Summary
우리는 직접의 근육 힘, 근육 힘, 수축성 속도론 및 절연 골격 근육의 fatigability를 측정하는 방법을 설명
Abstract
여기에 설명하는 것은 분리 된 골격 근육의 수축성을 측정 할 수있는 방법입니다. 이러한 근육 힘, 근육 전력, 수축성 속도론, fatigability, 그리고 피로 후 복구와 같은 매개 변수가 같은 흥분으로 여기 - 수축 결합의 특정 측면 (ECC) 프로세스, 수축성 기계 및 칼슘 2 + 처리 능력을 평가하기 위해 얻을 수 있습니다. 이 방법은 신경과 혈액 공급을 제거하고 격리 골격근 자체에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 정기적으로 변조 칼슘 2 + 신호 경로 불구하고 골격 근육의 수축 속성을 변경 유전자 구성 요소를 식별하는 데이 방법을 사용합니다. 여기, 우리는 체외 근육 수축성 분석에 사용 얻을 수 다양하고 풍부한 정보의 예로서 새로 확인 된 골격 근육 표현형, 즉 메카닉 alternans를 설명합니다. 단일 셀 assays, 유전자 접근 방식과 biochemi와 함께 검정의 조합stry의 assays는 골격근의 ECC의 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
골격 근육은 중추 신경계의 통제하에 수축성 힘을 뼈대의 뼈에 연결하고 생성합니다. 여기 - 수축 결합 (ECC)는 기계 응답에 전기 자극으로 변환하는 과정을 말합니다. 칼슘 2 + 신호는 골격근의 수축 기능의 필수 구성 요소입니다. 효과적인 칼슘 2 근 소포체 (SR)에서 + 동원은 중요한 근육 세포 1, 2에서 ECC를위한 구성 요소와 세포 칼슘이의 변화 + 신호는 근육 질환 3-5의 숫자에 해당 수축 기능 장애를 기초입니다. 근육 수축성의 적절한 평가는 + 이미지와 다른 assays가 아니라 수축성 수준에서, 골격근 기능에 통찰력을 얻을뿐만 아니라, 운동 수준에하는 것이 필수적 및 CA 2 무료로 제공됩니다. 힘과 속도도의 중요한 속성을 알려 구할 수 있습니다다른 생리학 및 pathophysiological 조건 하에서 근육 전력 및 ECC 프로세스의 상태를 표시합니다.
연구의이 다산의 필드는 매우 풍부한 역사를 가지고 있으며 근육 수축의 많은 이론은 두 천년 6으로 나타났다. 현대 근육 연구는 아마도 레벤후크 6 근육 섬유의 크로스 - 강선과 myofibrils의 현미경 관찰과 1674년에서 1682년까지에서 시작됩니다. 의 신경이 먼 전기 기계 7-9에서 스파크 방전시 메스와 접촉 할 때 거의 100 년 후, 루이지 Galvani는 개구리 근육 계약을 힘차게 그 관찰했다. 수축은 금속 전도체를 통해 근육에 다리 신경을 연결하여 생산 될 수 있습니다. Galvani에 의해지지 복잡한 전기 신호 메커니즘의 세부 사항은 결국 전기 생리학의 기초가되었다 자신의 유명한 방정식 10, 11 호 지킨, 헉슬리와 카츠에 의해 공식화되었다. 린의 놀라운 관찰GER은 + 개구리 심장과 골격 근육 12-15의 수축성에 대한 세포 칼슘 (2)의 효과에 칼슘 2 인식의 첫 번째 주요 단계 + 근육 수축성 16, 17의 핵심 레귤레이터로를 나타냅니다. 1980 년대부터 현재에 이르기까지 근육 수축성 필드에 발견 버스트 인해 근육 수축성과 손쥐 골격근 18 fatigability 프로토콜의 도입으로 실현되었다. 존스와 에드워즈는 19이 ECC 기계의 변화와하지 수축성 장치와 연결되었다고 저주파 간헐적 인 피로 (힘의 운동 유발 성 감소)를 제안하는 첫번째이었다. 동안 후반 1980 년대와 초기 1990 년대에 Kolkeck 외 20 Kolbeck 및 Nosek 21,와 리드 (22)는, 골격 근육 수축성에 theophyllines, cortiosterone, 무료 래디칼의 효과를 연구하기 위해 쥐 모델에서 격막 근육을 사용했다 브룩스 Faulkn어 쥐 22 빠른 및 느린 근육의 반복 힘 및 전력 측정의 측정에보고 처음이었다. 또한, Lannegren, Westerblad, 양고기, 그리고 Westerblad 직접 세포 칼슘 2 + 규제로 전직 생체의 수축성을 연결하는 첫 번째 있었고, 근육의 피로 23, 24의 산증의 역할에 의문을 제기 시작했다.
우리 실험실이 크게 손상 마우스 근육 수축성 연구의 조합을 사용하여 초기 2000 년대 소설 유전자의 이해에 대한 modulatory 및 규제 역할과 근육 ECC에서 근육 수축성, fatigability, 그리고 노화에 중요한 역할과 이후 공헌 세포 칼슘 2 + 모니터링에있다 온전하고 피부 근육 섬유와 분자 - 유전자 조작 3-5, 25-29.
