle der Tibia und überlegene 3/4 der vorderen verbunden ist Oberfläche Fibula (interossea Marge). Schneiden Sie das Band mit zarten Augenheilkunde Schere als distal wie möglich aus dem Muskel, das procedure gibt die proximalen Ursprung des EDL Muskel. Halten Sie das Band mit einer stumpfen Pinzette und ziehen Sie langsam zum Freimachen des EDL. Es könnte notwendig sein, einige der perimysium rund um die EDL und anderen Muskeln rund um die EDL, ein Schritt, der kritisch, da Schäden an der EDL Muskel während dieser heiklen Schritt auftreten geschnitten. Weiter, um das Einsetzen Region, wo die vier distalen Sehnen in den Phalangen der Ziffern 2-5 einfügen möchten. Schneiden Sie die Sehnen so weit wie möglich von den Muskeln.
2. Übertragen Sie die isolierten EDL Muskel in einer Dissektion Schale mit isotonischer Tyrode Lösung. Einige mutierten, transgenen und knockout Tiermodelle haben sehr fragile Muskeln und die Auslastung der Ca ^{2 +-freien} Tyrode-Lösung ist notwendig, um Ca ^{2 +-induzierten} Muskelschäden vor Kontraktilität Messungen zu verhindern. Weiter, verwenden Sie ein chirurgischer Knoten eng binden an beiden Enden der EDL Muskel distal aus dem Muskel wie möglich. Eine gute Maßnahme ist es, etwas oberhalb der Mitte-p bindenOint in Längsrichtung des Bandes oder der Sehne. Verwenden Sie 6-0 Größe Nahtmaterial für dieses Verfahren, und übertragen Sie die EDL Muskel zum O _{2-gesättigten} Gewebe Badkammer, montieren Sie die Muskeln auf die Probe Nut der Kraftaufnehmer und dem Briefpapier Haken an der Unterseite des Badkammer, wiederholen Sie die Verfahren zur anderen Bein. Wir sind auch zu Beginn eine neue Methode, die die Muskeln hält mit Klammern anstelle von Nähten zu nutzen. Wenn das Hauptziel ist, kinetische Eigenschaften und / studieren oder Muskelkraft zu erhalten, wird empfohlen, dass Nahtmaterial so kurz wie möglich sein, oder der Faden mit einem Metallstab ersetzt werden.
3. Soleus Dissektion: die soleus ist eine meist langsam oxidative Muskel mit reichen roten Farbe. Es ist ~ 1 mm kürzer als der EDL wiegt aber etwas mehr als der EDL. Es wird von der Nervus tibialis innerviert und führt die Aktion der plantaren Biegung des Fußes. Um die soleus sezieren, Zugriff auf die hinteren seitlichen Seite des Beins, beiseite schieben gastrocnemius Muskel, der normalerweise deckt die Soleus, und identifizieren den Muskel mit dunkelroter Farbe. Am Ursprung (proximal), schneiden die Bänder verbinden, um der proximalen Hälfte des hinteren Tibia entlang der Linie Soleal und proximalen 1/3 des hinteren Fibula; nächsten, am Einführungsende (distalen), schnitt die Fersensehne dass Einfügungen in das hintere Kalkaneus. Sorgfältig kostenlos bis die soleus und fachgerechten Einbau der M. soleus in der Badewanne Kammer für die EDL.

3. Mess Kontraktilität der isolierten Skelettmuskulatur

1. Sobald die Muskeln in den einzelnen Gewebebad Kammern angebracht sind, starten Sie die Aufnahme. Ähnlichsten Systeme erlauben Nullung der Grundlinie der Kraft Aufnahme. Diese Funktion wird normalerweise mit dem Verstärker verbunden ist, in dem speziellen Fall des PowerLab System als Funktion der Brückenverstärker. Es erleichtert Beobachtung der Baseline Änderungen und bietet eine bequeme Möglichkeit für alle Muskelkontraktionen von Null analysiert werden. Isolierten Muskeln werden dann mit eckigen Wellenimpulse stimuliertdas kann einen großen Bereich als Funktion der Kammergröße, Platindrähten Dicke, der Abstand zwischen den Drähten, und auch die Zusammensetzung der experimentellen Lösung. Wir haben eingesetzten Strom von 60 mA (wir haben festgestellt, dass Ströme über 350 mA schädlich sein, um Muskeln Präparate scheinen) und stimulierende Züge 350, 500 und 1000 ms, je nach den Zielen einer bestimmten Protokoll. Die einzelnen Rechteckimpulse hätte Dauer im Bereich von 0,3 bis 1 ms.
