Summary
हम सीधे मांसपेशी बल, बाहुबल, सिकुड़ा कैनेटीक्स और एक में पृथक कंकाल की मांसपेशियों की fatigability को मापने के लिए एक विधि का वर्णन
Abstract
यहाँ वर्णित पृथक कंकाल की मांसपेशियों का सिकुड़ना को मापने के लिए एक तरीका है. मांसपेशी बल, बाहुबल, सिकुड़ा कैनेटीक्स, fatigability, और थकान के बाद वसूली के रूप में इस तरह के मानकों के लिए उत्तेजना संकुचन युग्मन के विशिष्ट पहलुओं (ECC) excitability के रूप में ऐसी प्रक्रिया है, सिकुड़ा मशीनरी और Ca 2 + से निपटने करने की क्षमता का आकलन करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. इस विधि तंत्रिका और रक्त की आपूर्ति को हटा और पृथक कंकाल की मांसपेशी पर ही केंद्रित है. हम नियमित रूप से इस विधि का उपयोग करने के लिए आनुवंशिक घटक है कि हालांकि modulating Ca 2 + संकेत दे रास्ते कंकाल की मांसपेशी के सिकुड़ा संपत्ति को बदलने की पहचान कर सकते हैं. यहाँ, हम विभिन्न और अमीर जानकारी कि इन विट्रो मांसपेशी सिकुड़ना परख में उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता का एक उदाहरण के रूप में एक नव पहचान कंकाल की मांसपेशी phenotype, यानी, मैकेनिक alternans, का वर्णन. इस परख के एकल कक्ष assays, आनुवंशिक दृष्टिकोण और biochemi साथ संयोजनstry assays कंकाल की मांसपेशी में ECC के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
Introduction
कंकाल की मांसपेशियों कंकाल की हड्डियों के लिए देते हैं और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के नियंत्रण के अधीन सिकुड़ा बलों उत्पन्न. उत्तेजना संकुचन युग्मन (ECC) एक यांत्रिक जवाबी कार्रवाई के लिए एक बिजली के प्रोत्साहन को बदलने की प्रक्रिया के लिए संदर्भित करता है. Ca 2 + संकेतन कंकाल की मांसपेशी में सिकुड़ा समारोह का एक अनिवार्य घटक है. प्रभावी Ca 2 + sarcoplasmic जालिका (एसआर) से जुटाना ECC के लिए मांसपेशी कोशिकाओं 1, 2 में एक महत्वपूर्ण घटक है, और intracellular 2 Ca में परिवर्तन + संकेतन मांसपेशी 3-5 रोगों की संख्या में इसी सिकुड़ा रोग आबाद है. मांसपेशी सिकुड़ना के समुचित मूल्यांकन आवश्यक है और 2 सीए करने के लिए स्वतंत्र है + इमेजिंग और अन्य assays कंकाल की मांसपेशी समारोह में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, सिकुड़ा स्तर पर ही नहीं, लेकिन यह भी गतिज स्तर पर. सेना और गति भी की महत्वपूर्ण संपत्ति को सूचित करने के लिए प्राप्त किया जा सकता हैमांसपेशियों और विभिन्न शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत शक्ति ECC प्रक्रिया की स्थिति.
अनुसंधान के इस उपजाऊ क्षेत्र में एक बहुत समृद्ध इतिहास है और मांसपेशियों में संकुचन के कई सिद्धांतों दो 6 सदियों से दिखाई दिया. आधुनिक मांसपेशी अनुसंधान शायद Leeuwenhoek द्वारा 6 मांसपेशी फाइबर में पार striations और myofibrils का सूक्ष्म अवलोकन के साथ 1674-1682 में शुरू होता है. लगभग एक सदी बाद, Luigi Galvani मनाया कि मेंढक मांसपेशियों अनुबंध सख्ती जब अपने तंत्रिका स्केलपेल के साथ एक दूर बिजली 7-9 मशीन से एक चिंगारी निर्वहन के दौरान छुआ है. संकुचन भी पेशी के लिए एक धातु कंडक्टर के माध्यम से पैर तंत्रिका को जोड़ने से उत्पादन किया जा सकता है. जटिल बिजली संकेतन तंत्र के विवरण Galvani द्वारा की वकालत अंततः उनके प्रसिद्ध समीकरण 11 10, कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की नींव बन गया Hodgkin, हक्सले और Katz द्वारा तैयार थे. Rin की उल्लेखनीय टिप्पणियोंप्रासंगिकता की कोशिकी Ca 2 + मेंढक दिल और कंकाल की मांसपेशियों 12-15 का सिकुड़ना पर प्रभाव पर Ca 2 की मान्यता में पहली बड़ी मांसपेशी सिकुड़ना 16, 17 के एक महत्वपूर्ण नियामक + कदम के रूप में प्रतिनिधित्व करते हैं. 1980 से वर्तमान दिन मांसपेशी सिकुड़ना क्षेत्र में खोजों में से एक फट कारण मांसपेशी सिकुड़ना और murine कंकाल 18 मांसपेशियों में fatigability प्रोटोकॉल की शुरूआत करने के लिए महसूस किया गया. जोन्स और एडवर्ड्स 19 ECC मशीनरी में परिवर्तन और सिकुड़ा तंत्र के साथ नहीं जुड़े थे कि कम आवृत्ति आंतरायिक थकान (बल में कमी व्यायाम प्रेरित) का सुझाव पहले थे. और Kolkeck एट अल 20, Kolbeck और नोसेक 21, और 22 रीड देर से 1980 और 1990 के दशक के आरंभ में, कृंतक मॉडल से डायाफ्राम मांसपेशी का उपयोग कर रहे थे कंकाल की मांसपेशी सिकुड़ना पर theophyllines, cortiosterone, और मुक्त कण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, जबकि ब्रूक्स और Faulknएर दोहराया शक्ति और तेजी से और 22 चूहों से धीमी गति से मांसपेशियों में शक्ति मापन की माप पर पहली रिपोर्ट थे. इसके अलावा, Lannegren, Westerblad, मेम्ने, और Westerblad के सीधे intracellular Ca 2 विनियमन + के साथ पूर्व vivo सिकुड़ना लिंक पहले थे और मांसपेशी थकान 23, 24 में अम्लरक्तता की भूमिका पूछताछ शुरू.
हमारी प्रयोगशालाओं काफी बरकरार माउस मांसपेशी सिकुड़ना अध्ययन के एक संयोजन का उपयोग करके जल्दी 2000 modulatory और नियामक भूमिकाओं के साथ उपन्यास जीन की समझ की दिशा में मांसपेशी सिकुड़ना, fatigability, और उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका के साथ मांसपेशी ECC के बाद से योगदान दिया है, intracellular Ca 2 + की निगरानी में बरकरार है और चमड़ी मांसपेशी फाइबर और आणविक आनुवंशिक जोड़तोड़ 3-5, 25-29.