여기 손쥐 절연 soleus과 신근 digitorum longus의의 측정 수축성 (ED에 대한 실험 프로토콜을 설명에 해당하는 L) 근육, 대부분 느린 산화 (타입 I과 IIA 근육 섬유)와 별개의 수축 특성을 가진 대부분 빠른 속도로 glyocolytic 근육 (타입 IIB와 IIx 근육 섬유).에게 이 프로토콜에서 그대로 근육 힘줄이 단지는 격리 된 순수 산소 또는 산소의 혼합 (95 %)과 CO 2 (5 %) 중 함께 제공 ADI PowerLab Radnotti 챔버 시스템에 목욕. 수축성 힘은 잔디 stimulator에서 전기 stimulations에 의해 생성 및 매크로 루틴의 정의는 데이터의 수집, 수집, 디지털화, 스토리지를 제어 할 수 있습니다 ADI PowerLab/400 시스템과 통합 된 힘 변환기를 사용하여 감지되었습니다. 이 설정은 근육 힘, 근육 전원뿐만 아니라 힘이 대 주파수 관계, 근육 피로, 근육 피로, 속도, 근육 수축의 전체 운동 속성의 복구를 측정 할 수 있습니다. 또한, 근육 수축에 마약의 효과는이 실험을 통해 모니터링 할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 근육을 계약의 본질적인 속성의 직접 평가를 수 있도록 골격 근육에서 떨어져 neuronal과 혈관 구성 요소를 제거에 누워. 또한, 전 생체의 수축성의 assays는 다양한 이온 투과 채널과 수송의 약리 조작 골격근 기능을 위해 생리적 역할을 정의하기 위해 사용을 가능하게 고립 된 근육을 둘러싸고있는 세포 환경의 조작을 할 수 있습니다.
이 예 생체 시스템은 우리가 최근에 변경된 세포 칼슘 2로 연결 한 특정 돌연변이 근육 준비에 뚜렷한 alternan의 행동 + 등록 할 4 취급을 발견 할 수있다. Alternans은 피곤하게하는 프로필의 감소 단계에서 수축성 힘의 변동 버스트 에피소드로 정의됩니다. 이 이벤트에는 수축성 힘이 순간적으로 힘 D의 이전 수준보다 증가더 많은 칼슘 2 + 출시되고 또는 수축성 기계는 칼슘 2 + 30 더 민감되었다 어느 아마도 때문에 피곤하게하는의 자극을 uring. cyclopiazonic 산 (CPA), 근 - endoplasmic 소포체 칼슘 ATPase (SERCA), 카페인, ryanodine 채널 (RyR)의 작용제의 회복 차단의 치료와 stimulations를 피곤하게하는 반복이 모든 것을 alternans 직접 관련된 제안, 기계 alternans에게 4 일으킬 수 EC 커플 링 프로세스의 변조. 체외 수축성 설정에서의 메카닉 alternans를 유도하고 기록 할 수있는 방법의 시연은 개별 연구 관심 분야에 따라이 시스템 또는 유사한 것들로 획득 할 수 다양한 실험 매개 변수를 표시 할 수있는 예제로 제공하고 있습니다.
이 방법은 근육 생리학을 공부 연구자에 관심이있을 것으로 생각됩니다. 비슷한 설정은 다른에서 격리 된 골격 muscle-tendon/ligament 단지 사용할 수 있습니다해부학 적 위치,뿐만 아니라 단일 섬유와 근육 스트립에 있습니다.
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Protocol
솔루션 구성 :
2.5 MM 칼슘 2 + Tyrode 용액 : 140 MM NaCl, 5 MM KCl, 10 MM의 HEPES, 2.5 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 10 MM 포도당
0 MM 칼슘 2 + Tyrode 용액 : 140 MM NaCl, 5 MM KCl, 10 MM의 HEPES, 2 MM MgCl 2, 0.1 MM의 에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA), 10 MM 포도당
참고 : 입욕 솔루션은 위의 솔루션을 사용하는 경우하지만, 5 % CO 2 95% O이 100 % O 2 포화해야 산도를 일정하게 유지하기 위해 탄산 수소 기반의 버퍼를 사용하는 경우. 2.5 MM 칼슘 2 + 칼슘 2의 수준을 요점을 되풀이하는 목욕 버퍼에 추가됩니다 + 세포 공간에서 발견 미토콘드리아가 여전히 지속적으로 포도당의 존재에 ATP를 생성하기 위해이 근육에 작동 이후 10 MM 포도당이 중요합니다.
1. 사용 설정 업 예 VIVO의 수축성 실험ADI PowerLab 시스템
- 4 채널 전 생체의 수축성 시스템의 개략적 인 도면은 그림 1에 표시됩니다. 컴퓨터는 각각의 분리 된 근육 힘줄 단지 주변 백금 와이어의 쌍을 도달하는 절연 장치에 의해 필터링되는 사각 파 펄스를 생성 할 수있는 stimulator를 제어합니다. 이것은 또한 현장 자극이라고합니다. 자극에 응답 근육의 수축은 힘 변환기, 증폭 필터링 및 A / D 컨버터 (신호 컨디셔닝)에 의해 컴퓨터로 다시 전송 한에서 생성 된 신호에 의해 감지되었습니다. 신호는 다음 디지털화되어 나중에 분석을 위해 저장 될 수도 있습니다.
- 컴퓨터에서 다음 전직 생체의 수축성 실험, 현장 stimulator 첫 번째 턴, A / D 컨버터 (이 경우 ADI 전력 연구소) 또는 이와 유사한 소프트웨어 (예를 들어, LabView)를 준비합니다.