2. Der nächste Schritt ist, eine Frequenz der Stimulation der Lage ist, einen kondensierten tetanische Stimulation auszuwählen (zB 100 Hz bis ~ Herstellung Maximalkraft in EDL Muskel und ~ 60 Hz in Soleusmuskel erlauben), während langsam und vorsichtig Streckung der Muskeln, die Identität des optimale Länge dieser Muskeln. Da Muskeln vorsichtig gedehnt werden, für 30 s warten und stimulieren bei 100 Hz; warten Sie 30 s und strecken wieder, und wiederholen Sie dann die Stimulation, bis zu dem Punkt, wo die Kraft nicht erhöhen nicht mehr.
3. Diese Muskeln haben undergone signifikante Veränderungen in der Umwelt. Es wird empfohlen, dass die Muskeln dürfen an die neue Umgebung anzupassen, bezeichnet ein Schritt in unseren Protokollen "Äquilibrierung". Äquilibrieren dieser Muskeln bei der gleichen Frequenz der Stimulation während der Dehnungsphase, 100 Hz für 20-30 min, verwendet werden, bis mindestens 5 aufeinanderfolgende tetanische Kontraktionen völlig stabil sind (nicht reduzierenden, nicht zu erhöhen, stabile Grundlinie). Periodizität der stimulatorischen Zügen (100 Hz, 500 ms Dauer, 1 ms einzelnen Impuls) während der Äquilibrierung für 1 min, was einem Tastverhältnis von 1,66% entspricht, ein ermüdungsfreies Stimulation. In diesem Zusammenhang bedeutet ein Tastverhältnis von 1,66%, die sich auf insgesamt 100%, Muskeln arbeiten 1,66% der Zeit, die durch die Erhöhung Tastverhältnis Muskeln schließlich kann zu Ermüdung induziert werden. Wenn nicht anders Muskeln von gesunden, Wildtypmaus ein ermüdungsfreies Profil während dieser Äquilibrierung Zeit zeigen, ist es möglich, dass sie bei der Präparation wurden beschädigt wird Hypoxie in den Kammern / Muskeln vorkommende oder übermäßige electrolysis durch den Stimulationselektroden ist freie Radikale zu erzeugen. Westerblad zuvor vorgeschlagen, dass Ströme größer als 400 mA die Bildung von freien Radikalen ²³ induzieren. Offensichtlich ist die höchste Qualität Platin vorgeschlagen, da andere Metalle wird sicherlich zu Bildung freier Radikale und Muskel-Toxizität führen.
4. Besorgen Sie sich die Kraft-Frequenz-Verhältnis (FF) durch die Stimulierung der Muskeln mit den folgenden Stimulationsfrequenzen: 1-140 Hz (in Schritten von 5-10 Hz), mit einer Periodizität von 30-60 s bei der Durchführung von Experimenten bei 25 ° C. Bei der Durchführung von Experimenten bei 37 ° C, verlängern die FF zu höheren Frequenzen von bis zu 300 Hz für Zwerchfell, 180-200 Hz für soleus und 220-250 Hz für EDL. Als Nächstes identifiziert der Frequenz der Stimulation, die eine maximale tetanische Kraft (T _max) und ungefähr ½ maximale Kraft tetanische (1/2 T _max) erzeugt; ist es manchmal schwierig, die genaue ½ T _max für sowohl EDL und Sohle erhaltenuns Muskeln, wenn nur ein Stimulator Quelle verwendet wird, wegen der Unterschiede zwischen diesen intrinsischen Muskeln. Eine brauchbare Lösung ist es, eine Frequenz, die 30-70% der T _max erzeugt zu identifizieren. Die Begründung für diesen Frequenzen der Stimulation ist, dass T _max wichtige Informationen von kontraktilen Maschinen Ereignisse / Modulation ermöglicht, während die ½ T _max liefert Informationen mehr relevant für die Ca ^{2 +-Regulierung} und der ECC-Prozess. Um sicher zu sein, dass die maximale Kraft erreicht worden ist, kann 10-20 mM Coffein in die Bade-Lösung zugesetzt werden, während die Stimulierung der Muskeln. Wenn maximale Kraft erreicht ist, wird Kraft nicht in Gegenwart von Coffein zu erhöhen. Der FF nach rechts verschoben und Kräfte in der Regel etwas höher bei höheren Temperaturen experimentellen. Mit diesem System können auch beliebige andere Stimulationsfrequenzen wenn erwünscht durchgeführt werden. Die deutliche kontraktilen Profil eines schnellen glykolytischen EDL Muskel-und eine langsame-oxidative soleus Muskel istin 2 gezeigt.
