Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ex vivo Bedömning av kontraktilitet, fatigability och Alternans i isolerade skelettmuskler

doi: 10.3791/4198 Published: November 1, 2012

Summary

Vi beskriver en metod för att direkt mäta muskler kraft, muskelkraft, sammandragande kinetik och fatigability isolerade skelettmuskler i

Abstract

Beskrivs här är en metod för att mäta kontraktilitet av isolerade skelettmuskler. Parametrar som muskel kraft, muskelkraft, sammandragande kinetik, fatigability och återhämtning efter utmattning kan erhållas för att bedöma vissa aspekter av excitation-kontraktion koppling (ECC) process som retbarhet, kontraktila maskiner och Ca 2 + hantering förmåga. Denna metod tar bort nerven och blodtillförseln och fokuserar på den isolerade skelettmuskulaturen själv. Vi använder rutinmässigt den här metoden för att identifiera genetiska komponenter som förändrar kontraktila egendom skelettmuskel men modulera Ca 2 + signalvägar. Här beskriver vi en nyligen identifierad skelettmuskulatur fenotyp, dvs mekaniker alternans, som ett exempel på de olika och rika information som kan erhållas med användning av in vitro-muskeln kontraktilitet analys. Kombination av denna analys med encelliga analyser, genetiska metoder och BiochemiStry analyser kan ge viktiga insikter i de mekanismer som ECC i skelettmuskulaturen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skelettmuskulatur fäster ben i skelettet och generera kontraktila krafter under kontroll av det centrala nervsystemet. Excitering-Sammandragning koppling (ECC) avser processen att omvandla en elektrisk stimulus till en mekanisk respons. Ca 2 +-signalering är en viktig del av den kontraktila funktion i skelettmuskulaturen. Effektiv Ca 2 + mobilisering från sarkoplasmatiska retiklet (SR) är en viktig komponent för ECC i muskelcellerna 1, 2, och förändringar i intracellulär Ca 2 +-signalering ligger till grund för motsvarande kontraktil dysfunktion i ett antal muskelsjukdomar 3-5. Korrekt bedömning av muskel kontraktilitet är nödvändig och gratis Ca 2 + bildbehandling och andra analyser för att få inblick i skelettmuskulaturen funktion, inte bara på kontraktila nivå, men också på den kinetiska nivå. Kraft och hastighet kan även erhållas att informera den viktiga egenskapen avmuskelkraft och status för ECC-processen under olika fysiologiska och patofysiologiska förhållanden.

Denna fruktbara forskningsfält har en mycket rik historia och många teorier om muskelkontraktion dök över två årtusenden 6. Modern muskel forskning börjar troligen 1674-1682 med mikroskopisk observation av tvärgående strimmor och myofibriller i muskelfibrer av Leeuwenhoek 6. Nästan ett sekel senare, observerade Luigi Galvani som groda muskel kontrakt kraftfullt när dess nerv berörs med skalpell under en gnisturladdning från en avlägsen elektrisk maskin 7-9. Sammandragning kan också produceras genom att ansluta benet nerven till muskeln via en metalledare. Detaljerna i den komplexa elektriska signalering mekanism som förespråkas av Galvani så småningom formulerades av Hodgkins, Huxley och Katz i sin berömda ekvation 10, 11 som blev grunden för elektrofysiologi. De anmärkningsvärda observationer av RinGer om effekterna av extracellulärt Ca 2 + på kontraktilitet av groda hjärtat och skelettmuskulaturen 12-15 representerar det första stora steget i erkännandet av Ca 2 + som en viktig regulator av muskel kontraktilitet 16, 17. Från 1980-talet fram till i dag en skur av upptäckter i muskeln kontraktilitet fältet genomfördes på grund av införandet av muskel kontraktilitet och protokoll fatigability i murina skelettmuskler 18. Jones och Edwards var de första att föreslå att lågfrekventa intermittent trötthet (ansträngningsutlöst minskning gällande) 19 var associerad med förändringar i ECC maskiner och inte kontraktila apparaten. I slutet av 1980-talet och början av 1990-talet, var Kolkeck m.fl. 20, Kolbeck och Nosek 21, och Reid 22 med diafragman från gnagarmodeller för att studera effekterna av teofylliner, cortiosterone, och fria radikaler på skelettmuskulaturen kontraktilitet, medan Brooks och FaulknER var de första att rapportera om mätningar av upprepad kraft och mätningar makt i snabbt och långsamt muskler från möss 22. Dessutom var Lannegren, Westerblad, lamm och Westerblad den första att direkt koppla ex vivo kontraktilitet med intracellulär Ca 2 + reglering och började ifrågasätta roll acidos i muskeltrötthet 23, 24.

Våra laboratorier har bidragit avsevärt sedan början av 2000-talet till förståelse av nya gener med modulerande och regulatoriska roller på muskel ECC med kritiska roller i muskel kontraktilitet, fatigability och åldrande genom att använda en kombination av intakta kontraktilitet mus muskel studier intracellulär Ca 2 + övervakning intakta och flådda muskelfibrer och molekylär-genetiska manipulationer 3-5, 25-29.