- Chart4 소프트웨어 (또는 시스템과 그 호환 다른 소프트웨어 버전)와 initiat를 엽니 다EA 4 채널 작업, 소프트웨어와 하드웨어의 적절한 의사 소통은 하드웨어의 구성을 시작으로 표시하고, 소프트웨어에 START 버튼 (라이브) 운영이 될, 4 채널 기능에서 근육의 한 쌍의 동시 측정을 할 수 있습니다 야생 유형과 돌연변이 마우스, 또는 2 편집 판단리스트와 같은 마우스에서 2 soleus 근육, 그리고 그것은 같은 격막 (전체 다이어프램, 헤미 - 격막, 또는 격막 근육 스트립)와 앞 tibialis 등의 근육을 사용할 수 있습니다; 또한 하나가 쥐의 근육을 사용하는 경우 특히 심장 근육 준비와 근육의 번들에 사용하실 수 있습니다. 근육 번들이 때문에 더 나은 선택이 될 것입니다 수 있도록이 경우 근육의 크기가 산소 확산을 제한 할 수 있습니다. 그러나 전문가 분해 기술은 근육 번들 준비가 필요합니다.
- 힘 변환기의 보정 :이 다른 채널에서 서로 다른 시간에 생성 된 데이터 세트의 comparability을 보장하는 것입니다. 첫 시작 녹음, sequentia베드로 힘 변환기의 샘플 숲에 1 g, 2 g 및 5-g의 무게를 두지, 녹음을 중단, Chart4 소프트웨어의 각 채널에 표시되는 뮤직 비디오에서 해당 변경 사항을 계산 선형성을 확인 ΔmV와 무게를 짜고 뮤직 비디오와 힘 그램 사이의 변환 계수를 결정합니다. 우리는 특정 보정은 각 특정 실험을 얻은 것을 보장하기 위해 처음부터 또는 각 실험의 끝에서 중 다음 교정을 수행하는 것이 좋습니다.
- 조직 목욕 튜브에 액체 선물을 배출, 테플론 튜브의 적절한 연결을 확인 ddH 2 O와 함께 방을 세 번 이상 씻어 20 ~ 25 ML 2.5 MM 칼슘 2 + Tyrode 솔루션을 작성하십시오. 칼슘 2 + 미토콘드리아이 준비에 모든 기능을 유지 않았고, 포도당은 멤브레인 무결성, SR 최적의 칼슘 2 +로드 및 근육 자체가 ATP의 생성을위한 에너지의 즉시 사용할 수 소스를 유지하기 위해 목욕 솔루션에서 제공하는.
- , 산소 공급 장치의 적절한 연결을 확인하십시오 산소 탱크를 열고 챔버의 잘 퍼지는하고 균일 한 버블 링을 제공하기 위해 산소의 흐름을 조정합니다. 산소 수준은 쉽게 수축성 힘 대 시간의 함수로 결정 할 수 있습니다. 연구자는 hypoxia 또는 hyperoxia의 효과를 공부에 관심이 특히 유량계도 설치 될 수 있습니다. 근육 hypoxic 될 경우, 힘이 자연스럽게 줄어 듭니다. hyperoxia는 근육을 손상시킬 수 있지만, 대부분의 실험에서 근육에 정상적인 혈액 공급의 부재에 대한 보상 인공 hyperoxic 조건에서 수행되기 때문에 그 효과는 감지하기 위해 더 열심히 일 수도 있지만. 대부분의 시스템에서는 거품이 단순히 일정한 각 챔버에 산소의 흐름을 제어하여 산소 같은 양의 다른 챔버를 할 수 있습니다.
- 포화 채널을없이 최대 힘 해상도를 보장하기 위해 모든 채널의 감도를 조정합니다. 채널 감도는이 기능으로 상당히 다를 수 있습니다동물의 d 개의 나이, 실험 온도, 유전자 조작, 근육의 크기, 마우스 변형, 그리고 적절하게 손해를 무료로 근육을 해부하는 실험의 능력. 우리의 경험에서, soleus 수축의 힘을 측정 할 때 감도는, 0.5에서 10 MV / cm에 따라 다릅니다 편집 판단리스트의 경우 한편, 감도가 1-20 MV / cm까지 다양 수 있습니다.
- 피곤하게하는 자극에 대한 프로토콜을 설립해야합니다. Chart4 소프트웨어에서 매크로를 사용할 수 있습니다. 새로운 매크로를 프로그램하려면 Chart4 소프트웨어, 측정을 시작합니다 클릭 한 다음 종료를 반복 한 다음 매크로를 클릭 매크로 명령, 녹음을 시작, 반복 시작, 원하는 자극 주파수를 선택합니다. 평균 프로토콜의 경우, 자극이 30 분에 분마다 반복하고 프로토콜을 피곤하게하는 동안 자극은 5 분 동안 매 2 초를 반복합니다. 자극의 주기성의 이러한 변화는 직접 또한 자극 기간의 함수 듀티 사이클을 영향을 미칩니다. 이 매개 변수는 다른 aspe을 테스트 변할 수수축성과 fatigability의 CTS.