5. Nach der Äquilibrierung, Müdigkeit die Muskeln an ½ T _max für 5 min mit Stimulation Intervall von 2 s und 25% Tastverhältnis (Abbildung 3). Diese spezifische ermüdend Protokoll wird angenommen, besser widerspiegeln den Beitrag des sarkoplasmatischen Retikulums Ca ^{2 +-Freisetzung} für Muskelkontraktilität ^31.
6. Zurückgewinnung der Muskel an ½ T _max für 30 min oder bis die Kraft stabil ist, bei 1 min Intervall. Ein zusätzliches Protokoll ermüdend kann nun ausgeführt werden unter Verwendung von T _max Stimulation, die vermutlich den Status des kontraktilen Maschinen ³¹ zu reflektieren. Eine weitere Option besteht darin, die ermüdende Protokoll verlaufen stimulatorischen Zügen interkalieren, die T _max und T _max ½ während der Ermüdung zu erzeugen und um die Muskeln mit der gleichen Art der Stimulation erholen.
7. Wiederholen Sie den FF wie in Schritt 3.4 beschrieben; die Begründung ist, dass phänotypische Unterschiede zwischen diffErent Stämmen Krankheitsmodellen oder medikamentösen Behandlungen kann durch Analyse der FF vor und nach Ermüdung beobachtet werden. Wir haben zum Beispiel berichtet, daß nach Erschöpfung des FF junger Wildtyp Muskeln nach links verschoben wird, während in den Muskeln aus gealterten Muskeln, nach rechts verschoben wird, was nahelegt, differenziellen modulatorische Wirkungen von Skelettmuskel Müdigkeit als eine Funktion der Alterung.
8. Um den Beitrag der extrazellulären Ca ^{2 +-Einstrom} in Muskelkontraktilität sondieren kann Badelösung in eine Lösung, die kein Ca ^{2 +} 0,1 mM EGTA, aber (0 mM Ca ^{2 +} Tyrodelösung) ³² geändert werden. Alternativ können unterschiedliche Blocker store-betriebene Kanal in der Bade-Lösung aufgebracht werden. Einige Beispiele sind: 2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-Bis (trifluormethyl) pyrazol 2 (BTP-2) und azumolene usw. ^{33, 34.} Coffein kann verwendet werden, um die Funktion des Ryanodinrezeptor sondieren und KCl verwendet werden, um die gesamte zu beurteilenDepolarisation Eigenschaften der Präparate. Andere Medikamente können auch verwendet werden, um die wichtigen Modulation der Kraft während Ermüdung untersuchen durch die Na ^+, K ⁺ ist, und der Na ^{+-K +} Pumpen ^35. Die meisten dieser Medikamente haben relativ kleine Größen und scheint schnell in diesen Muskeln Zubereitungen durch ihre unmittelbaren Auswirkungen nachgewiesen diffundieren. Das Fehlen eines Effekts durch jedes gegebene Medikamente nicht notwendigerweise bedeutet, dass das Arzneimittel unwirksam ist und zusätzliche Tests unter Verwendung Dosis deutlich höher als die in einzelne Muskelfasern Experimenten verwendet werden, sind manchmal notwendig.