यहाँ हम murine पृथक soleus और extensor digitorum longus मापने सिकुड़ना (ईडी के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विस्तृतएल) मांसपेशियों, ज्यादातर धीमी गति से oxidative (प्रकार मैं और IIa मांसपेशी फाइबर) और विशिष्ट सिकुड़ा गुणों के साथ एक तेजी से glyocolytic ज्यादातर मांसपेशियों (प्रकार IIb और IIx मांसपेशी फाइबर) जो के अनुरूप इस प्रोटोकॉल में बरकरार मांसपेशी कण्डरा परिसरों अलग और एक ADI PowerLab Radnotti कक्ष या तो शुद्ध ऑक्सीजन या ऑक्सीजन का एक मिश्रण (95%) और सीओ 2 (5%) के साथ आपूर्ति प्रणाली में नहाया करते थे. सिकुड़ा बलों एक घास उत्तेजक औधधि से बिजली stimulations द्वारा उत्पन्न किया गया और एक बल transducer है कि एक ADI PowerLab/400 प्रणाली के साथ एकीकृत किया गया, मैक्रो दिनचर्या का अनुकूलन, डेटा का अधिग्रहण, संग्रह, डिजिटलीकरण और भंडारण को नियंत्रित करने के लिए अनुमति का उपयोग कर पाया. इस सेटअप मांसपेशियों में बल, बाहुबल, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बल बनाम आवृत्ति संबंध, मांसपेशियों में थकान, मांसपेशियों की थकान, गति और मांसपेशियों में संकुचन के समग्र गतिज गुणों से वसूली उपाय कर सकते हैं. इसके अलावा, मांसपेशियों में संकुचन पर दवाओं के प्रभाव इन प्रयोगों के माध्यम से नजर रखी जा सकती है. इस पद्धति का लाभ कंकाल की मांसपेशी से दूर neuronal और संवहनी उपकरणों को हटाने में रखना, मांसपेशियों के करार के आंतरिक गुणों के प्रत्यक्ष मूल्यांकन की अनुमति. इसके अलावा, पूर्व vivo सिकुड़ना assays कोशिकी पृथक मांसपेशियों आसपास के परिवेश, जो विभिन्न आयन पारगमन चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के औषधीय जोड़तोड़ क्रम में कंकाल की मांसपेशी समारोह के लिए उनके शारीरिक भूमिकाओं को परिभाषित के उपयोग में सक्षम बनाता है के हेरफेर की अनुमति.
यह पूर्व vivo प्रणाली हमें हाल ही में एक अलग व्यवहार कुछ उत्परिवर्ती मांसपेशी की तैयारी में alternan + गुण जो बदल intracellular Ca 2 से जुड़े थे 4 से निपटने की खोज करने के लिए अनुमति दी गई है. Alternans थकाऊ प्रोफाइल की गिरावट के चरण के दौरान सिकुड़ा बल के अस्थिर फट एपिसोड के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. इन घटनाओं के दौरान सिकुड़ा बलों क्षण भर के बल घ के अपने पिछले स्तर से ऊपर वृद्धिथकाऊ उत्तेजना uring, शायद क्योंकि या तो अधिक 2 Ca + जारी किया जा रहा है या सिकुड़ा मशीनरी अधिक Ca 2 30 + प्रति संवेदनशील बन गया है. हैं cyclopiazonic एसिड (सीपीए) और sarcoplasmic जालिका कैल्शियम (SERCA) ATPase, कैफीन, ryanodine चैनल (RyR) के एक agonist के एक प्रतिवर्ती अवरोधक के उपचार और stimulations थकाऊ दोहराया सभी यांत्रिक alternans 4 को प्रेरित कर सकते हैं, सुझाव है कि alternans सीधे से संबंधित हैं चुनाव आयोग युग्मन प्रक्रिया के मॉडुलन. विधि का प्रदर्शन करने के लिए प्रेरित करने के लिए और इन विट्रो सिकुड़ना सेटअप में मैकेनिक alternans रिकॉर्ड विविध प्रयोगात्मक पैरामीटर है कि इस प्रणाली या इसी तरह के लोगों के साथ प्राप्त किया जा सकता है और व्यक्तिगत अनुसंधान के हितों के आधार पर, दिखाने के लिए एक उदाहरण के रूप में कार्य करता है.
इस विधि ब्याज की मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के शोधकर्ताओं के लिए हो सकता है. इसी तरह के सेटअप भी दूसरे से अलग कंकाल muscle-tendon/ligament परिसरों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसंरचनात्मक स्थानों, के रूप में एकल फाइबर और मांसपेशी स्ट्रिप्स के लिए.
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Protocol
समाधान: रचना
2.5 मिमी Ca 2 + Tyrode समाधान: 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 2.5 मिमी CACL 2, 2 मिमी 2 MgCl और 10 मिमी ग्लूकोज
0 मिमी Ca 2 + Tyrode समाधान: 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 MgCl, 0.1 मिमी इथाइलीन ग्लाइकॉल tetraacetic (EGTA) एसिड और 10 मिमी ग्लूकोज
नोट: स्नान समाधान उपरोक्त समाधान का उपयोग कर, लेकिन अगर 95% 2 हे के साथ 5% सीओ 2 के साथ 100% 2 हे के साथ संतृप्त किया जाना चाहिए अगर बिकारबोनिट आधारित buffers का उपयोग करने के लिए पीएच स्थिर रखने के लिए. 2.5 मिमी Ca 2 + स्नान बफर करने के लिए जोड़ा है Ca 2 का स्तर पुनरावृत्ति करना + बाह्य अंतरिक्ष में पाया और 10 मिमी ग्लूकोज महत्वपूर्ण है क्योंकि mitochondria इन मांसपेशियों में अभी भी कार्य कर रहे हैं लगातार ग्लूकोज की उपस्थिति में एटीपी उत्पादन.
1. स्थापना पूर्व vivo सिकुड़ना का उपयोग करके प्रयोगADI PowerLab प्रणाली
- एक 4 चैनल पूर्व vivo सिकुड़ना प्रणाली की एक योजनाबद्ध ड्राइंग चित्र 1 में दिखाया गया है. एक कंप्यूटर एक वर्ग तरंग दालों, है जो अलगाव इकाई द्वारा फ़िल्टर प्लैटिनम तार आसपास के प्रत्येक पृथक जटिल मांसपेशी कण्डरा की एक जोड़ी तक पहुँचने उत्पन्न उत्तेजक औधधि नियंत्रित करता है. यह भी क्षेत्र उत्तेजना कहा जाता है. उत्तेजना के जवाब मांसपेशियों के संकुचन एक बल transducer, उत्पन्न संकेत जिसमें से परिलक्षित था, फ़िल्टर और कंप्यूटर को वापस एक ए / डी कनवर्टर (संकेत कंडीशनिंग) स्थानांतरित द्वारा महसूस किया गया था. संकेत तो और डिजीटल है और बाद के विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है.