2. 그대로 근육 번들을 준비
- 편집 판단리스트 해부 : 마우스가 NIH 가이드 라인 및 IACUC 기관 동물의 프로토콜에 따라 희생된다. 마우스는 자궁 경부 전위에 의해 희생된다. 마우스는 다음 측면 위치에 배치된다. 편집 판단리스트 근육은 창백 핑크 화이트 색상으로 빠른 속도로 glycolytic 근육입니다. 그것은 10-13에 대한 mm 길이 및 야생 유형 C57BL / 6 마우스에 8-11 밀리그램 무게. 편집 판단리스트는 발가락에게 2-5 확장하고, 발목에서 발을 dorso-flexing의 기능이 있습니다. 그것은 peroneal 신경에 의해 innervated입니다. 편집 판단리스트를 해부하기 위해 겉 피부 절개를하고 앞 tibialis과 뒤쪽 근육 그룹 사이의 근막을 잘라, 그리고 인대는 앞의 경골과 4분의 3 상사의 측면 뼈 관절 돌기에 연결되어있는 원점을 (근위) 지역화 비골의 표면 (뼈 여백). 이 procedur, 근육의 섬세한 안과 가위로 distally 가능한과 인대를 잘라e는 편집 판단리스트 근육의 근위 기원을 출시. 무딘 집게와 인대를 잡고 편집 판단리스트를 확보하기 위해 천천히 당긴다. 은 편집 판단리스트 주변의 편집 판단리스트와 다른 근육을 둘러싸고있는 perimysium의 일부, 손상이 섬세한 단계에서 편집 판단리스트 근육에 발생할 수 있기 때문에 중요합니다 단계를 절단 할 필요가 있습니다. 다음 네 개의 말초 힘줄이 자리 2-5의 중간 및 말초 지골에 삽입 삽입 영역으로 이동합니다. 근육에서까지 가능한 힘줄을 잘라 요.
- 등장 Tyrode 솔루션을 포함하는 분해 그릇에 절연 편집 판단리스트 근육을 전송합니다. 일부 돌연변이 유전자 변형하고, 한방 동물 모델은 매우 약한 근육과 + 무료 Tyrode 솔루션은 칼슘이 수축성 측정하기 전에 + - 유도 근육 손상을 방지 할 필요가 카 (2)의 활용을 갖추고 있습니다. 다음 가능한 한 근육에서와 같은 distally 편집 판단리스트 근육의 양쪽 끝에 단단히 연결하는 수술 매듭을 사용합니다. 좋은 방법은 약간 중간 P 위에 묶어하는 것입니다길이 인대 또는 힘줄의 oint. 이 절차에 대한 6-0 크기의 봉합을 사용하고, O 2 - 포화 조직 목욕 챔버에 편집 판단리스트 근육을 전송 힘 변환기와 목욕 챔버의 하단에있는 문방구 후크의 샘플 홈에 근육을 장착,를 반복 다른 쪽 다리를위한 과정입니다. 우리는 또한 클램프 대신 봉합과 근육을 유지하는 새로운 방법을 사용하기 시작합니다. 주요 목표는 운동 특성 및 / 공부하거나 근육을 취득하는 경우에는 봉합이 가능한 짧게하는 것이 좋습니다 또는 봉합은 금속 막대로 대체.
- Soleus 해부 : soleus이 풍부한 붉은 색과 주로 천천히 산화 근육입니다. 은 편집 판단리스트보다 ~ 1mm 짧은하지만 편집 판단리스트보다 약간 더 무겁 죠. 그것은 정강 신경에 의해 innervated 있으며 발바닥 flexing 발 작업을 수행합니다. soleus을 해부하기 위해 다리의 뒤쪽 측면에 액세스 일반적으로 soleu을 커버 gastrocnemius 근육을 옆으로 밀어초,과 어두운 붉은 색으로 근육을 식별합니다. 원점에서 (근위), soleal 라인과 뒤쪽 비골의 1 / 3 근위 함께 뒤쪽 경골의 근위 절반 연결하는 인대를 잘라,, 삽입 (말초)에 다음 calcaneal 힘줄을 잘라 그 뒤쪽에 삽입 calcaneus. soleus까지 조심스럽게 무료 적절히 편집 판단리스트에서와 목욕 챔버에 soleus 근육를 탑재합니다.
3. 절연 골격 근육의 수축성을 측정
- 근육은 개별 조직 목욕 챔버에 장착되면 녹화를 시작합니다. 대부분의 유사한 시스템은 힘 녹음의 기준을 제로화 할 수 있습니다. 이 기능은 일반적으로 다리 앰프의 기능으로, PowerLab 시스템의 특정 경우에, 앰프와 연결되어 있습니다. 이 기준 변경 관찰을 용이하게하고 제로에서 분석 할 모든 근육 수축을위한 편리한 방법을 제공합니다. 절연 근육이 그 다음 제곱 파 펄스를 자극그 챔버 크기의 기능 백금 와이어의 두께, 선 사이의 거리, 심지어 실험 솔루션의 구성으로 널리 다양 할 수 있습니다. 우리는 60mA의 전류 고용 한 (우리가 350mA 이상 전류가 근육 준비에 해로운 것 같습니다 있다고 지적했습니다)와 350의 stimulatory 열차, 500, 1000 MS는 특정 프로토콜의 목표에 따라 다릅니다. 각각의 사각 파 펄스는 기간은 MS 0.3-1에 이르기까지이 있어야합니다.