Här har vi närmare det experimentella protokollet för mätning kontraktilitet av murina isolerade soleus och extensor digitorum longus (EDL) muskler, som motsvarar en mestadels långsamt oxidativ (typ I och IIa muskelfibrer) och en mestadels snabbt glyocolytic muskel (typ IIb och IIx muskelfibrer) med distinkta kontraktila egenskaper. I detta protokoll var intakta muskel-senor komplex isoleras och badade i ADI PowerLab Radnotti kammarsystem levereras med antingen rent syre eller en blandning av syre (95%) och CO 2 (5%). Kontraktila krafter genererades av elektriska stimuleringar från en Grass stimulator och detekteras med hjälp av en kraftgivare som integrerades med ADI PowerLab/400-system, vilket gör att anpassning av makro rutiner för att kontrollera förvärv, insamling, digitalisering och lagring av data. Denna setup kan mäta muskel kraft, muskelkraft, liksom kraften mot frekvensen relation, muskeltrötthet, återhämtning från muskeltrötthet, hastighet och övergripande kinetiska egenskaper muskelkontraktion. Dessutom kan effekterna av läkemedel på muskelkontraktion övervakas genom dessa experiment. Fördelarna med denna metod låg i att ta bort neuronala och vaskulära komponenter från skelettmuskulaturen, vilket direkt bedömning av inneboende egenskaper hos de upphandlande muskler. Dessutom ex vivo kontraktilitet analyser tillåter manipulering av den extracellulära miljön kring de isolerade muskler, vilket möjliggör användning av farmakologiska manipulationer av olika jonkanaler genomträngning och transportörer för att fastställa deras fysiologiska roll för skelettmuskulatur funktion.

Denna ex vivo system har tillåtit oss att nyligen upptäcka en distinkt alternan beteende i vissa muterade muskler preparat, som var knutna till förändrad intracellulär Ca 2 + hantering egenskaper 4. Alternans definieras som fluktuerande burst episoder av kontraktil kraft under nedgången fasen av tröttande profilen. Under dessa händelser kontraktila krafter ökar tillfälligt över den tidigare nivån av kraft dnder tröttande stimulering, kanske för att antingen mer Ca 2 + släpps eller kontraktila maskiner har blivit mer känsliga för Ca2 + 30. Behandling av cyclopiazonic syra (CPA), en reversibel blockerare av sarkoplasmatiskt-endoplasmatiskt retikulum kalcium ATPas (SERCA), koffein, en agonist till ryanodine kanal (Ryr) och upprepade tröttande stimuli kan alla inducera mekaniska alternans 4, vilket tyder på att alternans är direkt relaterade till modulering av EG kopplingsprocessen. Demonstration av metoden för att inducera och spela mekaniker alternans i in vitro kontraktilitet inställning fungerar som ett exempel för att visa de diversifierade experimentella parametrar som kan uppnås med detta system eller liknande sådana, baserat på individuella forskningsintressen.

Denna metod kan vara av intresse för forskare som studerar muskelfysiologi. Liknande inställning kan också användas för isolerade skelett muscle-tendon/ligament komplex från andraanatomiska platser, liksom för enskilda fibrer och band muskler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lösning sammansättning:

2,5 mM Ca 2 + Tyrode-lösning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaClz 2, 2 mM MgCl2 och 10 mM glukos

0 mM Ca 2 + Tyrode-lösning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1 mM etylenglykol tetraättiksyra (EGTA) och 10 mM glukos

Obs: badlösning bör vara mättad med 100% O 2 om användning av ovanstående lösning, men med 95% O 2 med 5% CO 2 om man använder bikarbonat-baserade buffertar för att hålla pH konstant. 2,5 mM Ca 2 + sättes till badet bufferten att rekapitulera nivån av Ca 2 + finns i det extracellulära utrymmet och 10 mM glukos är viktigt eftersom mitokondrier fungerar fortfarande i dessa muskler att kontinuerligt producera ATP i närvaro av glukos.