- एक पूर्व vivo सिकुड़ना प्रयोग, क्षेत्र उत्तेजक औधधि पर पहली बारी, ए / डी कनवर्टर (इस मामले ADI पावर लैब में) या इसी तरह के सॉफ्टवेयर (जैसे, Labview), कंप्यूटर द्वारा पीछा करने के लिए तैयार है.
- Chart4 (सॉफ्टवेयर या अन्य सॉफ्टवेयर है कि सिस्टम के साथ संगत संस्करण) और initiat खोलेंea कार्य 4 चैनल, सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर के उचित संचार हार्डवेयर के विन्यास को शुरू करने से संकेत दिया है, और सॉफ्टवेयर पर स्टार्ट बटन चालू हो जाता है (जी), 4 चैनल समारोह से मांसपेशियों की एक जोड़ी के साथ - साथ माप की अनुमति देता है एक जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों, या 2 EDL और एक ही माउस से 2 soleus मांसपेशियों, और यह (पूरे डायाफ्राम, Hemi, डायाफ्राम, या डायाफ्राम मांसपेशी स्ट्रिप्स) और पूर्वकाल tibialis डायाफ्राम के रूप में अन्य मांसपेशियों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; यह हृदय की मांसपेशी की तैयारी के लिए और मांसपेशियों के बंडलों के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, खासकर अगर एक चूहे की मांसपेशियों का उपयोग कर रहा है. इस मामले में मांसपेशियों के आकार ऑक्सीजन प्रसार सीमा तो मांसपेशी बंडलों इस तरह एक बेहतर विकल्प हो सकता है. हालांकि, विशेषज्ञ विच्छेदन तकनीक मांसपेशियों के बंडल की तैयारी के लिए आवश्यक हैं.
- बल transducer के अंशांकन: यह करने के लिए विभिन्न चैनलों पर और अलग अलग समय पर उत्पन्न डाटासेट की comparability सुनिश्चित करने के लिए है. पहले शुरू रिकॉर्डिंग, sequentially बल transducer का नमूना ग्रोव पर 1-जी, 2-छ और 5 छ वजन लटका, रिकार्डिंग को रोकने के लिए, mV में इसी परिवर्तन Chart4 सॉफ्टवेयर के प्रत्येक चैनल में दिखाया की गणना, ΔmV और वजन साजिश करने के लिए linearity की जांच और एमवी और बल के ग्राम के बीच रूपांतरण कारक का निर्धारण करते हैं. हम या तो शुरुआत में या प्रत्येक प्रयोग के अंत में इन calibrations प्रदर्शन करने के लिए विश्वास दिलाता हूं कि एक विशिष्ट अंशांकन प्रत्येक विशिष्ट प्रयोग के लिए प्राप्त की है की सलाह देते हैं.
- Teflon ट्यूब की उचित कनेक्शन की जांच, ऊतक स्नान टयूबिंग में कोई भी तरल वर्तमान नाली, कक्षों DDH 2 हे के साथ तीन गुना अधिक या धोने और 20 ~ 25 मिलीलीटर 2.5 मिमी Ca 2 + Tyrode समाधान के साथ भरें. 2 Ca + ग्लूकोज और स्नान समाधान में प्रदान की जाती हैं झिल्ली अखंडता, इष्टतम Ca 2 SR + लोड हो रहा है, और एटीपी की मांसपेशी स्वयं के द्वारा पीढ़ी के लिए ऊर्जा का आसानी से उपलब्ध स्रोत बनाए रखने में मदद करने के लिए, के बाद से इन तैयारियों में mitochondria पूरी तरह कार्यात्मक रहते हैं.
- ऑक्सीजन की आपूर्ति की उचित कनेक्शन की जाँच करें, ऑक्सीजन टैंक खुला, और ऑक्सीजन का प्रवाह को समायोजित करने के लिए कक्ष की वाचाल और सजातीय बुदबुदाती प्रदान. ऑक्सीजन के स्तर को आसानी से सिकुड़ा बल बनाम समय के एक समारोह के रूप में निर्धारित किया जा सकता है. एक प्रवाह मीटर भी स्थापित किया जा सकता है, खासकर अगर शोधकर्ताओं hypoxia या hyperoxia के प्रभाव का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं. यदि मांसपेशियों hypoxic हो, बल स्वाभाविक रूप से कम हो जाती है. जबकि hyperoxia मांसपेशियों को भी नुकसान पहुंचा सकते हैं, लेकिन इसके प्रभाव कठिन हो सकता है का पता लगाने में किया जा सकता है क्योंकि ज्यादातर प्रयोगों कृत्रिम hyperoxic शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं एक सामान्य रक्त की मांसपेशियों को आपूर्ति के अभाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए हो सकता है. सबसे प्रणालियों में यह संभव है बस प्रत्येक लगातार चैम्बर के लिए ऑक्सीजन का प्रवाह को नियंत्रित करने के द्वारा ऑक्सीजन की एक ही राशि के साथ विभिन्न कक्षों बुलबुला.
- सभी चैनलों की संवेदनशीलता को समायोजित करने के लिए चैनल saturating बिना अधिक से अधिक बल समाधान सुनिश्चित करने के लिए. चैनल संवेदनशीलता में काफी भिन्नता है के रूप में कार्य कर सकते हैंजानवर की उम्र, प्रयोगात्मक तापमान, आनुवंशिक जोड़तोड़, मांसपेशियों का आकार, माउस तनाव, और प्रयोगकर्ता की क्षमता को ठीक के नुकसान की मांसपेशियों टुकड़े करना. हमारे अनुभव में, जब soleus सिकुड़ा बल मापने, 0.5 से 10 mV / सेमी संवेदनशीलता बदलता है, जबकि EDL के मामले में, संवेदनशीलता 1-20 mV / सेमी से भिन्न हो सकता है.
- थकाऊ उत्तेजना के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने की जरूरत है. मैक्रो Chart4 सॉफ्टवेयर में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक नया मैक्रो कार्यक्रम: Chart4 सॉफ्टवेयर में क्लिक करें, मापने शुरू, तो मैक्रो क्लिक करें, मैक्रो कमान, रिकॉर्डिंग शुरू, दोहराने शुरू करते हैं, वांछित प्रोत्साहन आवृत्ति का चयन, और फिर अंत दोहराने. एक संतुलन प्रोटोकॉल के लिए, 30 मिनट के लिए प्रोत्साहन हर मिनट दोहराया है और प्रोटोकॉल थकाऊ के लिए, उत्तेजना 5 मिनट के लिए हर 2 सेकंड दोहराया है. उत्तेजना की अवधि में ये परिवर्तन, सीधे कर्तव्य चक्र है, जो भी उत्तेजना की अवधि का एक समारोह है प्रभावित करते हैं. इन मानकों में अलग aspe का परीक्षण करने के लिए अलग किया जा सकता हैcts सिकुड़ना और fatigability के.