- 다음 단계는 융합 파상풍의 자극을 생산 할 수있는 자극의 주파수를 선택하는 것입니다 것은 (예 : soleus 근육의 편집 판단리스트 근육 ~ 60 Hz에서에서 최대 힘의 생산을 허용하는 ~ 100 Hz)보다 천천히 그리고 조심스럽게 근육을 스트레칭을 식별하는 동안 이러한 근육의 최적의 길이입니다. 근육이 심하게 늘어됨에 따라, 30 초 기다려야 및 100 Hz에서 자극, 30 초 후에 다시 신축 한 다음, 힘이 더 이상 증가하지 않는 지점까지 자극을 반복합니다.
- 이 근육은 undergon이환경에서 전자 중대한 변경됩니다. 이것은 근육이 새로운 환경에 적응 할 수하는 것이 좋습니다 우리 프로토콜의 단계는 "평균"을 칭했다. 적어도 5 연속 파상풍의 수축이 (안정 기준을 감소하지 증가하지 않음) 완전히 안정 될 때까지 스트레칭 단계, 20-30 분 Hz에서 100,시 사용 자극의 동일한 주파수에서 이러한 근육을 평형. stimulatory 열차 (100 Hz에서, 500 밀리 기간, 1 밀리 개인 펄스) 평균 동안의 주기성은 1.66 %의 듀티 사이클을 동일 1 분, 비 피곤하게하는 자극이다. 이러한 맥락에서, 1.66 %의 듀티 사이클은 100 %의 총을 통해, 근육 듀티 사이클 근육은 결국 피로 유도 될 수 증가에 의해 시간의 1.66 %를 위해 노력하고 있습니다 것을 의미합니다. 건강, 야생 타입 마우스 그렇지 않으면 근육이 평균 기간 동안 피곤하게하는 프로필을 보여한다면, 그들이 해부 손상되었다있을 수 있습니다, hypoxia은 방 / 근육에서 발생하는, 또는 과도한 엘레 수 있습니다자극 전극을 통해 ctrolysis 유리기를 생성합니다. Westerblad 이전에 400mA 이상의 전류가 유리기 23 형성을 유도하는 것이 좋습니다 있습니다. 다른 금속 확실히 자유 라디칼 형성 및 근육 독성으로 이어질 것이기 때문에 당연히 최고 품질의 플래티넘은 좋습니다.
- 25 ° C.에서 실험을 수행 할 때 30-60 s의 주기성으로 1-140 Hz에서 (5-10 Hz의 단위) 다음 자극 주파수로 근육을 자극하여 힘 대 주파수의 관계 (FF)을 구하는 37 ° C에서 실험을 수행 할 때 높은 격막의 근육 300 Hz에서 최대 주파수, soleus을위한 180-200 Hz에서, 그리고 편집 판단리스트에 220-250 Hz에서에 FF를 확장합니다. 다음으로, 최대 파상풍의 힘 (T 최대) 약 ½ 최대 파상풍의 힘을 (1 / 2 T 최대) 생성 자극의 빈도를 파악, 가끔 편집 판단리스트 및 단독 모두 정확한 ½ T 최대를 얻을하기가 어렵습니다때문에이 근육 사이의 본질적인 차이 중 하나 stimulator 소스를 사용하는 경우 회사는 근육. 가능한 솔루션은 T 최대의 30-70%을 생산하는 주파수를 식별하는 것입니다. 자극이 주파수에 대한 근거는 ½ T 최대의 칼슘 2 + 규제와 ECC 과정에 더 많은 관련 정보를 제공하는 동안 T 맥스, 수축성 기계 이벤트 / 변조의 중요한 정보를 제공한다는 것입니다. 근육을 자극하면서 최대 힘이 달성 된 것을 확신 할 수, 10-20 밀리미터 카페인은 입욕 솔루션에 추가 할 수 있습니다. 최대 힘이 도달 된 경우 힘이 카페인의 존재 증가하지 않습니다. FF는 오른쪽으로 이동하고 힘은 높은 실험 온도에서 약간 높은 경향이있다. 이 시스템 사용, 다른 자극 주파수는 바람직 경우 수행 할 수 있습니다. 빠른 속도로 glycolytic 편집 판단리스트 근육의 수축성 독특한 프로필과 느린 산화 soleus 근육은그림 2에 표시된.
- 평균 후, 피로이 s의 자극 간격과 25 %의 듀티 사이클 (그림 3)과 5 분에 대한 ½ T 최대의 근육. 이 특정 피곤하게하는 프로토콜은 더 나은 근 소포체 칼슘이 근육 수축성 31 + 릴리스의 노력을 반영하기 위해 생각됩니다.
- 1 분 간격으로 30 분에 ½ T 최대이나 힘이 안정 될 때까지 근육을 복구 할 수 있습니다. 추가 피곤하게하는 프로토콜은 수축성 기계 (31)의 상태를 반영하기 위해 생각됩니다 T 최대 자극을 사용하여 현재 수행 할 수 있습니다. 또 다른 방법은 피로 동안 T 맥스와 ½ T 최대를 생성하고 자극 같은 유형의 근육을 복구하기 위해 해당 stimulatory 열차를 넣다하기 위해 피곤하게하는 프로토콜을 확장하는 것입니다.