1. Inrättande ex vivo kontraktilitet experiment medADI PowerLab systemet

  1. En schematisk ritning av en 4-kanals ex vivo kontraktilitet system visas i figur 1. En dator styr en stimulator för att generera kvadratiska vågpulser, som filtreras genom isolering enheten att nå ett par platinatråd omger varje isolerad muskel-senor komplex. Detta kallas också fältstimulering. Kontraktion av muskeln svarar på stimulering avkännes av en kraftomvandlare, den signal som genereras från vilken förstärks, filtreras och överföres tillbaka till datorn genom en A / D-omvandlare (signalkonditionering). Signalen digitaliseras sedan och kan sparas för senare analys.
  2. För att förbereda för en ex vivo kontraktilitet experiment, slå först på fältet stimulatorn, A / D-omvandlare (i det här fallet ADI Effekt Lab) eller ett liknande program (t.ex. LabView), följt av datorn.
  3. Öppet Chart4 programvara (eller annan programvara version som är kompatibel med systemet) och initieratsEA 4-kanals uppgift, korrekt kommunikation av programvaran och hårdvaran indikeras genom att starta konfigurationen av hårdvaran, och START-knappen på programvaran tas i bruk (live), den 4-kanals funktion möjliggör samtidig mätning av ett par muskler från en vildtyp och en mutant möss, eller 2 EDL och 2 soleus muskler från samma mus, och den kan användas för andra muskler såsom membranet (hela membran, hemi-diafragma, eller diafragma remsor muskel) och tibialis anterior; Det kan också användas för hjärtmuskelceller preparat och för buntar av muskler, särskilt om man använder råtta muskler. I detta fall storleken av musklerna kan begränsa syrediffusion så muskel knippen är således ett bättre val. Men experter dissekering tekniker som krävs för förberedelser muskel bunt.
  4. Kalibrering av kraftgivare: detta är att säkerställa jämförbarheten mellan dataset genereras vid olika kanaler och vid olika tidpunkter. Första start inspelning, Sequentially hänga en 1-g, 2-g och 5-g vikter på provet lund kraftomvandlaren, stoppa inspelningen, beräkna motsvarande ändringar i mV visas i varje kanal i Chart4 programmet rita ΔmV och vikten att kontrollera linjäritet och bestämma konverteringsfaktor mellan mV och gram kraft. Vi rekommenderar utföra dessa kalibreringar antingen i början eller i slutet av varje försök för att säkerställa att en särskild kalibrering erhålls för varje specifikt experiment.
  5. Kontrollera korrekt anslutning av teflonröret, dränera vätska närvarande i vävnadsbadet slangen, tvätta kamrarna tre gånger eller mer med DDH 2 O och fyll med 20 ~ 25 ml 2,5 mM Ca 2 + Tyrode-lösning. Ca 2 + och glukos är anordnade i badlösningen för att hjälpa till att bibehålla membranets integritet, optimal Ca 2 + laddning av SR, och en lättillgänglig energikälla för generering av ATP genom muskeln själv, eftersom mitokondrier förblir fullt funktionell i dessa beredningar.
  6. Kontrollera korrekt anslutning av syretillförseln, öppnar syretanken, och justera flödet av syre till ge diffusiv och homogen bubblande av kammaren. Syrenivån kan lätt bestämmas som en funktion av kontraktil kraft kontra tid. En flödesmätare kan också installeras, särskilt om forskarna är intresserade av att studera effekter av hypoxi eller hyperoxi. Om musklerna blir hypoxiska, minskar kraften naturligt. Medan hyperoxi kan också skada muskler, men dess effekter kan vara svårare att upptäcka eftersom de flesta experiment utförs under artificiella hyperoxisk villkor för att kompensera för frånvaron av en normal blodtillförsel till musklerna. I de flesta system är det möjligt att bubbla de olika kamrarna med samma mängd syre helt enkelt genom att styra flödet av syre till varje kammare konstant.
  7. Justera känslighet alla kanaler för att säkerställa maximal kraft upplösning utan mättning kanalen. Kanal känslighet kan variera avsevärt som fungerar ettd djurets ålder, experimentell temperatur, genetiska manipulationer, muskel storlek, musstam samt förmåga försöksledaren att korrekt dissekera muskler fria från skador. I vår erfarenhet, vid mätning soleus sammandragningskrafterna varierar känsligheten 0,5 till 10 mV / cm, medan i fallet med EDL, kan känsligheten varierar från 1 till 20 mV / cm.
  8. Ett protokoll för tröttande stimuleringen behöver upprättas. I Chart4 programmet ett makro kan användas. För att programmera en ny makro: i Chart4 mjukvaran, klicka börja mäta och klicka sedan på makro, makro kommando, starta inspelningen börjar upprepa välja önskad stimulans frekvens och sedan slutet upprepa. För en jämvikt protokoll, är stimulus upprepas varje minut under 30 minuter och tröttande protokoll, är stimulus upprepas var 2 sek under 5 min. Dessa förändringar i periodiciteten hos stimuleringen, direkt påverkar arbetscykeln, som också är en funktion av stimuleringen varaktighet. Dessa parametrar kan varieras för att testa olika AspeCTS på kontraktilitet och fatigability.

2. Förbereda Intakta Muscle Bundles

  1. EDL dissektion: mus offras efter NIH riktlinjer och IACUC institutionella protokoll djur. Musen avlivades genom cervikal dislokation. Mouse är sedan anordnad vid den laterala positionen. EDL muskel är en snabbt glykolytiskt muskler med ljusrosa-vit färg. Det är ca 10-13 mm lång och väger 8-11 mg i vildtyp C57BL / 6 mus. EDL har funktionerna att utvidga tår 2-5, och dorso-böjning av foten vid vristen. Den innerveras av den peroneal nerven. Att dissekera EDL, göra en ytlig hud incision och skära upp fascian mellan den främre tibialis och den bakre muskelgrupp, och lokalisera ursprunget (proximala) där ligament är ansluten till den laterala kondyl av skenbenet och överlägsen 3/4 av den främre yta vadben (interosseous marginal). Skär ligamentet med fina oftalmiska sax så distalt som möjligt från muskeln, vilket GÅNGe släpper den proximala ursprung EDL muskeln. Håll ligament med en trubbig pincett och dra sakta för att frigöra EDL. Det kan vara nödvändigt att skära en del av perimysium omger EDL och andra muskler runt EDL, ett steg som är kritisk, eftersom skada kan uppstå på EDL muskeln under denna känsliga steget. Därefter flyttar till införandet region där de fyra distala senor in i mitten och distala falanger siffror 2-5. Skär senor så långt som möjligt från musklerna.
  2. Överför den isolerade EDL muskeln till en dissektion skål innehållande isoton Tyrode-lösning. Vissa muterade, transgena och knockout djurmodeller har mycket sköra muskler och utnyttjande av Ca 2 +-fri Tyrode lösning är nödvändig för att förhindra Ca 2 +-inducerad muskelskada före kontraktilitet mätningar. Sedan använder en kirurgisk knut att binda tätt vid båda ändarna av EDL muskeln som distalt från muskeln som möjligt. Ett bra mått är att binda något över mitten pOINT längdriktningen av ligamentet eller senan. Använd 6-0 size sutur för detta förfarande, och överföra EDL muskeln till O 2-mättade vävnadsbad kammare, montera muskeln på provet spår av kraftgivare och brevpapper kroken på botten av badet kammaren upprepas process för det andra benet. Vi börjar också använda en ny metod som håller musklerna med klämmor istället för suturer. Om den stora målet är att studera kinetiska egenskaper och / eller för att få muskelkraft, rekommenderas att sutur vara så kort som möjligt eller suturen ersättas med en metallstav.
  3. Soleus dissektion: soleus är en mestadels långsamt oxidativ muskler med rika röd färg. Det är ~ 1 mm kortare än EDL men väger något mer än EDL. Den innerveras av den tibialnerven och den utför verkan av plantar böjning foten. Att dissekera soleus, öppna bakre laterala sidan av benet, skjuta undan gastrocnemius som normalt täcker soleus, och identifiera muskeln med mörkröd färg. I origo (proximala), skär ligament ansluter till den proximala halvan av bakre tibia utmed soleal linjen och proximala 1/3 av den bakre vadben, nästa, vid insättningspunkten (distala), skär den calcaneal senan som infogar i den bakre calcaneus. Försiktigt frigör soleus och korrekt montera soleusmuskeln i badet kammaren som för EDL.