9. Eine einzigartige Anwendung dieser ex vivo führten zur Entdeckung von mechanischen alternans in tric-a ^{- / -} Muskeln ^{4, 30.} Alternans als schwankende Burst Episoden kontraktile Kraft während der Rückgang Phase der Ermüdung definiert. Während dieser Veranstaltungen kontraktilen Kraft kann momentan über seinen previous level Kraft erhöhen währendermüdenden Stimulation, weil, dass entweder mehr Ca ^{2 +} freigesetzt wird oder die kontraktilen Maschinerie geworden empfindlich auf Ca ^{2 +.} Die Kontraktionskraft Ausbruchs war um 50% höher als seine früheren Kraft und die Ausbrüche sollte mindestens 10-mal während der 5-min Müdigkeit Stimulation Prozesses gesehen werden. Mechanic alternans sind nicht in der Skelettmuskulatur gemeinsamen von den Wildtyp-Mäusen, kann aber in einigen Mutanten Muskeln mit Störung der intrazellulären Ca ^{2 +-Signalisierung} Prozess wie der trimeren intrazelluläre Kation Kanaltyp A (tric-a) gesehen werden ^{- / -} Muskeln ^4. Mechanic alternans durch ermüdende Reize induziert werden kann, die Behandlung mit Koffein und Cyclopiazonsäure (CPA), siehe Abbildung 3 für eine repräsentative Erfassung dieser mechanischen alternans. Die Natur dieses Phänomens ist ziemlich faszinierend, während ein Muskel, wird ermüden scheint in der Lage, um vorübergehend zu produzieren mehr Kraft. In unserer früheren Veröffentlichung, Kombination mit einzelnen Zelle Ca ^{2 +-Analyse} zeigt, dass Aussehen Alternans ist ein Ergebnis der SR Ca ^{2 +-Überladung} und instabile SR. Wir glauben, dass ein tieferes Verständnis der Alternans könnte zu einem besseren Verständnis der ECC-Prozess führen.
10. Am Ende des Experiments, messen Sie die Länge und das Gewicht der einzelnen Muskeln mit kalibrierten Bremssattel und analytische Waage, schockgefroren den Muskel in flüssigem Stickstoff und sparen bei -80 ° C, da biochemische Analysen in diesen Muskeln ausgeführt werden können. Diese Muskeln können auch mechanisch-gehäutet für detaillierte Untersuchung des ECC Verfahren oder für die Bestimmung der wesentlichen kontraktilen Eigenschaften in Abwesenheit des ECC Regulationsmechanismen chemisch gehäutet werden.
11. Aufgenommen Muskelkraft (mV) wird zunächst umgewandelt Gramm Kraft basierend auf Ergebnisse der Kalibrierung und dann auf die physiologischen Querschnittsfläche (PCSA) anhand der folgenden Formel normiert: Muskelkraft (N / cm ²⁾ = (Kraft (g) x Muskeln längeh (cm) x 1,06) / (Muskel Gewicht (g) x 0,00981) ^5,36. Alternativ kann Muskelkraft zu Gesamtprotein oder totale Aktin Inhalt der einzelnen Muskel mit Bradford-Protein-Assay / Commossie Blau-Färbung Quantifizierung normalisiert werden. Unter bestimmten Bedingungen während Muskelmasse könnten ernsthaft infolge von Krankheiten, Seneszenz, medikamentöse Behandlungen, Kraft Normalisierung auf Muskelmasse, Protein und / oder Aktin bezogen ein stabiler Wert liefern können betroffen sein.

4. Repräsentative Ergebnisse

Typische Raumtemperatur kontraktilen Kräfte der EDL und Soleus Reaktion auf niedrigen, mittleren und hohen Frequenzen Reize sind in Abbildung 2 dargestellt. Die ETL-Kontraktion durch 5 Hz stimulusinduzierten bleibt als einzelne Zuckungen durch die schnelle Wirkung des SERCA Ca ^{2 +-ATPase} und die intrinsische Ca ^{2 +-Empfindlichkeit} Eigenschaften der kontraktilen Maschinen, während der Soleus Kontraktion durch 5 Hz beginnt zu schmelzen (langsamer ATPase einerd höhere Empfindlichkeit gegenüber Ca ^{2 +} des kontraktilen Maschinen), aber die Spitzenwerte Kräfte sind immer noch getrennt. Bei 20 Hz Stimulation werden EDL Kontraktionen teilweise verschmolzen, während die der Soleus bildet eine vollständig verschmolzen tetanische Kraft. Bei der Frequenz der Stimulation, die T _max Stimulation, die bei Raumtemperatur von 80 bis 110 Hz für EDL und 60-90 Hz für soleus, schnell Aufwärtshub und schnellen Relaxation der Kraft in tetanische EDL variieren kann angemerkt werden, was gegen produziert ist die langsamen Merkmale des Soleusmuskel. 2B zeigt, dass die Kraft-Frequenz-Kurve des EDL Muskel nach rechts verschoben wird, um den Musculus soleus Vergleich anzeigt, dass Soleus empfindlicher gegenüber Ca ^{2 +-Freisetzung} zu jeder gegebenen Frequenz sind Stimulation durch das Vorhandensein der langsamen Myosin und Troponin Isoformen. Darüber hinaus reagiert der kontraktilen Maschinen mit relativ mehr Kraft in Soleusmuskel bei niedrigeren Frequenzen. Abbildung 3 zeigen,sa normale Müdigkeit Profil der EDL (oberes Bild) und M. soleus (Mitte). Beachten Sie die schnelleren Rückgang der kontraktilen Kraft unter ermüdenden Stimulation in der EDL Muskel-und die höhere Abnahme der Kraft am Ende der 5-min Müdigkeit Protokoll. Schließlich wurde eine typische mechanische Alternan Profil eines mutierten Muskel in Abbildung 3 (unten), die als momentane Kraft Ausbrüche während der rückläufigen Phase der Muskelermüdung Profil definiert wurde gezeigt. Die Kontraktionskraft Ausbruchs war um 50% höher als seine früheren Kraft und die Ausbrüche sollte mindestens 10-mal während der 5-min Müdigkeit Stimulation Prozesses gesehen werden.