- 등의 단계 3.4에 설명되어있는 FF를 반복하고, 근거가되는 그 비교 사이 phenotypic 차이erent 긴장, 질병 모델, 또는 약물 치료는 피로 전후 FF를 분석하여 볼 수 있습니다. 우리는 예를 들어 이전에 노인 근육에서 근육에, 그것은 노화의 함수로 골격 근육 피로의 차동 modulatory 효과를 제안, 오른쪽으로 이동하는 동안 피로 후 젊은 야생 형 근육의 FF가 왼쪽으로 이동되어보고했습니다.
- 세포 칼슘이 근육 수축성의 + 항목의 공헌을 조사하기 위해, 목욕 솔루션은 더 칼슘 2 +하지만, 0.1 MM EGTA (0 MM 칼슘 2 + Tyrode 솔루션) 32을 포함하지 않는 솔루션으로 변경 될 수 있습니다. 또한, 매장 운영하는 채널의 다른 차단기는 입욕 솔루션에 적용 할 수 있습니다. 몇 가지 예입니다 : 2 aminoethyl diphenylborinate (2-수배), SKF96365, 3,5 - 비스 (trifluoromethyl) pyrazole 2 (BTP-2)와 azumolene 등 33, 34. 카페인은 ryanodine 수용체의 기능을 조사하는 데 사용할 수 있으며, KCl은 전체를 평가하는 데 사용할 수 있습니다이러한 준비의 탈분극 속성. 다른 약물도 그렇단 +, K에 의해 피로시 힘의 중요한 변조를 조사하는 데 사용할 수 있습니다 +, 그리고 구명 +-K + 펌프 35. 이 약의 대부분은 비교적 작은 크기를 가지고 신속하게 바로 효과가 입증 이러한 근육 준비에 확산 것 같습니다. 특정 약물에 의한 효과의 부족은 반드시 약이 효과가 있으며, 단일 근육 섬유 실험에서 사용되는보다 훨씬 높은 복용량을 사용하여 추가 테스트가 가끔 필요한다는 것을 의미하지는 않습니다.
- / - - 근육 4, 30이 예 생체 시스템의 하나의 고유 한 응용 프로그램은 tric -의 메카닉 alternans의 최근 발견에되었다. Alternans은 피곤하게하는 프로필의 감소 단계에서 수축성 힘의 변동 버스트 에피소드로 정의됩니다. 이 이벤트에는 수축성 힘이 순간적 동안 힘의 이전 수준보다 높일 수 있습니다자극을 피곤하게하는 그 중 더 많은 칼슘 2 +가 출시되고 또는 수축성 기계는 칼슘 2 +에 더 민감되고 있습니다 때문입니다. 수축성 힘 발생이 50 % 이전 힘보다 높은과 발생이 5 분 피로 자극하는 동안 적어도 10 번 볼 수 있어야 할 수 있습니다. 기계의 alternans은 야생 형 생쥐에서 골격근에 일반적인 아니지만, 예를 Trimeric 세포 양이온 채널 유형 A (tric-)과 같은 세포 내 칼슘 2 + 신호 과정의 섭동과 어떤 돌연변이 근육에서 볼 수 - / - 근육 4. 기계의 alternans은 피곤하게하는 stimulations을 통해 유도 할 수 카페인과 cyclopiazonic 산 (CPA) 치료는 이러한 기계 alternans의 대표 녹화 그림 3을 참조하십시오. 피곤하게하는하는 근육이 일시적으로 더 많은 힘을 생산 할 수 것 같습니다 반면, 이러한 현상의 성격은 매우 흥미로운 것입니다. 이전 출판에단일 셀 카 2 조합은 + 분석은 alternans의 모습 SR 칼슘 2 + 과부하 및 불안정 SR의 결과입니다 보여줍니다. 우리는 alternans의 깊은 이해가 ECC 과정의 더 나은 이해로 이어질 수 있다고 생각합니다.
- 실험의 끝에서, 보정 캘리퍼스 및 분석 균형을 사용하여 개별 근육의 길이와 무게를 측정 액체 질소에 근육을 차단 플래시와 -80에 저장 ° C, 생화학 분석이 이러한 근육에서 수행 할 수 있습니다 때문입니다.주세요 이 근육은 또한 ECC 과정의 프로빙 자세한에 대한 기계적으로 피부가 될 수 있으며, ECC 규제 메커니즘의 부재에서 필수적 수축성 속성의 결정에 대한 화학적으로 피부가 될 수.
- 기록 근육 힘 (MV)는 첫째 g 강제로 변환 보정 결과에 따라 다음 아래의 공식을 사용하여 생리적 단면적 (PCSA)로 표준화 : 근육 힘 (N / cm 2) =이 (힘 (g) × 근육 lengtH (cm) × 1.06) / (근육 무게 (g) × 0.00981) 5,36. 또한, 근육 힘이 총 단백질이나 브래드 포드 단백질 분석 / Commossie 푸른 얼룩의 정량화를 사용하여 각 근육 총 고를 콘텐츠를 표준화 할 수 있습니다. 특정 조건에서 근육 질량 반면 심각 인해 질병, 노화, 약물 치료, 근육 질량, 단백질 및 / 또는 고를 내용을 바탕으로 힘의 정상화는보다 안정적인 기록을 제공 할 수에 영향을받을 수 있습니다.