3. Mätning kontraktilitet av de isolerade skelettmusklerna

  1. När musklerna är monterade i enskilda kammare vävnadsbad, starta inspelningen. De flesta liknande system tillåter nollställning av baslinjen kraft inspelning. Denna funktion är vanligtvis förknippas med förstärkaren i det specifika fallet med PowerLab systemet som funktion av bron förstärkaren. Det underlättar observation av grundläggande förändringar och ger ett bekvämt sätt för alla muskelsammandragningar som ska analyseras från noll. Isolerade muskler stimulerades sedan med fyrkantig våg pulsersom kan variera kraftigt som en funktion av kammarens storlek, trådar platina tjocklek, avståndet mellan trådarna, och även sammansättningen av experimentella lösningen. Vi har anställt ström av 60 mA (vi har noterat att strömmar över 350 mA verkar vara skadliga för muskel preparat) och stimulerande tåg av 350, 500 och 1000 ms, beroende på målen för ett särskilt protokoll. De enskilda kvadratiska vågpulser bör ha varaktighet sträcker från 0,3 till 1 ms.
  2. Nästa steg är att välja en frekvens av stimulering kan producera en smält tetanic stimulering (ex: ~ 100 Hz för att tillåta produktion av maximal kraft i EDL muskler och ~ 60 Hz i soleus muskel), medan långsamt och försiktigt sträcka musklerna att identifiera optimala längden av dessa muskler. Eftersom muskler är noggrant sträcks, vänta 30 s och stimulera vid 100 Hz, vänta 30 s och sträcka igen och sedan upprepa stimulans, till den punkt där kraften ökar inte längre.
  3. Dessa muskler har undergone betydande förändringar i miljön. Det rekommenderas att musklerna få anpassa sig till den nya miljön, kallas ett steg i våra protokoll "jämvikt". Ekvilibrera dessa muskler på samma frekvens av stimulering används under stretching fasen 100 Hz för 20-30 minuter, tills åtminstone 5 på varandra följande tetanic sammandragningar är helt stabila (inte minska, inte öka, stabil baslinje). Periodicitet stimulerande tåg (100 Hz, 500 ms varaktighet, 1 ms enskild puls) under jämvikt är 1 min, vilket motsvarar en kapacitet på 1,66%, en icke-tröttande stimulering. I detta sammanhang innebär en kapacitet på 1,66% som under sammanlagt 100%, är musklerna arbetar 1,66% av tiden, genom att öka duty cycle musklerna så småningom kan förmås att trötthet. Om annars muskler friska, vildtyp mus visar en tröttande profil under denna jämviktsperiod är det möjligt att de skadas under dissektion är hypoxi sker i kamrarna / muskler, eller överdriven Electrolysis genom de stimulerande elektroderna genererar fria radikaler. Westerblad har tidigare föreslagit att strömmar större än 400 mA inducerar bildandet av fria radikaler 23. Uppenbarligen är det högsta kvalitet platina föreslås, eftersom andra metaller kommer säkert att leda till bildning av fria radikaler och muskeltoxicitet.
  4. Skaffa den kraft kontra frekvens relation (FF) genom att stimulera musklerna med följande stimulering frekvenser: 1-140 Hz (i steg om 5-10 Hz), med en periodicitet av 30-60 s när de utför experiment vid 25 ° C. När du utför experiment vid 37 ° C, förlänga FF till högre frekvenser på upp till 300 Hz för diafragman, 180-200 Hz för soleus och 220-250 Hz för EDL. Därefter identifiera frekvensen av stimulering som genererar maximal tetanic kraft (T max) och cirka ½ maximala tetanic kraft (1/2 T max), ibland är det svårt att få den exakta ½ T max för både EDL och ensamoss muskler om endast en stimulator källa används, på grund av de faktiska skillnaderna mellan dessa muskler. En fungerande lösning är att identifiera en frekvens som producerar 30-70% av Tmax. Skälet till dessa frekvenser av stimulering är att Tmax ger viktig information om kontraktila maskiner händelser / modulering, medan ½ Tmax ger information mer relevant för Ca 2 + reglering och ECC-processen. För att vara säker på att maximal kraft har uppnåtts, kan 10-20 mM koffein läggas till badlösningen samtidigt stimulera muskeln. Om maximal kraft har uppnåtts, kommer att tvinga ökar inte i närvaro av koffein. FF förskjuts åt höger och krafter tenderar att vara något högre vid högre experimentella temperaturer. Med detta system, kan alla andra stimulering frekvenser utföras om så önskas. Den distinkta kontraktila profilen för en snabbt glykolytisk EDL muskler och en långsamt oxidativ soleus muskler ärvisas i figur 2.
  5. Efter jämviktning, trötthet musklerna vid ½ Tmax för 5 minuter, med stimulering intervall av 2 s och 25% intermittensfaktor (figur 3). Denna specifika tröttande protokoll tros att bättre återspegla bidrag sarkoplasmatiska retiklet Ca 2 + övergång till muskel kontraktilitet 31.