2. बरकरार स्नायु बंडल की तैयारी
- EDL विच्छेदन: माउस NIH दिशा निर्देशों और IACUC संस्थागत पशु प्रोटोकॉल का पालन बलिदान है. माउस ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान है. माउस तो पार्श्व स्थिति में व्यवस्था की है. EDL मांसपेशी तेजी से glycolytic पीला गुलाबी सफेद रंग के साथ एक मांसपेशी है. यह 10-13 के बारे में मिमी लंबा है और जंगली प्रकार C57BL / 6 माउस में 8-11 मिलीग्राम वजन का होता है. Edl के पैर की उंगलियों का विस्तार 2-5, और टखने में पैर dorso ठोके का कार्य किया है. यह peroneal तंत्रिका द्वारा innervated है. Edl के टुकड़े करना, एक सतही त्वचा चीरा बनाने के लिए और खोलें प्रावरणी पूर्वकाल tibialis और पीछे पेशी समूह के बीच में कटौती, और (समीपस्थ) मूल जहां बंधन पूर्वकाल टिबिया और बेहतर 3/4 के पार्श्व स्थूलक से जुड़ा है स्थानीय बनाना fibula (interosseous मार्जिन) की सतह. इस procedur, मांसपेशियों से नाजुक नेत्र के रूप में distally संभव कैंची के साथ बंधन कटई EDL की मांसपेशी के समीपस्थ मूल विज्ञप्ति. कुंद संदंश के साथ बंध पकड़ो और धीरे धीरे खींच edl का मुक्त. यह EDL आसपास EDL और अन्य मांसपेशियों के आसपास perimysium के कुछ, एक कदम है कि महत्वपूर्ण है के बाद से क्षति EDL की मांसपेशियों को इस नाजुक चरण के दौरान हो सकता है में कटौती करने के लिए आवश्यक हो सकता है. अगला, प्रविष्टि क्षेत्र है जहां चार डिस्टल tendons अंक 2-5 के मध्य और डिस्टल phalanges में सम्मिलित करने के लिए कदम. नाड़ी की मांसपेशियों से जहाँ तक संभव कट.
- एक विच्छेदन isotonic Tyrode समाधान युक्त डिश में अलग EDL मांसपेशी हस्तांतरण. कुछ उत्परिवर्ती, ट्रांसजेनिक, पीटा और पशु मॉडल बहुत ही कमजोर मांसपेशियों और 2 Ca के उपयोग + मुक्त Tyrode समाधान Ca 2 + प्रेरित सिकुड़ना मापन से पहले मांसपेशियों की क्षति को रोकने के लिए आवश्यक है. अगले, एक शल्य गाँठ का उपयोग करने के लिए संभव के रूप में पेशी से EDL की मांसपेशी के दोनों सिरों पर कसकर टाई के रूप में distally. एक अच्छा उपाय मध्य p थोड़ा ऊपर टाई हैबंधन या कण्डरा की लंबाई oint. इस प्रक्रिया के लिए 6-0 आकार सीवन का प्रयोग करें, और हे ऊतक दो संतृप्त स्नान कक्ष EDL मांसपेशी हस्तांतरण, बल transducer और स्नान के चैम्बर के तल पर स्टेशनरी हुक का नमूना नाली पर पेशी माउंट, दोहराने दूसरे चरण के लिए प्रक्रिया. हम भी करने के लिए एक नई विधि का उपयोग है कि clamps के बजाय sutures के साथ मांसपेशियों को धारण करने की शुरुआत कर रहे हैं. यदि प्रमुख लक्ष्य के लिए अध्ययन गतिज गुण और / या मांसपेशियों की शक्ति प्राप्त है, यह सिफारिश की है कि सीवन जितना संभव हो कम हो या सीवन एक धातु की छड़ के साथ प्रतिस्थापित किया.
- Soleus विच्छेदन: soleus ज्यादातर अमीर लाल रंग के साथ धीमी गति से oxidative मांसपेशी है. यह edl का ~ 1 मिमी की तुलना में कम है, लेकिन थोड़ा edl का अधिक से अधिक वजन का होता है. यह tibial तंत्रिका द्वारा innervated है और यह पदतल ठोके पैर की कार्रवाई करता है. Soleus टुकड़े करना, पैर के पीछे पार्श्व पक्ष का उपयोग करने के लिए, एक तरफ gastrocnemius मांसपेशी है कि सामान्य रूप से soleu शामिल धक्काहै, और गहरे लाल रंग के साथ मांसपेशियों की पहचान. (समीपस्थ) मूल में है, और पीछे बहिर्जंघिका की 1/3 समीपस्थ soleal लाइन के साथ पीछे टिबिया के समीपस्थ छमाही जोड़ने स्नायुबंधन में कटौती अगले प्रविष्टि (डिस्टल), केलकेनीयल पट्टा काटा कि पीछे में आवेषण कैल्केनीयस. ध्यान से soleus को मुक्त और ठीक से स्नान कक्ष में soleus मांसपेशी edl के लिए माउंट.
3. मापने पृथक कंकाल की मांसपेशियों का सिकुड़ना
- एक बार की मांसपेशियों को व्यक्तिगत ऊतक स्नान कक्षों में बढ़ रहे हैं, रिकॉर्डिंग शुरू. हाल इसी तरह प्रणाली बल रिकॉर्डिंग की आधारभूत का zeroing अनुमति देते हैं. इस समारोह में आमतौर पर एम्पलीफायर के साथ जुड़ा हुआ है, PowerLab प्रणाली के विशिष्ट मामले में पुल एम्पलीफायर के समारोह के रूप में. यह आधारभूत परिवर्तन के अवलोकन की सुविधा है और सभी मांसपेशी संकुचन के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है शून्य से विश्लेषण किया. पृथक मांसपेशियों को तो चुकता लहर दालों के साथ प्रेरित कर रहे हैंकि चैम्बर आकार के समारोह, प्लैटिनम तार मोटाई, तारों के बीच की दूरी, और भी प्रयोगात्मक समाधान की संरचना के रूप में व्यापक रूप से लेकर कर सकते हैं. हम 60 MA की वर्तमान कार्यरत है (हम उल्लेख किया है कि 350 मा ऊपर धाराओं मांसपेशियों की तैयारी के लिए हानिकारक हो सकता है लगता है) और stimulatory गाड़ियों के 350, 500, और 1000 एमएस, एक विशेष प्रोटोकॉल के लक्ष्यों पर निर्भर करता है. व्यक्तिगत वर्ग तरंग दालों की अवधि 0.3-1 से एमएस लेकर करना चाहिए.