4. 대표 결과
낮은, 중간 및 높은 주파수 자극에 응답 편집 판단리스트 및 soleus의 전형적인 실내 온도 수축성 힘은 그림 2에 표시됩니다. 5 Hz에서의 자극에 의해 유도 편집 판단리스트 수축은 SERCA 칼슘 2 + ATPase와 고유 칼슘 2 + 수축성 기계의 감도 특성 5 Hz에서의 soleus 수축이 (느린 속도 ATPase를 융합하기 시작하면서의 빠른 조치로 인해 개인 꿈틀으로 남아있다D 높은 칼슘 수축성 기계 2 +에 감도), 그러나 정상 세력이 여전히 분리합니다. soleus의가 완전히 융합 파상풍의 힘을 형성하면서 20 Hz에서의 자극에서 편집 판단리스트 수축이 부분적으로 융합되어 있습니다. 에 위배된다 T 최대 80-110 soleus에 대한 편집 판단리스트와 60-90 Hz에서에 대한 Hz에서, 빠른 위쪽으로 그은 획 및 편집 판단리스트에서 파상풍의 힘의 빠른 휴식의 실온에서 다를 수 있습니다 자극 설명되어 있습니다를 생산하는 자극의 주파수에서 soleus 근육의 느린 특성. 그림 2B는 soleus 근육의 특정 주파수에서 칼슘 2 + 릴리스에 더 민감 나타냅니다 soleus 근육에 비해 편집 판단리스트 근육의 힘 주파수 곡선이 오른쪽으로 이동되어 보여 속도가 느린 마이 오신과 트로포 닌의 isoforms의 존재로 인해 자극. 또한, 수축성 기계 낮은 주파수에서 soleus 근육에 상대적으로 더 많은 힘으로 응답합니다. 그림 3 쇼편집 판단리스트 (상단 패널)와 soleus 근육 (가운데 패널)의 SA 정상적인 피로 프로필입니다. 편집 판단리스트 근육의 피곤하게하는 자극에 따라 수축성 힘의 빠른 감소와 5 분 피로 프로토콜의 끝 부분에 힘의 높은 감소합니다. 마지막으로, 돌연변이 근육의 전형적인 기계 alternan 프로필은 근육의 피로 프로필의 감소 단계에서 순간 힘 발생으로 정의 그림 3 (아래 패널)에 게재되었습니다. 수축성 힘 발생이 50 % 이전 힘보다 높은과 발생이 5 분 피로 자극하는 동안 적어도 10 번 볼 수 있어야 할 수 있습니다.
1 그림. 4 채널 전 생체의 수축성 시스템의 개략적 인 도면. 광장 파 펄스는 잔디 stimulator를 제어 컴퓨터에 의해 생성됩니다. 두 자극 절연 단위는 elec에서 발생하는 자극을 필터링trical stimulator 단위 전기 신호의 모든 변동을 제거하고 안정적으로 사각 파 신호를 구축 할 수 있습니다. 이 필터링 전기 신호는 각 절연 근육을 둘러싸고있는 백금 와이어 전극을 포함하는 4 입욕 챔버로 전송됩니다. 궁극적으로, 그것은 행동의 잠재력을 생성 두 전극 (현장 자극라고도 함), 근육의 수축을 유도에서 현재입니다. 이 수축은 다리 앰프로 전송 특정 힘 트랜스 듀서에 의해 감지, 필터링, 평균 (신호 컨디셔닝)와 A / D 변환기를 통해 컴퓨터 소프트웨어에 의해 기록했다.
그림 2. . 편집 판단리스트 및 soleus 대표 수축성 힘은 (A) 수축성 힘은 5 Hz에서 (상단 패널), 20 Hz에서 (가운데 패널) 및 최대 파상풍의 힘 (T 최대) (아래 패널)에 의해 유도, 입구는의 수축성 힘의 흔적을 보여줍니다 근육 손상 (B)담당자가 힘 대 주파수 관계 편집 판단리스트에서 (FF, 상단 패널)와 FF (아래 패널)에 의한 해본 곡선의 개인 수축을 보여주는 설정합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 대표 프로필과 기계 alternans를 피곤하게하는. 편집 판단리스트 근육 (상단 패널)와 soleus 근육 (가운데 패널)의 프로필을 피곤하게하는 속도가 느린 감소의 전형적인 빠른 감소 피곤하게하는 프로필입니다. 자극을 피곤하게하는 것은의 기계 alternans의 모습에 이르게 tric-- / - 교란 칼슘 2 + 핸들링 특성 (낮은 패널)와 근육.
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Discussion
수축성 힘과 fatigability의 측정은 골격근 기능의 전반적인 평가하는 것이 중요합니다. 이 분석의 주요 목적은 sarcopenia 및 근육의 피로와 같은 특정 병적 인 조건에서 근육 힘의 변화와 피곤하게하는 속성을 식별하고, 근육 수축성에 마약 / 시약의 효과를 테스트하는 것입니다. 근육 힘이 밀접하게 세포 칼슘 2 관련되어 있기 때문에 + 릴리스 세포 칼슘 2 + 항목과이 둘 사이의 크로스 토크, 우리는 또한이 방법을 사용 칼슘이에 대한 정보 + 골격근의 신호 상태를 수집 할 수 있습니다. 여기 우리는 피곤하게하는 프로필의 거부 단계에서 수축성 힘의 변동 버스트 에피소드는 과부하 및 불안정한 SR에서 목격 된 '메카닉 alternans "이라고한다 독특한 표현형을 보여 주었다. 하나는 예상 수 변경된 힘, FF, fatigability, 수축성의 속도론 및 복구 AB 등의 골격근 phenotypes의 다양한피로 후 ility는 다른 병적 인 조건 하에서 체외 수축성 분석에 사용 감지 할 수 있습니다.