  6. Återvinn muskeln vid halv T max för 30 min eller tills kraften är stabil, vid 1 min intervall. En ytterligare tröttande protokoll kan utföras nu med Tmax stimulering, som tros reflektera den den kontraktila maskiner 31. Ett annat alternativ är att förlänga tröttande protokollet för att inskjuta stimulerande tåg som genererar Tmax och ½ Tmax under trötthet och att återvinna musklerna med samma typ av stimulering.
  7. Upprepa FF som beskrivs i steg 3,4, logiken är att fenotypiska skillnader mellan different stammar, modeller sjukdom eller behandlingar läkemedel kan observeras genom att analysera FF före och efter trötthet. Vi har till exempel tidigare rapporterat att efter utmattning FF unga vildtyp muskler förskjuts åt vänster, medan musklerna från äldre muskler, är det flyttas åt höger, vilket tyder på effekter differentiella modulerande av skelettmuskulaturen trötthet som en funktion av åldrande.
  8. Att proba bidraget av extracellulär Ca 2 + inträde i muskel kontraktilitet, kan badlösning ändras till en lösning som inte innehöll någon Ca 2 +, men 0,1 mM EGTA (0 mM Ca 2 + Tyrode-lösning) 32. Alternativt kan olika blockerare av butiken drivna kanal tillämpas i badlösningen. Några exempel är: 2-aminoetyl diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-bis (trifluormetyl) pyrazol 2 (BTP-2) och azumolene, 33 etc, 34. Koffein kan användas för att sondera funktion ryanodine receptorn, och KCl kan användas för att bedöma den totaladepolarisation egenskaperna hos dessa preparat. Andra läkemedel kan också användas för att undersöka viktiga modulering av kraft under utmattning av Na +, K +, och Na +-K + pumpar 35. De flesta av dessa läkemedel har relativt små storlekar och verkar snabbt diffundera in dessa muskler preparat som framgår av deras omedelbara effekter. Avsaknaden av en effekt av alla givna läkemedel betyder inte nödvändigtvis att läkemedlet är ineffektivt och ytterligare tester med doser mycket högre än den som används i enstaka experiment muskel fiber är ibland nödvändigt.
  9. En unik tillämpning av denna ex vivo-system ledde till den senaste upptäckten av mekaniker alternans i TRIC-a - / - muskler 4, 30. Alternans definieras som fluktuerande burst episoder av kontraktil kraft under nedgången fasen av tröttande profilen. Under dessa händelser kontraktila kraft kan tillfälligt stiga över den tidigare nivån av våld undertröttande stimulering eftersom det antingen mer Ca 2 + släpps eller kontraktila maskiner har blivit mer känsliga för Ca 2 +. Den kontraktila kraften utbrott måste vara 50% högre än föregående kraft och utbrotten bör ses minst 10 gånger under 5-minuter trötthet stimulering processen. Mekaniker alternans är inte vanligt i skelettmuskel från vildtyp möss, men kan ses i vissa muterade muskler med störning av den intracellulära Ca 2 +-signalering process såsom trimera Intracellulär katjonkanal typ A (TRIC-a) - / - muskel 4. Mekaniker alternans kan induceras genom tröttande stimuli, behandling med koffein och cyclopiazonic syra (CPA), se Figur 3 för en representativ registrering av dessa mekaniska alternans. Karaktären av detta fenomen är ganska spännande, medan en muskel som tröttande tycks kunna tillfälligt producera mer kraft. I vår tidigare publikation, Kombination med enda cell Ca 2 + analys visar att utseendet på alternans är ett resultat av SR Ca 2 + överbelastning och instabil SR. Vi tror att en djupare förståelse för alternans kan leda till en bättre förståelse för ECC-processen.
  10. Vid slutet av försöket, mäta längd och vikt för enskilda muskler med kalibrerad tjocklek och analytisk balans snabbfrystes muskeln i flytande kväve och spara vid -80 ° C, eftersom biokemiska analyser kan utföras i dessa muskler. Dessa muskler kan också vara mekaniskt flådda för detaljerad sondering av ECC-processen, eller vara kemiskt flådda för bestämning av väsentliga kontraktila egenskaper i frånvaro av ECC regleringsmekanismer.
  11. Inspelade muskelkraft (mV) omvandlas först till gram tvinga utifrån kalibreringsresultat och normaliseras sedan till fysiologiska tvärsnittsarean (PCSA) med användning av följande formel: muskel kraft (N / cm 2) = (kraft (g) x muskel length (cm) x 1,06) / (muskel vikt (g) x 0,00981) 5,36. Alternativt kan muskel kraft normaliseras till totalprotein eller total aktin innehållet i enskilda muskler med Bradford proteinanalys / Commossie blå färgning kvantifiering. Under vissa förhållanden, medan muskelmassan kan drabbas hårt på grund av sjukdomar, åldrande, kan läkemedelsbehandlingar, kraft normalisering baserad på muskelmassa, protein och / eller aktin innehåll ger en mer stabil avläsning.