Abbildung 1. Schematische Darstellung einer 4-Kanal-ex vivo Kontraktilität System. Rechteck-Impulse werden von einem Computer Steuerung eines Grass Stimulator erzeugt. Zwei Stimulation Isolierstationen filtern den Reiz, die aus der elektronischentrische Stimulatoreinheit zur Entfernung etwaiger Schwankungen in dem elektrischen Signal und ein stabiles Rechtecksignal etablieren. Dieses gefilterte elektrische Signal wird zu den Kammern 4 Bade enthaltend die Platindrahtelektroden umgebenden jedes isolierten Muskeln geschickt. Letztlich ist es der Strom über die beiden Elektroden (genannt Feldstimulation), die ein Aktionspotential zu erzeugen, induziert die Kontraktion des Muskels. Diese Kontraktion durch ein spezifisches Kraftaufnehmer übertragen zu den Brückenverstärker detektiert wird, filtriert, gemittelt (Signalkonditionierung) und aufgenommen von Computer-Software durch einen A / D-Wandler.

Abbildung 2. . Vertreter kontraktilen Kräfte der EDL und Soleus (A) kontraktile Kräfte um 5 Hz (obere Reihe), 20 Hz (Mitte) und die maximale tetanische Kraft (T _max) (unteres Bild) induziert, Einlass zeigt eine Spur von kontraktilen Kraft einer beschädigt Muskel, (B) einVertreter eingestellt zeigt die einzelnen Kontraktionen eines Kraft-Frequenz-Beziehung in EDL (FF, oberes Bild) und der gezeichneten Kurve aus dem FF (unteres Bild). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. Vertreter ermüdenden Profil und mechanische alternans. Ein typisches schnellen Rückgang ermüdenden Profil der EDL Muskel (oberes Feld) und dem langsamen Niedergang ermüdenden Profil des M. soleus (Mitte). Ermüdenden Stimulation führt zum Auftreten von mechanischen alternans in tric-a ^{- / -} Muskeln mit einer gestörten Ca ^{2 +} Handling-Eigenschaften (unteres Bild).

Discussion

Messung der Kontraktionskraft und Ermüdbarkeit ist für die umfassende Beurteilung der Skelettmuskulatur Funktion wichtig. Der Hauptzweck dieses Tests ist es, Veränderungen in Muskelkraft und ermüdend Eigenschaften unter bestimmten pathologischen Bedingungen, wie Sarkopenie und Muskelermüdung zu identifizieren und die Wirkung von Medikamenten / Reagenzien auf Muskelkontraktilität testen. Da die Muskelkraft ist eng mit der intrazellulären Ca ^{2 +-Freisetzung} aus, extrazelluläre Ca ^{2 +-Eintrag} und das Übersprechen zwischen diesen beiden, können wir auch Informationen über die Ca ^{2 +} Signalisierungsstatus im Skelettmuskel mit dieser Methode. Hier zeigten wir eine einzigartige Phänotyp als "Mechaniker alternans", wenn schwankende Burst Episoden kontraktile Kraft während der Rückgang Phase der Ermüdung Profil unter einem überladenen und instabil SR gesehen wurden. Man könnte erwarten, dass eine Vielzahl von Skelettmuskel Phänotypen einschließlich veränderter Kraft, FF, Ermüdbarkeit, kontraktilen Kinetik und Rückgewinnung ability nach Ermüdung kann unter Verwendung der in vitro Kontraktilität Assay unter verschiedenen pathologischen Bedingungen werden.