이 분석의 가장 중요한 단계는 손상의 무료 전체 그대로 근육 (또는 근육 번들과 근육 스트립) 분리하는 것입니다. 이러한 목표는 전체 근육 준비에 달성 할 쉽습니다. 여기 충분한 인대와 힘줄이 전체 근육을 연결하는 떠나는 것은 근육 손상과 결국 근육 사망에 이르게 근육 자체를 매는 방지하기 위해 매우 중요하다는 것을 보여줍니다. 또한, 탄산 수소 기반의 솔루션에 대한 HEPES 기반 솔루션 또는 O 2, CO 2의 혼합물의 경우 100 % O 2 중과 솔루션을 지속적으로 버블 링이 중요합니다. 유량계를 사용하실 수 있습니다 예방 hypoxia와 hyperoxia 중요합니다. 우리는 또한 특정 상황에서 조직을 수영 액체에 용해 된 산소를 측정하는 특정 장치를 사용했습니다. 근육 mor 아르 특정 조건에서손상 발생하기 쉬운 전자는 힘 변환기를 장착하기 전에 칼슘 2 + 무료 솔루션에 고립 된 근육을 취급하는 것은 근육을 이완하고 실험하기 전에 근육 손상을 최소화하는 데 도움이 될 것입니다. 예 2,3와 같은 약물 - butanedione monoxime (BDM) 또는 N-벤질-P-톨루엔 sulphonamide은 (BTS)도 수축성 연구에 대한 일반적인입니다, 근육 번들 또는 근육 스트립이 준비되어 특히, 피해를 최소화하기 위해 절개하는 동안 추가 할 수 있습니다 가로막 37, 38. 녹음하는 동안 손상된 준비는 일반적으로 적은 힘을 생성하고 (그림 2의 유입 참조) 기준 잡음 및 변동을 증가,하고 손상된의 반응을 분석 할 수있는 실험의 일부입니다하지 않는 한 이러한 근육의 결과는 분석 데이터 세트에서 제외 할 수 있습니다 근육. 쉽게 무시하거나 잊어 버린 될 수 있습니다 또 다른 점은 전기 자극 자체가 근육에 대한 독성의 원천이 될 수 있다는 것입니다. 우리는 주기적으로 전극과 chamb 청소하는 것이 좋습니다마운트 된 근육의 길이를 조정하면 모든 오염물, 단백질 파편, 산화 축적 등의 특별주의를 제거하는 1 %의 차아 염소산염 솔루션과 어도 필요합니다. 그것은 효율적인 크로스 브리지 기능 39 중요 얇고 두꺼운 필라멘트의 최적의 정렬로 오버 스트레칭을 피하기 위해 작은 단계에서 스트레칭하는 것이 중요합니다. 또한,이 필드 자극 전극에 탑재 된 근육 번들의 상대적 위치가 일정하게 유지하고 전류의 동일한 금액을 보장하기 위해 모든 채널간에 정렬 고립 된 근육에 적용되는 권장합니다. 항생제, 0.2 % FBS, 그리고 아미노산이 목욕 솔루션에 추가하는 경우의 실험 조건 하에서, 젊은 야생 형 생쥐의 근육은 12여 시간 동안 안정적으로 유지하고 더 이상.
관리 및 적절한 관리를 통해이 전 생체 시스템은 칼슘이 사이의 상관 관계에 대한 정보를 제공 할 수 + 신호vasculature, 내분비 및 신경 시스템의 복잡성없이 d 개의 근육 수축. SR 칼슘 2 + 릴리스 부전 보통 낮은 수축성 힘과 빠른 피곤하게하는 프로파일을 산출 예를 들어, 세포 칼슘 2 의존도의 손실이 + 세 골격근의 서명입니다. SR 칼슘 2 + 과부하와 불안을 생성하는 병적 인 상황에서 오히려 다른 골격 근육에있는 근육하지만, - / - 여기 exampled으로, 기계 alternans의 모습은 우리가 tric -에 국한되지 믿고 불안정 SR을 나타냅니다. 이 설정은 다양한 생리 및 약리 조작에 대한 근육의 직접 액세스 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Brotto M.에 조 X, 엄마 J와 GO 부여 RC2AR05896에 RO1-AR061385에 AHA SDG 10SDG2630086에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-APB | Tocris | 1224 | Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc. |
| SKF96365 | Sigma | SKF-96365 | Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc. |
| BTP-2 | Millipore | 203890-5MG | Relatively specific SOC blocker |
| CPA | Sigma | C1530 | Reversible SERCA blocker |
| caffeine | Sigma | C0750 | Fast action RyR agonist |
| Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System | Radnoti | 159920 | |
| Combination Tissue Support/Stimulating Electrode | Radnoti | 160151 | Vertical Zig Zag Type with tissue support |
| Quad Bridge Amp | ADInstruments | FE224 | |
| PowerLab/400 | ADInstruments | This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system. | |
| Force Transducers (5 mg - 25 g) | ADInstruments | MLT0201/RAD | |
| Chart v4.02 | ADInstruments | LabChart 7.3 is the latest version of Chart software. | |
| S8800 Dual Pulse Digital Stimulator | GRASS TECHNOLOGIES | This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator. | |
| RF Transformer Isolation Unit | GRASS TECHNOLOGIES | Model SIU5 |
References
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