- अगले कदम के लिए एक इनकार धनुस्तंभीय उत्तेजना उत्पादन करने में सक्षम उत्तेजना की एक आवृत्ति का चयन करने के लिए है (पूर्व: ~ 100 EDL और soleus मांसपेशी में ~ 60 हर्ट्ज मांसपेशियों में अधिक से अधिक बल के उत्पादन की अनुमति हर्ट्ज) जबकि धीरे से और ध्यान मांसपेशियों को खींच की पहचान करने के लिए इन मांसपेशियों की अधिकतम लंबाई. के रूप में की मांसपेशियों सावधानी से फैला रहे हैं, 30 एस के लिए इंतजार और 100 हर्ट्ज पर को प्रोत्साहित, 30 है इंतज़ार और फिर खिंचाव, और फिर इस मुद्दे पर जहां बल अब और वृद्धि नहीं करता जब तक उत्तेजना, दोहराएँ.
- इन मांसपेशियों undergon हैई वातावरण में महत्वपूर्ण परिवर्तन. यह सिफारिश की है कि मांसपेशियों नए वातावरण को अनुकूल करने के लिए अनुमति दी जा, हमारे प्रोटोकॉल में एक कदम "संतुलन" करार दिया. खींच चरण में 20-30 मिनट के लिए 100 हर्ट्ज के दौरान इस्तेमाल उत्तेजना के एक ही आवृत्ति पर इन मांसपेशियों संतुलन में लाना है जब तक कम से कम 5 लगातार धनुस्तंभीय संकुचन पूरी तरह से स्थिर हैं (को कम करने नहीं, बढ़ती, स्थिर आधारभूत). Stimulatory (100 हर्ट्ज, 500 MS अवधि, 1 ms व्यक्ति नाड़ी) गाड़ियों के संतुलन के दौरान की अवधि 1 मिनट, जो 1.66% की एक कर्तव्य चक्र बराबर एक उत्तेजना गैर थकाऊ है. इस संदर्भ में, 1.66% की एक कर्तव्य चक्र मतलब है कि कुल 100% की एक से अधिक, मांसपेशियों समय में 1.66% काम कर रहे हैं बढ़ती कर्तव्य चक्र की मांसपेशियों अंततः थकान के लिए प्रेरित किया जा सकता है. यदि स्वस्थ, जंगली प्रकार माउस के अन्यथा मांसपेशियों इस प्रतितोलन अवधि के दौरान एक थकाऊ प्रोफाइल दिखाने के लिए, यह संभव है कि वे विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त हो गए थे, hypoxia कक्षों / मांसपेशियों में होने वाली है, या अत्यधिक तत्वोंउत्तेजक इलेक्ट्रोड के माध्यम से ctrolysis मुक्त कण पैदा कर रहा है. Westerblad पहले सुझाव दिया गया है कि 400 MA से बड़ा धाराओं मुक्त 23 कण के गठन को प्रेरित करते हैं. जाहिर है, उच्चतम गुणवत्ता प्लैटिनम का सुझाव दिया है, क्योंकि अन्य धातुओं को निश्चित रूप से मुफ्त कट्टरपंथी गठन और मांसपेशियों विषाक्तता के लिए नेतृत्व करेंगे.
- निम्न उत्तेजना आवृत्तियों के साथ मांसपेशियों उत्तेजक द्वारा बल बनाम आवृत्ति संबंध (सीमांत बल) प्राप्त करना: 1-140 हर्ट्ज (5-10 हर्ट्ज की वेतन वृद्धि में), 30-60 एस के आवधिकता के साथ जब 25 डिग्री सेल्सियस में प्रयोगों प्रदर्शन जब 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगों प्रदर्शन, 300 हर्ट्ज के लिए अप करने के लिए उच्च डायाफ्राम मांसपेशियों के लिए, soleus के लिए 180-200 हर्ट्ज आवृत्तियों, और EDL के लिए 220-250 हर्ट्ज एफएफ का विस्तार. अगला, उत्तेजना की आवृत्ति है कि अधिक से अधिक धनुस्तंभीय बल (टी अधिकतम) और लगभग साढ़े अधिकतम धनुस्तंभीय बल (1/2 टी अधिकतम) उत्पन्न की पहचान है, कभी कभी यह मुश्किल है दोनों EDL और एकमात्र के लिए साढ़े सटीक टी अधिकतम प्राप्तहमें इन मांसपेशियों के बीच आंतरिक मतभेदों की वजह से अगर केवल एक उत्तेजक औधधि स्रोत का इस्तेमाल किया जा रहा है, मांसपेशियों. एक व्यवहार्य समाधान के लिए एक आवृत्ति है कि टी अधिकतम 30-70% का उत्पादन की पहचान है. उत्तेजना के इन आवृत्तियों के लिए तर्क यह है कि टी अधिकतम सिकुड़ा मशीनरी घटनाओं / मॉडुलन के महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है, जबकि आधा टी अधिकतम अधिक Ca 2 + विनियमन और ECC प्रक्रिया के लिए उचित जानकारी प्रदान करता है. निश्चित है कि अधिक से अधिक बल प्राप्त किया गया हो सकता है, 10-20 मिमी कैफीन स्नान समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है, जबकि मांसपेशियों उत्तेजक. यदि अधिक से अधिक बल पहुँच गया है, बल कैफीन की उपस्थिति में वृद्धि नहीं होगी. एफएफ सही करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है और सेना के उच्च प्रयोगात्मक तापमान पर थोड़ा अधिक हो जाते हैं. इस प्रणाली का उपयोग, किसी भी अन्य उत्तेजना आवृत्तियों वांछनीय अगर किया जा सकता है. एक तेजी से glycolytic EDL मांसपेशियों के विशिष्ट सिकुड़ा प्रोफाइल और एक धीमी गति से oxidative soleus मांसपेशी हैचित्रा 2 में दिखाया गया है.
- संतुलन के बाद, थकान 2 एस की उत्तेजना अंतराल और 25% कर्तव्य चक्र (चित्रा 3) के साथ 5 मिनट के लिए, आधा टी अधिकतम मांसपेशियों. इस विशिष्ट थकाऊ प्रोटोकॉल बेहतर sarcoplasmic जालिका मांसपेशी सिकुड़ना 31 के लिए 2 + रिहाई Ca के योगदान को प्रतिबिंबित करने के लिए माना जाता है.
- साढ़े टी अधिकतम 30 मिनट के लिए या जब तक बल स्थिर है 1 मिनट के अंतराल पर मांसपेशियों, ठीक हो. एक अतिरिक्त थकाऊ प्रोटोकॉल अब टी अधिकतम उत्तेजना, जो सिकुड़ा 31 मशीनरी की स्थिति को प्रतिबिंबित करने के लिए माना जाता है का उपयोग किया जा सकता है. एक अन्य विकल्प थकाऊ प्रोटोकॉल का विस्तार करने के लिए stimulatory गाड़ियों intercalate कि थकान के दौरान टी अधिकतम और आधा टी अधिकतम उत्पन्न और उत्तेजना के एक ही प्रकार के साथ मांसपेशियों को ठीक करने के लिए है.