4. Representativa resultat

Typisk rumstemperatur kontraktila krafter EDL och soleus svarar på låg, mellanliggande och hög frekvens stimuli visas i Figur 2. EDL kontraktion inducerad av 5 Hz stimulans förblir som enskilda ryckningar på grund av den snabba verkan av SERCA Ca 2 + ATPas och den inneboende Ca 2 + känslighet egenskaper kontraktil maskiner, medan den soleus kontraktion med 5 Hz börjar smälta (långsammare ATPas ettd högre känslighet för Ca 2 + i kontraktila maskiner), men de toppkrafter fortfarande åtskilda. Vid 20 Hz stimulering, är EDL sammandragningar delvis smält medan den soleus bildar en helt sammansmält tetanic kraft. Vid frekvensen av stimulans som ger Tmax stimulering, som kan variera i rumstemperatur 80 till 110 Hz för EDL och 60-90 Hz för soleus, snabb uppåtslag och snabb avslappning av tetanic kraft i EDL noteras, vilket strider mot långsamma egenskaper soleusmuskeln. Figur 2B visar att kraft-frekvenskurvan för EDL muskeln skiftas åt höger jämfört med soleusmuskeln, vilket indikerar att soleus muskler är mer känsliga för Ca 2 + frisättning vid varje given frekvens av stimulering på grund av närvaron av den långsamma myosin och isoformer troponin. Dessutom svarar kontraktila maskiner med relativ mer kraft i soleusmuskel vid lägre frekvenser. Figur 3 visarsa normal trötthet profil EDL (övre panelen) och soleusmuskeln (mellersta fältet). Notera den snabbare nedgången i kontraktil kraft under tröttande stimulans i EDL muskeln och den högre minskningen i kraft vid slutet av den 5-minuter trötthet protokoll. Slutligen en typisk mekanisk alternan profil av en mutant muskel som visas i figur 3 (undre panelen), som definierades som momentana kraft utbrott under minskande fas muskeltrötthet profil. Den kontraktila kraften utbrott måste vara 50% högre än föregående kraft och utbrotten bör ses minst 10 gånger under 5-minuter trötthet stimulering processen.

Figur 1
Figur 1. Schematisk ritning av en 4-kanals ex vivo kontraktilitet systemet. Fyrkantvåg alstras av en dator som styr en Grass-stimulator. Två stimulering isoleringsenheter filtrera stimulans som härrör från eltrisk stimulator enhet för att avlägsna eventuella fluktuationer i den elektriska signalen och etablera en stabil fyrkantvåg-signal. Detta filtrerade elektriska signalen sänds till 4 bad kamrarna innehåller elektroderna platinatråd omger varje isolerad muskel. Ytterst är det den nuvarande över två elektroder (kallas fältstimulering) som genererar en aktionspotential, inducera kontraktion av muskeln. Denna sammandragning detekteras av en specifik kraftgivare, överförs till bron förstärkarna, filtrerad (signal konditionering) och registreras av programvara genom en A / D-omvandlare.

Figur 2
Figur 2. . Representativa sammandragande krafter EDL och soleus (A) Kontraktila krafter som induceras av 5 Hz (övre panelen), 20 Hz (mellersta fältet) och maximal tetanic kraft (Tmax) (lägre panelen), inlopp visar ett spår av kontraktil kraft en skadad muskel, (B) enrepresentant som visar de individuella sammandragningar av en kraft mot frekvens relation i EDL (FF, övre panel) och den kurva som följer av FF (nedre panelen). Klicka här för att se större bild .

Figur 3
Figur 3. Representant tröttande profil och mekaniska alternans. En typisk snabb nedgång tröttande profil EDL muskeln (övre panel) och den långsamma nedgången tröttande profil soleusmuskeln (mellersta fältet). Tröttande stimulering leder till uppkomsten av mekaniska alternans i TRIC-a - / - muskel med störda Ca 2 + hanteringsegenskaper (undre panelen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mätning av kontraktila kraft och fatigability är viktigt för den övergripande utvärderingen av skelettmuskulaturen funktion. Det huvudsakliga syftet med denna analys är att identifiera förändringar i muskel kraft och tröttande fastigheter under vissa patologiska tillstånd, såsom sarcopeni och muskeltrötthet och att testa effekten av läkemedel / reagenser på muskel kontraktilitet. Eftersom muskeln kraften är nära besläktad med intracellulär Ca 2 + release, extracellulärt Ca 2 + inresa och överhörning mellan dessa två, kan vi samlas också information om Ca 2 + signalering status i skelettmuskulaturen med denna metod. Här visade vi en unik fenotyp kallas "mekaniker alternans" när fluktuerande burst episoder av kontraktil kraft under nedgången fasen av tröttande profilen sågs under en överbelastad och instabil SR. Man skulle kunna förvänta sig att en mängd skelettmuskel fenotyper inklusive förändrad kraft, FF, fatigability, sammandragande kinetik och återhämtning abbilitet efter trötthet kan detekteras med användning av in vitro-analys kontraktilitet under olika patologiska tillstånd.