Der wichtigste Schritt für diesen Assay ist auf ganze intakten Muskeln (oder Muskelbündel und Muskel Streifen), die frei von Schäden sind zu isolieren. Ein solches Ziel ist einfacher, in ganzen Muskel Präparaten erzielt werden. Hier zeigen wir, dass das Verlassen genug Bänder und Sehnen, die gesamte Muskulatur zu binden ist sehr wichtig, um zu verhindern, binden den Muskel selbst, die Schädigung der Muskulatur und schließlich Muskel Tod führt. Darüber hinaus ist konstant durchperlt Lösungen entweder mit 100% O ₂ in dem Fall von HEPES-basierte Lösungen oder einem Gemisch aus O ₂ und CO ₂ zum Bicarbonat-basierten Lösungen kritisch. Verhindern Hypoxie und Hyperoxie ist wichtig, während ein Durchflussmesser verwendet werden. Wir haben auch in bestimmten Situationen ein bestimmtes Gerät, das gelösten Sauerstoff in Flüssigkeiten Baden das Gewebe misst. Unter bestimmten Bedingungen, bei denen Muskeln sind more anfällig für Beschädigungen, wird die Handhabung der isolierten Muskel in einem Ca ^{2 +-freien} Lösung vor der Montage auf den Kraftaufnehmer helfen, den Muskel zu entspannen und zu minimieren Muskelschäden vor dem Experiment. Arzneimittel, wie 2,3 - Butandion Monoxim (BDM) oder N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid (BTS) kann auch beim Präparieren hinzugefügt werden, um Schäden zu minimieren, insbesondere wenn Muskelbündel oder Muskel Streifen hergestellt werden, welches gemeinsam für die Kontraktilität Studie der Membran ^{37, 38.} Während der Aufnahme werden beschädigte Präparate erzeugen normalerweise weniger Kraft und haben zugenommen Basislinienrauschen und Schwankungen (siehe Einlass Abbildung 2), und die Ergebnisse von diesen Muskeln kann aus der Analyse Datensatz ausgeschlossen werden, wenn sie Teil des Experiments, um Antworten von beschädigten analysieren Muskeln. Ein weiterer Punkt, einfach ignoriert werden kann oder vergessen ist, dass die elektrische Stimulation selbst kann eine Quelle von Toxizität für Muskeln werden. Wir empfehlen periodische Reinigung der Elektroden und des chamber mit einer 1% Hypochloritlösung um irgendwelche Verunreinigungen, Protein Schutt, Oxidation etc. Besondere Vorsichtsmaßnahmen Anhäufung zu entfernen sind auch erforderlich, bei der Einstellung der Länge des montiert Muskel. Es ist wichtig, in kleinen Schritten strecken, um eine Überdehnung als die optimale Ausrichtung der dünnen und dicken Filamenten vermeiden ist kritisch für ein effizientes Funktionieren Querbrücke ^39. Darüber hinaus ist es empfehlenswert, dass die relative Position der montierten Muskelbündel zu den Stimulationselektroden Bereich konstant gehalten wird und unter allen Kanälen ausgerichtet, diese gleich Menge des elektrischen Stroms gewährleistet ist, die den isolierten Muskeln angewendet. Unter unseren experimentellen Bedingungen bleiben Muskeln von jungen Wildtyp-Mäusen für über 12 Stunden stabil und noch länger, wenn Antibiotika, 0,2% FBS und Aminosäuren in die Bade-Lösung zugegeben.

Mit Sorgfalt und angemessene Kontrolle, könnte dies ex vivo-System Informationen über die Korrelation zwischen Ca ^{2 +} Signalisierung eind Muskelkontraktion ohne die Komplexität des Gefäßsystems, endokrinen und des Nervensystems. Zum Beispiel, Verlust der Abhängigkeit von extrazellulären Ca ^{2 +} ist eine Unterschrift des Alters Skelettmuskulatur, während SR Ca ^{2 +-Freisetzung} Dysfunktion ergibt in der Regel geringer Kontraktionskraft und schnell ermüdend Profil. Als exampled hier zeigt Erscheinungsbild der mechanischen alternans instabilen SR, von denen wir glauben nicht an tric-a begrenzt ^{- / -} Muskeln, sondern auch in anderen Skelettmuskeln unter pathologischen Bedingungen Erzeugung SR Ca ^{2 +} Überlast und Instabilität. Dieser Aufbau erlaubt den direkten Zugriff des Muskels nach verschiedenen physiologischen und pharmakologischen Manipulationen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5