- के रूप में 3.4 चरण में वर्णित एफएफ दोहराएँ औचित्य जा रहा है कि diff के बीच प्ररूपी मतभेदerent उपभेदों, रोग मॉडल, या दवा उपचार के पहले और बाद में थकान एफएफ का विश्लेषण करके देखा जा सकता है. हम उदाहरण के लिए पहले से सूचना दी है कि युवा जंगली प्रकार की मांसपेशियों की थकान के बाद एफएफ बाईं करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है, जबकि वृद्ध मांसपेशियों से मांसपेशियों में, यह सही करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है, उम्र बढ़ने के एक समारोह के रूप में कंकाल की मांसपेशियों की थकान के अंतर modulatory प्रभाव का सुझाव दे.
- कोशिकी 2 + मांसपेशी सिकुड़ना प्रविष्टि Ca के योगदान की जांच, स्नान समाधान एक कोई 2 Ca +, लेकिन 0.1 मिमी EGTA (0 मिमी Ca 2 + Tyrode समाधान) 32 युक्त समाधान में बदला जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, दुकान संचालित चैनल के विभिन्न ब्लॉकर्स स्नान समाधान में लागू किया जा सकता है. कुछ उदाहरण हैं: 2-aminoethyl diphenylborinate (2 APB), SKF96365, 3,5 - बीआईएस (trifluoromethyl) 2 pyrazole (BTP-2) और azumolene, आदि 33, 34. कैफीन ryanodine रिसेप्टर के समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और KCl करने के लिए समग्र आकलन किया जा सकता हैइन तैयारियों के विध्रुवण गुण. अन्य दवाओं को भी थकान के दौरान ना +, कश्मीर द्वारा बल की महत्वपूर्ण मॉडुलन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और ना +-K + 35 पंप. इन दवाओं में से अधिकांश अपेक्षाकृत छोटे आकार के है और इन मांसपेशियों तैयारी के रूप में उनके तत्काल प्रभाव के सबूत के लिए जल्दी में विसरित लगते हैं. किसी भी दवाओं से एक प्रभाव की कमी जरूरी है कि दवा अप्रभावी है और अतिरिक्त परीक्षण ज्यादा एक मांसपेशी फाइबर प्रयोगों में इस्तेमाल किया है कि तुलना में अधिक खुराक का उपयोग कर रहे हैं कभी कभी आवश्यक मतलब नहीं है.
- / - 4, 30 मांसपेशियों इस पूर्व vivo प्रणाली के एक अद्वितीय आवेदन tric एक मैकेनिक alternans की हाल ही में खोज करने के लिए नेतृत्व किया. Alternans थकाऊ प्रोफाइल की गिरावट के चरण के दौरान सिकुड़ा बल के अस्थिर फट एपिसोड के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. इन घटनाओं के दौरान सिकुड़ा बल क्षण भर के दौरान बल के अपने पिछले स्तर से ऊपर बढ़ा सकते हैंउत्तेजना थकाऊ क्योंकि कि या तो अधिक Ca 2 + जारी किया जा रहा है या सिकुड़ा मशीनरी अधिक 2 + Ca के प्रति संवेदनशील बन गया है. सिकुड़ा बल फैलने के लिए 50% अपने पिछले बल की तुलना में अधिक है और प्रकोप 5 मिनट थकान उत्तेजना की प्रक्रिया के दौरान कम से कम 10 बार देखा जाना चाहिए हो गया है. कंकाल की मांसपेशी में मैकेनिक alternans आम जंगली प्रकार चूहों से नहीं कर रहे हैं, लेकिन intracellular Ca 2 + संकेतन प्रक्रिया के trimeric Intracellular कटियन चैनल प्रकार (tric एक) के रूप में गड़बड़ी के साथ कुछ उत्परिवर्ती मांसपेशियों में देखा जा सकता है - मांसपेशियों / 4. मैकेनिक alternans थकाऊ stimulations के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है, कैफीन और cyclopiazonic एसिड (सीपीए) के साथ इलाज के इन यांत्रिक alternans के एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग के लिए देखें चित्रा 3. इस घटना की प्रकृति काफी पेचीदा है, जबकि एक मांसपेशी कि थकाऊ है क्षण भर के अधिक बल का उत्पादन करने में सक्षम लगता है. हमारे पिछले प्रकाशन में, एकल कक्ष 2 सीए के साथ संयोजन + विश्लेषण से पता चलता है कि alternans की उपस्थिति SR 2 + अधिभार और अस्थिर SR Ca का एक परिणाम है. हम मानते हैं कि alternans की एक गहरी समझ ECC प्रक्रिया का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
- प्रयोग के अंत में, लंबाई और व्यक्तिगत calibrated कैलीपर और विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग मांसपेशियों के वजन को मापने, फ्लैश तरल नाइट्रोजन में पेशी जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस, के बाद से जैव रासायनिक विश्लेषण इन मांसपेशियों में किया जा सकता है. इन मांसपेशियों को भी ECC प्रक्रिया की जांच विस्तृत यंत्रवत् चमड़ी हो सकता है, या ECC नियामक तंत्र के अभाव में आवश्यक सिकुड़ा गुण का निर्धारण करने के लिए रासायनिक चमड़ी.