Det mest kritiska steget för denna analys är att isolera hela intakta muskler (eller muskler buntar och band muskler) som är fria från skador. Ett sådant mål är lättare att uppnås i hela muskel preparat. Här visar vi att lämna tillräckligt med ledband och senor att knyta hela muskler är mycket viktigt att förhindra att binda muskeln själv, vilket leder till muskelskada och så småningom musklerna döden. Dessutom, är konstant bubbling av lösningar med antingen 100% O 2 i fallet med HEPES-baserade lösningar eller en blandning av O 2 och CO 2 för bikarbonat-baserade lösningar kritisk. Förebygga hypoxi och hyperoxi är viktigt medan en flödesmätare kan användas. Vi använde också i vissa situationer en speciell apparat som mäter löst syre i vätskor badar vävnaden. Under vissa förhållanden där muskler är more benägna att skada, kommer hanterar isolerade muskel i en Ca 2 +-fri lösning innan montering på kraftomvandlaren bidra att slappna av muskeln och minimera muskelskador före experimentet. Läkemedel såsom 2,3 - butandion monoxim (BDM) eller N-bensyl-p-toluensulfonamid (BTS) kan också tillsättas under dissekering att minimera skador, särskilt om muskel knippen eller remsor muskel framställs, vilket är vanligt för kontraktilitet studie av membranet 37, 38. Under inspelningen kommer skadade förberedelser genererar normalt mindre kraft och har ökat baslinjen buller och variationer (se inlopp figur 2), och resultaten från dessa muskler kan uteslutas från analysen databas om inte det är en del av experimentet för att analysera svaren från skadade muskler. En annan punkt som lätt kan ignoreras eller glömma är att den elektriska stimuleringen i sig kan vara en källa till toxicitet för muskler. Vi rekommenderar regelbundet rengör elektroderna och CHAMBmans med en 1% hypoklorit för att avlägsna eventuella föroreningar, protein skräp, oxidation ansamling mm Special varningar krävs också vid justering av längden på den monterade muskeln. Det är viktigt att sträcka i små steg för att undvika över-stretching som den optimala anpassningen av tunna och tjocka trådar är avgörande för en effektiv gränsöverskridande bro fungerar 39. Dessutom rekommenderas att den relativa positionen för de monterade muskel knippen till elektroderna fältstimulering hålls konstant och inriktade bland alla kanaler för att säkerställa att samma mängd elektrisk ström matas till de isolerade muskler. Enligt våra experimentella betingelser, muskler från unga möss av vildtyp förblir stabila under mer än 12 timmar och ännu längre om antibiotika, 0,2% FBS, och aminosyror sättes till badlösningen.