- रिकॉर्ड मांसपेशी बल (mV) 1 ग्राम मजबूर अंशांकन परिणाम के आधार पर परिवर्तित किया जाता है और फिर normalized शारीरिक पार के अनुभागीय क्षेत्र (PCSA) निम्न सूत्र का उपयोग करने के लिए: मांसपेशी बल (एन / 2 सेमी) = (बल (छ) मांसपेशी x lengtज (सेमी) x 1.06) / (मांसपेशी वजन (छ) ०.००,९८१ x) 5,36. वैकल्पिक रूप से, मांसपेशियों बल कुल प्रोटीन या व्यक्ति ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख / Commossie नीले धुंधला हो मात्रा का ठहराव का उपयोग मांसपेशियों की कुल actin सामग्री सामान्यीकृत जा सकता है. कुछ शर्तों के तहत मांसपेशियों जबकि गंभीर रोगों, बुढ़ापा, दवा उपचार, बल सामान्यीकरण मांसपेशियों, प्रोटीन और / या actin सामग्री के आधार पर एक अधिक स्थिर readout प्रदान कर सकते हैं की वजह से प्रभावित हो सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
EDL और soleus ठेठ कमरे के तापमान सिकुड़ा बलों कम, मध्यवर्ती और उच्च आवृत्ति उत्तेजनाओं के जवाब चित्रा 2 में दिखाया जाता है. EDL हर्ट्ज 5 प्रोत्साहन से प्रेरित संकुचन व्यक्ति का SERCA 2 Ca एक ATPase + और आंतरिक Ca 2 + सिकुड़ा मशीनरी की संवेदनशीलता के गुण है, जबकि 5 हर्ट्ज द्वारा soleus संकुचन (धीमी ATPase फ्यूज शुरू तेजी से कार्रवाई करने के लिए कारण twitches के रूप में बनी हुई हैघ उच्च सीए करने के लिए संवेदनशीलता सिकुड़ा मशीनरी के 2 +), लेकिन शिखर बलों अभी भी अलग हैं. 20 हर्ट्ज उत्तेजना, EDL जबकि आंशिक रूप से संकुचन कि soleus की एक पूरी तरह से में जुड़े हुए धनुस्तंभीय बल रूपों में जुड़े हुए हैं. उत्तेजना की आवृत्ति है कि टी अधिकतम उत्तेजना, विख्यात रहे हैं जो कमरे के तापमान में soleus लिए EDL और 60-90 हर्ट्ज के लिए 80-110 हर्ट्ज, तेजी शिरोरेखा और EDL में धनुस्तंभीय बल के तेजी से छूट से भिन्न हो सकते हैं, जो विपरीत है उत्पादन soleus मांसपेशी की धीमी चित्रा 2B विशेषताओं को दर्शाता है कि बल आवृत्ति EDL मांसपेशी की वक्र सही करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है के रूप में soleus मांसपेशी की तुलना में, यह दर्शाता है कि soleus मांसपेशियों को और अधिक किसी भी आवृत्ति पर Ca 2 + रिलीज करने के लिए संवेदनशील हैं धीमी मायोसिन और troponin isoforms की उपस्थिति के कारण उत्तेजना. इसके अलावा, सिकुड़ा मशीनरी soleus मांसपेशी में कम आवृत्तियों पर सापेक्ष अधिक बल के साथ जवाब चित्रा 3 शोEDL (ऊपरी पैनल) और soleus मांसपेशी (मध्यम पैनल) के एक सामान्य थकान प्रोफाइल. सिकुड़ा बल में थकाऊ उत्तेजना के तहत तेजी से और EDL मांसपेशी में 5 मिनट थकान प्रोटोकॉल के अंत में बल में उच्च कमी गिरावट नोट. अंत में, एक ठेठ एक उत्परिवर्ती मांसपेशी के यांत्रिक alternan प्रोफाइल चित्रा 3 (कम पैनल), है जो क्षणिक बल फैलने के रूप में मांसपेशियों की थकान प्रोफ़ाइल के चरण के दौरान गिरावट में परिभाषित किया गया था में दिखाया गया था. सिकुड़ा बल फैलने के लिए 50% अपने पिछले बल की तुलना में अधिक है और प्रकोप 5 मिनट थकान उत्तेजना की प्रक्रिया के दौरान कम से कम 10 बार देखा जाना चाहिए हो गया है.
चित्रा 1. एक 4 चैनल पूर्व vivo सिकुड़ना प्रणाली के योजनाबद्ध ड्राइंग स्क्वायर लहर दालों. एक एक घास उत्तेजक औधधि नियंत्रित कंप्यूटर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. दो उत्तेजना अलगाव इकाइयों चुनाव से प्रारंभिक प्रोत्साहन फिल्टरtrical उत्तेजक औधधि यूनिट बिजली के संकेत में कोई उतार - चढ़ाव को दूर करने के लिए और एक स्थिर वर्ग तरंग संकेत स्थापित. यह फ़िल्टर्ड बिजली के संकेत 4 स्नान प्लैटिनम तार प्रत्येक पृथक मांसपेशी आसपास इलेक्ट्रोड युक्त कक्ष में भेजा जाता है. अंततः, यह दो इलेक्ट्रोड (क्षेत्र उत्तेजना कहा जाता है), कि एक कार्रवाई क्षमता उत्पन्न मांसपेशियों के संकुचन उत्प्रेरण भर में वर्तमान है. इस संकुचन एक विशिष्ट बल transducers, पुल एम्पलीफायरों प्रेषित ने पता लगाया है, फ़िल्टर, (संकेत कंडीशनिंग) औसत और एक ए / डी कनवर्टर के माध्यम से कंप्यूटर सॉफ्टवेयर द्वारा दर्ज की गई.
चित्रा 2. EDL और soleus प्रतिनिधि सिकुड़ा बलों (ए) सिकुड़ा बलों 5 (ऊपरी पैनल) हर्ट्ज, 20 (मध्य पैनल) हर्ट्ज और अधिक से अधिक धनुस्तंभीय बल (टी अधिकतम) (कम पैनल) द्वारा प्रेरित, इनलेट एक एक के सिकुड़ा बल का निशान से पता चलता है मांसपेशी क्षतिग्रस्त, (ख)प्रतिनिधि बल बनाम आवृत्ति संबंध में EDL (एफएफ, ऊपरी पैनल) प्लॉट किए जाते है और एफएफ (कम पैनल) से उत्पन्न वक्र के व्यक्तिगत संकुचन दिखा सेट बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. प्रतिनिधि प्रोफाइल और यांत्रिक alternans थकाऊ एक ठेठ EDL (ऊपरी पैनल) मांसपेशियों और धीमी गति से गिरावट थकाऊ soleus मांसपेशी (मध्यम पैनल) की प्रोफाइल के तेजी से गिरावट थकाऊ प्रोफाइल. उत्तेजना थकाऊ यांत्रिक alternans की उपस्थिति की ओर जाता है एक tric एक - / - परेशान Ca 2 + से निपटने के गुण (कम पैनल) के साथ मांसपेशियों.
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Discussion
सिकुड़ा बल और fatigability मापन के कंकाल की मांसपेशी समारोह के समग्र मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है. इस परख के प्रमुख उद्देश्य मांसपेशियों की ताकत में परिवर्तन और कुछ रोग शर्तों के तहत थकाऊ गुण sarcopenia और मांसपेशियों में थकान के रूप में पहचान है, और मांसपेशी सिकुड़ना पर दवाओं / अभिकर्मकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए है. चूंकि मांसपेशी बल intracellular Ca 2 के साथ मिलकर संबंधित है, हम + रिलीज, कोशिकी Ca 2 + प्रविष्टि और इन दोनों के बीच crosstalk भी 2 Ca पर जानकारी + कंकाल की मांसपेशी में संकेत स्थिति इस पद्धति का उपयोग करके इकट्ठा कर सकते हैं. यहाँ हम एक अद्वितीय phenotype करार दिया "मैकेनिक alternans" है जब थकाऊ प्रोफाइल की गिरावट के चरण के दौरान सिकुड़ा बल के अस्थिर फट एपिसोड एक अतिभारित और अस्थिर SR के तहत देखा गया था दिखाया. एक की उम्मीद कर सकता है कि कंकाल की मांसपेशी phenotypes का एक बदल बल, एफएफ, fatigability, सिकुड़ा कैनेटीक्स और वसूली अब सहित विभिन्न प्रकारथकान के बाद ility विभिन्न रोग शर्तों के तहत इन विट्रो सिकुड़ना परख में का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है.
इस परख के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम पूरी बरकरार (या मांसपेशी बंडलों और मांसपेशियों स्ट्रिप्स) मांसपेशियों कि नुकसान से मुक्त हैं अलग है. इस तरह के एक लक्ष्य पूरे मांसपेशी तैयारी में प्राप्त किया जा आसान है. यहाँ हम दिखाना है कि पर्याप्त स्नायुबंधन और tendons पूरे मांसपेशियों को टाई करने के लिए जा रहा है बहुत महत्वपूर्ण है मांसपेशी ही है, जो मांसपेशियों की क्षति और अंततः मांसपेशी मौत की ओर जाता है बांधने को रोकने. इसके अलावा, HEPES आधारित बिकारबोनिट आधारित समाधान के लिए या 2 हे और सीओ 2 के एक मिश्रण समाधान के मामले में या तो 100% 2 हे के साथ समाधान की लगातार बुदबुदाती महत्वपूर्ण है. Hypoxia और hyperoxia रोकथाम के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि एक प्रवाह मीटर इस्तेमाल किया जा सकता है. हम भी निश्चित स्थिति में एक विशेष उपकरण है कि ऊतक स्नान तरल पदार्थ में भंग ऑक्सीजन उपाय का इस्तेमाल किया. कुछ शर्तों के तहत जहां मांसपेशियों mor रहे हैंनुकसान होने का खतरा ई, एक Ca 2 + बल transducer पर बढ़ते पहले समाधान मुक्त में अलग मांसपेशियों से निपटने के लिए पेशी आराम और प्रयोग से पहले मांसपेशियों की क्षति को कम करने में मदद मिलेगी. 2,3 जैसे ड्रग्स - butanedione (BDM) monoxime या N-लोबान-P-टोल्यूनि sulphonamide (BTS) भी विच्छेदन के दौरान जोड़ा जा सकता है क्षति को कम करने के लिए, खासकर अगर मांसपेशी बंडलों या मांसपेशी स्ट्रिप्स के लिए तैयार कर रहे हैं, जो सिकुड़ना अध्ययन के लिए आम है डायाफ्राम 38 37, के. रिकॉर्डिंग के दौरान, क्षतिग्रस्त तैयारी आम तौर पर कम बल को उत्पन्न करते हैं और आधारभूत शोर और उतार चढ़ाव वृद्धि (चित्रा 2 की इनलेट देखें), और इन मांसपेशियों से परिणाम विश्लेषण डाटासेट से बाहर रखा जा सकता है, जब तक यह क्षतिग्रस्त की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग का हिस्सा है मांसपेशियों. एक और मुद्दा यह है कि आसानी से हो सकता है या नजरअंदाज कर सकते हैं भूल यह है कि बिजली की उत्तेजना ही मांसपेशियों के लिए विषाक्तता का एक स्रोत हो सकता है. हम समय - समय पर इलेक्ट्रोड और chamb सफाई की सिफारिश1% hypochlorite समाधान के साथ किसी भी contaminates, प्रोटीन, मलबे ऑक्सीकरण संचय आदि विशेष चेतावनी देते हटाने एर भी जब घुड़सवार मांसपेशी की लंबाई का समायोजन आवश्यक हैं. यह महत्वपूर्ण है कि छोटे चरणों में खिंचाव पतले और मोटे filaments का इष्टतम संरेखण पर खींच से बचने के लिए एक कुशल पार पुल 39 कामकाज के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, यह भी सिफारिश की है कि क्षेत्र उत्तेजना इलेक्ट्रोड के लिए मुहिम शुरू की मांसपेशी बंडलों के रिश्तेदार की स्थिति को स्थिर रखा है और सभी चैनलों के बीच गठबंधन है कि मौजूदा बिजली बराबर राशि सुनिश्चित पृथक मांसपेशियों के लिए लागू होता है. हमारे प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, युवा जंगली प्रकार चूहों से मांसपेशियों के 12 से अधिक घंटे के लिए स्थिर रहेगा और अब भी अगर एंटीबायोटिक दवाओं, और 0.2% FBS, और एमिनो एसिड स्नान समाधान करने के लिए जोड़ रहे हैं.
देखभाल और उचित नियंत्रण के साथ, इस पूर्व vivo प्रणाली Ca 2 के बीच संबंध पर जानकारी प्रदान + एक संकेत हो सकताvasculature, endocrine, और नर्वस सिस्टम की जटिलता के बिना मांसपेशी संकुचन. उदाहरण के लिए, कोशिकी Ca 2 पर निर्भरता के नुकसान + वृद्ध कंकाल की मांसपेशी का एक हस्ताक्षर है जबकि SR 2 Ca + रिहाई शिथिलता आमतौर पर कम सिकुड़ा बल और तेजी से थकाऊ प्रोफाइल पैदावार. / - के रूप में यहाँ exampled, यांत्रिक alternans की उपस्थिति अस्थिर एसआर, जो हमें विश्वास है कि tric एक तक ही सीमित नहीं है इंगित करता है मांसपेशियों, लेकिन रोग SR Ca 2 + अधिभार और अस्थिरता पैदा करने की शर्तों के तहत नहीं बल्कि अन्य कंकाल की मांसपेशियों में भी. इस सेटअप विभिन्न शारीरिक और औषधीय जोड़तोड़ के लिए मांसपेशियों के प्रत्यक्ष उपयोग की अनुमति देता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम - अहा 10SDG2630086 SDG Brotto एम. झाओ एक्स, मा जम्मू और जाओ अनुदान RC2AR05896 RO1 AR061385 समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-APB | Tocris | 1224 | Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc. |
| SKF96365 | Sigma | SKF-96365 | Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc. |
| BTP-2 | Millipore | 203890-5MG | Relatively specific SOC blocker |
| CPA | Sigma | C1530 | Reversible SERCA blocker |
| caffeine | Sigma | C0750 | Fast action RyR agonist |
| Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System | Radnoti | 159920 | |
| Combination Tissue Support/Stimulating Electrode | Radnoti | 160151 | Vertical Zig Zag Type with tissue support |
| Quad Bridge Amp | ADInstruments | FE224 | |
| PowerLab/400 | ADInstruments | This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system. | |
| Force Transducers (5 mg - 25 g) | ADInstruments | MLT0201/RAD | |
| Chart v4.02 | ADInstruments | LabChart 7.3 is the latest version of Chart software. | |
| S8800 Dual Pulse Digital Stimulator | GRASS TECHNOLOGIES | This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator. | |
| RF Transformer Isolation Unit | GRASS TECHNOLOGIES | Model SIU5 |
References
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