Med omsorg och god kontroll, kan detta ex vivo-system ger information om sambandet mellan Ca 2 + signalerar end muskelkontraktion utan komplexiteten i vaskulaturen, endokrin och nervsystemen. Till exempel förlust av beroendet extracellulärt Ca 2 + är en underskrift av äldre skelettmuskel, medan SR Ca 2 + Release dysfunktion vanligtvis ger lägre sammandragande kraft och snabb tröttande profil. Som exampled här visar utseendet av mekaniska alternans instabila SR, som vi tror inte är begränsad till TRIC-A - / - muskler utan också i andra skelettmuskler i patologiska tillstånd genererar SR Ca 2 + överbelastning och instabilitet. Denna setup ger direkt tillgång av muskeln för olika fysiologiska och farmakologiska manipulationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av AHA SDG 10SDG2630086 till Zhao X RO1-AR061385 Ma J och GO Grant RC2AR05896 till Brottö M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-APB Tocris 1224 Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365 Sigma SKF-96365 Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2 Millipore 203890-5MG Relatively specific SOC blocker
CPA Sigma C1530 Reversible SERCA blocker
caffeine Sigma C0750 Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System Radnoti 159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode Radnoti 160151 Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp ADInstruments FE224
PowerLab/400 ADInstruments This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g) ADInstruments MLT0201/RAD
Chart v4.02 ADInstruments LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator GRASS TECHNOLOGIES This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit GRASS TECHNOLOGIES Model SIU5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winegrad, S. Role of intracellular calcium movements in excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Fed. 24, 1146-1152 (1965).
  2. Sandow, A. Excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Pharmacol. Rev. 17, 265-320 (1965).
  3. Thornton, A. M. Store-operated Ca(2+) entry (SOCE) contributes to normal skeletal muscle contractility in young but not in aged skeletal muscle. Aging. 3, 621-634 (2011).
  4. Zhao, X. Ca2+ overload and sarcoplasmic reticulum instability in tric-a null skeletal muscle. J. Biol. Chem. 285, 37370-37376 (2010).
  5. Brotto, M. A. Defective maintenance of intracellular Ca2+ homeostasis is linked to increased muscle fatigability in the MG29 null mice. Cell Res. 14, 373-378 (2004).
  6. Florkin, M. Machina carnis. The Biochemistry of Muscular Contraction in its Historical Development. Med. Hist. 17, 316-317 (1973).
  7. Galvani, A., Aldini, J. De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. ApudSocietatem Typographicam. (1792).
  8. Fulton, J. F., Wilson, L. G. Selected Reading in the History of Physiology. Charles C.Thomas. (1930).
  9. Piccolino, M. Luigi Galvani and animal electricity: two centuries after the foundation of electrophysiology. Trends Neurosci. 20, 443-448 (1997).
  10. Hodgkin, A. L. The Croonian Lecture: Ionic Movements and Electrical Activity in Giant Nerve Fibres. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 148, 1-37 (1958).
  11. Hodgkin, A. L. The Sherrington Lectures VII the Conduction of the Nervous Impulse. Liverpool University Press. 71964 (1965).
  12. Ringer, S. A further contribution regarding the influence of the different constituents of the blood on the contraction of the heart. J. Physiol. 4, 29-42.3 Forthcoming.
  13. Ringer, S. Further experiments regarding the influence of small quantities of lime, and other salts on muscular tissue. J. Physiol. 7, 291-308 Forthcoming.
  14. Ringer, S., Buxton, D. W. Concerning the action of calcium, potassium and sodium salts upon the eel's heart and upon the skeletal muscles of the frog. J. Physiol. 8, 15-19 Forthcoming.
  15. Ringer, S. Regarding the action of lime, potassium and sodium salts on skeletal muscle. J. Physiol. 8, 20-24 (1887).
  16. Campbell, A. K. Intracellular Calcium its Universal Role as Regulator. John Wiley and Sons. (1983).
  17. Mol, J. Cell Cardiol. 16, ll3-ll6 (1984).
  18. Ridings, J. W., Barry, S. R., Faulkner, J. A. Aminophylline enhances contractility of frog skeletal muscle: an effect dependent on extracellular calcium. J. Appl. Physiol. 67, 671-676 (1989).
  19. Fitts, R. H. The cross-bridge cycle and skeletal muscle fatigue. J. Appl. Physiol. 104, 551-558 (2008).
  20. Kolbeck, R. C., Speir, W. A. Diaphragm contactility as related to cellular calcium metabolism: Influence of theophylline and fatigue. American Review of Respiratory Disease. 139, 495 (1989).
  21. Kolbeck, R. C., Nosek, T. M. Fatigue of rapid and slow onset in isolated perfused rat and mouse diaphragms. J. Appl. Physiol. 77, 1991-1998 (1994).
  22. Moore, B. J. Diaphragm atrophy and weakness in cortisone-treated rats. J. Appl. Physiol. 67, 2420-2426 (1989).
  23. Lannergren, J., Westerblad, H. Force decline due to fatigue and intracellular acidification in isolated fibres from mouse skeletal muscle. J. Physiol. 434, 307-322 (1991).
  24. Westerblad, H. Spatial gradients of intracellular calcium in skeletal muscle during fatigue. Pflugers Arch. 415, 734-740 (1990).
  25. Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).
  26. Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ. Res. 107, 76-83 (2010).
  27. Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat. Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
  28. Shen, J. Deficiency of MIP/MTMR14 phosphatase induces a muscle disorder by disrupting Ca(2+) homeostasis. Nat. Cell Biol. 11, 769-776 (2009).
  29. Romero-Suarez, S. Muscle-specific inositide phosphatase (MIP/MTMR14) is reduced with age and its loss accelerates skeletal muscle aging process by altering calcium homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 504-513 (2010).
  30. Yazawa, M. TRIC channels are essential for Ca2+ handling in intracellular stores. Nature. 448, 78-82 (2007).
  31. Brotto, M. A., Nosek, T. M., Kolbeck, R. C. Influence of ageing on the fatigability of isolated mouse skeletal muscles from mature and aged mice. Exp. Physiol. 87, 77-82 (2002).
  32. Zhao, X. Compromised store-operated Ca2+ entry in aged skeletal muscle. Aging Cell. 7, 561-568 (2008).
  33. Pan, Z. Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29. Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).
  34. Zhao, X. Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).
  35. Renaud, J. M. Modulation of force development by Na+, K+, Na+ K+ pump and KATP channel during muscular activity. Can. J. Appl. Physiol. 27, 296-315 (2002).
  36. Brotto, M. A. Functional and biochemical modifications in skeletal muscles from malarial mice. Exp. Physiol. 90, 417-425 (2005).
  37. Brotto, M. A. Hypoxia and fatigue-induced modification of function and proteins in intact and skinned murine diaphragm muscle. Pflugers Arch. 440, 727-734 (2000).
  38. Smith, M. A., Reid, M. B. Redox modulation of contractile function in respiratory and limb skeletal muscle. Respir Physiol Neurobiol. 151, 229-241 (2006).
  39. Bagni, M. A., Cecchi, G., Colomo, F. Myofilament spacing and force generation in intact frog muscle fibres. J. Physiol. 430, 61-75 (1990).
<em>Ex vivo</em> Bedömning av kontraktilitet, fatigability och Alternans i isolerade skelettmuskler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, K. H., Brotto, L., Lehoang, O., Brotto, M., Ma, J., Zhao, X. Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (69), e4198, doi:10.3791/4198 (2012).More

Park, K. H., Brotto, L., Lehoang, O., Brotto, M., Ma, J., Zhao, X. Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (69), e4198, doi:10.3791/4198 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter