Ex Vivo Vurdering af kontraktilitet, udmattelse og Alternans i isoleret skeletmuskulatur

Summary

Vi beskriver en metode til direkte at måle muskel kraft, muskelkraft, kontraktile kinetik og udmattelse af isolerede skeletmuskulatur i et

Abstract

Beskrevet her er en metode til måling kontraktilitet af isolerede skeletmuskulatur. Parametre som muskelkraft, muskel magt, kontraktile kinetik, udmattelse, og bedring efter træthed kan fås til at vurdere bestemte aspekter af excitation-kontraktion kobling (ECC) proces, såsom ophidselse, kontraktile maskiner og Ca ^{2 +} håndtering evne. Denne metode fjerner nerve og blodforsyning og fokuserer på det isolerede skeletmuskulatur selv. Vi rutinemæssigt bruger denne metode til at identificere genetiske komponenter, der ændrer den kontraktile egenskab af skeletmuskulatur selvom modulere Ca ^{2 +} signalveje. Her beskriver vi en nyligt identificeret skeletmuskel fænotype, dvs mekaniske alternans, som et eksempel på de forskellige og rige information, der kan opnås ved anvendelse af in vitro muskulatur assay. Kombination af denne analyse med enkelte celleassays, genetiske tilgange og biochemistry assays kan give vigtig indsigt i mekanismerne i ECC i skeletmuskulatur.

Introduction

Skeletmuskulatur tillægger knogler i skelettet og generere kontraktile kræfter under styring af det centrale nervesystem. Excitation-kontraktionskoblingen (ECC) henviser til processen med at konvertere en elektrisk stimulus til en mekanisk reaktion. Ca ^{2 +-signalering} er en vigtig bestanddel af den kontraktile funktion i skeletmuskulaturen. Effektiv ^{Ca2 +-mobilisering} fra sarkoplasmiske reticulum (SR) er en vigtig komponent for ECC i muskelceller ^{1, 2,} og ændringer i intracellulær Ca ^{2 +-signalering} ligger bag den tilsvarende kontraktile dysfunktion hos en række muskelsygdomme ^3-5. Korrekt vurdering af muskulatur er afgørende og gratis til ^{Ca2 +} billeddannelse og andre assays til at få indblik i skeletmuskel funktion og ikke kun på den kontraktile plan, men også på den kinetiske plan. Kraft og hastighed kan også opnås at informere vigtige egenskabmuskel magt og status for ECC-processen under forskellige fysiologiske og patofysiologiske forhold.

Denne frugtbare forskningsfelt har en meget rig historie og mange teorier om muskelsammentrækning dukkede mere end to årtusinder ^6. Moderne muskel forskning sandsynligvis begynder i 1674-1682 med den mikroskopiske observation af cross-riller og myofibriller i muskelfibrene ved Leeuwenhoek ^6. Næsten et århundrede senere, observerede Luigi Galvani, at frøen muskel kontrakter kraftigt, når dens nerve er rørt med skalpel under en gnist udledning fra en fjern elektrisk maskine ^7-9. Kontraktion kan også fremstilles ved at forbinde benet nerve til musklen via en metalleder. Detaljerne i den komplekse elektrisk signaludstyr mekanisme anbefalet i Galvani blev til sidst formuleret af Hodgkin, Huxley og Katz i deres berømte ligning ^{10, 11,} der blev grundlaget for elektrofysiologi. De bemærkelsesværdige observationer af Ringer om virkningerne af ekstracellulær Ca ^{2 +} om kontraktilitet af frøen hjerte-og skeletmuskulatur ^12-15 repræsenterer det første store skridt i anerkendelsen af Ca ^{2 +} som en vigtig regulator af muskel kontraktilitet ^{16, 17.} Fra 1980 har til i dag en byge af opdagelser i musklen kontraktilitet feltet blev realiseret som følge af indførelsen af muskel kontraktilitet og udmattelse protokoller i murine skeletmuskulatur ^18. Jones og Edwards var den første til at foreslå, at lavfrekvente intermitterende træthed (anstrengelsesudløst reduktion i kraft) ¹⁹ var forbundet med ændringer i ECC maskiner og ikke den kontraktile apparat. I slutningen af 1980 og begyndelsen af 1990 er blev Kolkeck m.fl. ^20, Kolbeck og Nosek ^21, og Reid ²² ved hjælp af mellemgulvet muskler fra gnavermodeller for at studere virkningerne af theophyllinere, cortiosterone, og frie radikaler på skeletmuskulaturen kontraktilitet, mens Brooks og Faulknis var de første til at rapportere om målinger af gentagne kraft og effektmålinger i hurtige-og langsomme-muskler fra mus ^22. Desuden var Lannegren, Westerblad, Lamb, og Westerblad den første til direkte linke ex vivo kontraktilitet med intracellulær Ca ^{2 +} regulering og begyndte at sætte spørgsmålstegn rolle acidose i muskel træthed ^{23, 24.}

Vores laboratorier har bidraget betydeligt siden begyndelsen af 2000 har til forståelse af hidtil ukendte gener med modulerende og regulatoriske roller på muskel ECC med kritiske roller i muskel kontraktilitet, udmattelse, og aldring ved hjælp af en kombination af intakte mus muskulatur undersøgelser, intracellulær Ca ^{2 +-overvågning} i intakte og flået muskelfibre og molekylær-genetiske manipulationer ^{3-5, 25-29.}

Her har vi detaljeret den eksperimentelle protokol til måling af kontraktilitet af murine isolerede soleus og extensor digitorum longus (EDL) muskler, som svarer til en hovedsagelig langsomt oxidativ (type I og IIa muskelfibre) og en hovedsagelig hurtigt glyocolytic muskel (type IIb og IIx muskelfibre) med forskellige kontraktile egenskaber. I denne protokol blev intakte muskel-sene komplekser isoleret og badet i en ADI PowerLab Radnotti kammer, der leveres med enten ren ilt eller en blanding af ilt (95%) og CO ₂ (5%). Kontraktile kræfter blev genereret af elektriske stimulationer fra en Grass stimulator og detekteret ved hjælp af en krafttransducer, der blev integreret med en ADI PowerLab/400 system, så tilpasning af makro rutiner til at styre erhvervelse, indsamling, digitalisering og opbevaring af data. Denne konfiguration kan måle muskelkraft, muskelkraft, og den kraft vs frekvensforhold, muskeltræthed, overvindelse af muskeltræthed, hastighed og samlede kinetiske egenskaber af muskelkontraktion. Desuden kan virkningerne af lægemidler på muskelsammentrækning overvåges gennem disse eksperimenter. Fordelene ved denne metode lå i fjernelse af de neuronale og vaskulære komponenter væk fra skeletmuskel, hvilket muliggør vurdering af de iboende egenskaber kontraherende muskel. Desuden tillader ex vivo kontraktilitet assays manipulation af det ekstracellulære miljø omkring de isolerede muskler, hvilket muliggør anvendelsen af farmakologiske manipulationer af forskellige ion permeationsforøgende kanaler og transportere for at definere deres fysiologiske roller for skeletalmuskelfunktion.

Denne ex vivo-system har givet os mulighed for nylig opdage en særskilt alternan adfærd i visse mutante muskel præparater, som er forbundet med ændret ^{intracellulære} Ca2 ⁺ håndteringsegenskaber ^4. Alternans defineres som svingende burst episoder af kontraktil kraft under tilbagegangen fase af trættende profil. Under disse begivenheder kontraktile kræfter momentant øges ud over det tidligere niveau af force dnder trættende stimulation, måske fordi enten mere Ca ^{2 +} bliver frigivet eller den kontraktile maskineri er blevet mere følsom over for Ca ^{2 + 30.} Behandling af cyclopiazonic acid (CPA), en reversibel blokering af sarkoplasmiske-endoplasmatiske reticulum calcium ATPase (SERCA), koffein, en agonist af ryanodine kanal (RyR) og gentagen trættende stimuleringer kan alle inducere mekaniske alternans ^4, tyder på, at alternans er direkte relateret til modulation af EF koblingen processen. Demonstration af fremgangsmåden til at inducere og optage mekaniske alternans i in vitro kontraktilitet opsætning fungerer som et eksempel for at vise de forskelligartede eksperimentelle parametre, der kan opnås med dette system eller lignende dem, baseret på individuelle forskningsinteresser.

Denne metode kan være af interesse for forskere studerer muskel fysiologi. Lignende opsætning kan også anvendes til isolerede skelet muscle-tendon/ligament komplekser fra andreanatomiske steder, såvel som for enkelte fibre og muskelstrimler.

Protocol

Opløsningen sammensætning:

2,5 mM ^{Ca2 +} Tyrode-opløsning: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2,5 _mM CaCl2, 2 mM _MgCl2 og 10 mM glucose

0 mM ^{Ca2 +} Tyrode-opløsning: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, ₂ mM MgCl2, 0,1 mM ethylenglycol-tetraeddikesyre (EGTA) og 10 mM glucose

Bemærk: badopløsningen skal være mættet med 100% _O2, hvis anvendelse af den ovennævnte opløsning, men med _95% O2 med _5% CO2, hvis anvendelse bicarbonatbaserede buffere til at holde pH konstant. 2,5 mM ^{Ca2 +} tilsættes til badning buffer at rekapitulere niveauet af ^{Ca2 +} fundet i det ekstracellulære rum og 10 mM glucose er vigtigt, eftersom mitokondrier stadig fungerer i disse muskler til kontinuerligt producerer ATP i nærvær af glucose.

1. Etablering ex vivo Kontraktilitet eksperiment ved hjælpADI PowerLab System

1. En skematisk tegning af en 4-kanals ex vivo kontraktilitet system er vist i figur 1.. En computer styrer en stimulator at generere firkantpulser, som er filtreret af karantænefaciliteterne at opnå et par af platintråd omgiver hver isoleret muskel-senen komplekset. Dette kaldes også felt stimulation. Sammentrækning af musklen der reagerer på stimulering blev afføles med en krafttransducer, det genererede signal, som blev amplificeret, filtreret og overført tilbage til computeren af ​​en A / D konverter (signalbehandling). Signalet derefter digitaliseret og kan gemmes til senere analyser.
2. At forberede en ex vivo kontraktilitet eksperiment, første drejning på banen stimulator, A / D-konverter (i dette tilfælde ADI Power Lab) eller en tilsvarende software (f.eks LabView), efterfulgt af computeren.
3. Åbn Chart4 software (eller anden software version, kompatibel med systemet) og initiatEA 4-kanals opgave, rigtig kommunikation af software og hardware er angivet ved at starte konfiguration af hardware, og START-knappen på software bliver operationelt (live), den 4-kanals funktion muliggør samtidig måling af et par muskler fra et vildtype og et mutante mus eller 2 EDL og 2 soleus muskler fra samme mus, og det kan anvendes til andre muskler, såsom membranen (hele membran, hemi-membran eller diafragma muskelstrimler) og tibialis anterior; Det kan også anvendes til hjertemuskelceller præparater og for bundter af muskler, især hvis man anvender rotte-muskler. I dette tilfælde størrelsen af ​​musklerne kan begrænse oxygendiffusion så muskel bundter er således et bedre valg. Dog er ekspert dissektion teknikker der kræves for muskel bundt præparater.
4. Kalibrering af krafttransducer: dette er at sikre sammenligneligheden af ​​datasæt genereret på forskellige kanaler og på forskellige tidspunkter. Første start optagelse, Sequentially hænge en 1-g, 2-g og 5-g vægte på prøven lund af krafttransducer, stoppe optagelsen, beregne tilsvarende ændringer i mV vist i hver kanal af Chart4 software, plotte ΔmV og vægten til at kontrollere linearitet og bestemme omregningsfaktoren mellem mV og g kraft. Vi anbefaler, at udføre disse kalibreringer enten ved begyndelsen eller ved slutningen af ​​hvert eksperiment for at sikre, at en specifik kalibrering opnås for hver enkelt eksperiment.
5. Kontrollere korrekt forbindelse af Teflon-rør, dræne væske til stede i vævsbadet rør, vaskes kamrene tre gange eller mere med ddH ₂ O og fyldes med 20 ~ 25 ml 2,5 mM ^{Ca2 +} Tyrode-opløsning. ^{Ca2 +} og glucose er tilvejebragt i badopløsningen at hjælpe med at opretholde cellemembranerne, optimal ^{Ca2 +-belastning} af SR, og en let tilgængelig energikilde for generering af ATP i selve musklen, idet mitokondrier forbliver fuldt funktionelt i disse præparater.
6. Kontrollere korrekt forbindelse af ilttilførslen, åbne oxygen tank, og justere oxygen flow at tilvejebringe diffusiv og homogen bobling af kammeret. Iltindholdet kan let bestemmes som en funktion af kontraktil kraft som funktion af tid. En flowmåler kan også installeres, især hvis forskerne er interesseret i at studere virkningerne af iltmangel eller hyperoxia. Hvis muskler bliver hypoxisk, kraft naturligt aftager. Mens hyperoxi også kan skade muskler, men dens virkninger kan være sværere at blive opdaget, fordi de fleste eksperimenter udføres under kunstige hyperoxisk betingelser for at kompensere for manglen på en normal blodtilførsel til musklerne. I de fleste systemer er det muligt at boble de forskellige kamre med den samme mængde oxygen blot ved styring af strømmen af ​​oxygen til hvert kammer konstant.
7. Justere følsomheden af ​​alle kanaler for at sikre den maksimale kraft opløsning uden at mætte kanalen. Kanal følsomhed kan variere betydeligt som fungere end dyrets alder, eksperimenterende temperatur, genetiske manipulationer, muskel størrelse, mus stamme, og evnen til eksperimentatoren til korrekt dissekere muskler fri for skader. Det er vores erfaring, ved måling soleus kontraktile kraft følsomheden varierer fra 0,5 til 10 mV / cm, medens i tilfælde af EDL, kan følsomheden variere fra 1 til 20 mV / cm.
8. En protokol for trættende stimulation skal etableres. I Chart4 softwaren en makro, kan anvendes. For at programmere en ny Makro: i Chart4 softwaren, start måling klik, og klik derefter på Makro, Makro Kommando, starte optagelsen begynder gentage, skal du vælge den ønskede stimulus frekvens, og derefter ende gentagelse. For en ækvilibreringstid protokol, er stimulus gentages hvert minut i 30 minutter og trættende protokol, er stimulus gentages hver 2 sekunder i 5 minutter. Disse ændringer i periodiciteten af ​​stimuleringen, direkte påvirker arbejdscyklus, som også er en funktion af stimulation varighed. Disse parametre kan varieres for at teste forskellige Aspects af kontraktilitet og udmattelse.

2. Forberedelse Intakte Muskel Bundles

1. EDL dissektion: mus ofres efter NIH retningslinjer og IACUC institutionelle dyr protokoller. Musen aflives ved cervikal dislokation. Mus derpå anbragt ved den laterale position. EDL muskel er en hurtigt glycolytisk muskel med sart rosa-hvid farve. Det er omkring 10-13 mm lang og vejer 8-11 mg i vildtype C57BL / 6 mus. EDL har de funktioner udvide tæer 2-5, og dorso-bøjning foden ved anklen. Det er innerveret af peronealnerve. At dissekere EDL, at en overfladisk incision i huden, og skåret åbne fascia mellem den anteriore tibialis og den bageste muskel gruppe, og lokalisere oprindelse (proximale), hvor ligament er forbundet til den laterale condylus i tibia og overlegen 3/4 af den forreste overfladen af ​​fibula (interosseous margin). Skær ledbånd med sarte ophthalmiske saks så distalt som muligt fra den muskel, hvilket procedure frigiver den proximale oprindelse EDL muskler. Hold ledbånd med en stump pincet og træk langsomt at frigøre EDL. Det kan være nødvendigt at skære noget af perimysium omkring de EDL og andre musklerne omkring EDL, et skridt, der er kritisk, da skader kan opstå på EDL muskler under denne vanskelige trin. Dernæst gå til indsættelsen region, hvor de fire distale sener indsætte i de midterste og distale phalanges af cifre 2-5. Skær sener så vidt muligt fra muskler.
2. Overfør det isolerede EDL muskler i en dissektion skål indeholdende isotonisk Tyrode-opløsning. Nogle mutante, transgene og knockout dyremodeller har meget skrøbelige muskler og udnyttelsen ^af Ca2 ^+-fri Tyrode-opløsning, er nødvendig for at forhindre ^{Ca2 +-muskelskader} før kontraktilitet målinger. Dernæst anvendes en kirurgisk knude at binde tæt ved begge ender af den EDL muskler som distalt fra musklen som muligt. Et godt mål er at binde lidt over midten af ​​pblandede langs af ligament eller senen. Brug 6-0 størrelse sutur for denne procedure, og overføre EDL musklen til O _2-mættet vævsbad kammer, montere muskel på prøven rillen i krafttransducer og papirvarer krog i bunden af badet kammeret, gentages Fremgangsmåde til det andet ben. Vi er også begyndt at anvende en ny fremgangsmåde, der holder musklerne med klemmer i stedet for suturer. Hvis det vigtige mål er at undersøge kinetiske egenskaber og / eller for at opnå muskelkraft, anbefales det, at sutur være så kort som muligt, eller suturen erstattes med en metalstang.
3. Soleus dissektion: soleus er en overvejende langsomt oxidativ muskel med rig rød farve. Det er ~ 1 mm kortere end EDL men vejer lidt mere end EDL. Det er innerveres af den tibiale nerve og den udfører virkningen af ​​plantar bøjning foden. At dissekere de soleus, åbne den posteriore laterale side af benet, skubber musculus gastrocnemius som normalt dækker soleus, og identificerer musklen med mørk rød farve. Ved begyndelsespunktet (proximale), skæres ledbåndene forbinder til den proximale halvdel af posterior tibia langs soleal linje og proximale tredjedel af den bageste fibula, dernæst ved isætning (distal), skåret hasesenen at indsættes i den bageste calcaneus. Forsigtigt fri op soleus og korrekt montere soleus muskel i badkammeret som for EDL.

3. Måling kontraktilitet af de isolerede skeletmuskulatur

1. Når musklerne er monteret i de enkelte vævsbad kamre, skal du starte optagelsen. Mest tilsvarende systemer tillader nulstilling af grundlinjen af ​​force optagelse. Denne funktion er normalt forbundet med forstærkeren, i det konkrete tilfælde med PowerLab systemet som funktion af broen forstærkeren. Det letter observation af baseline ændringer og giver en bekvem måde for alle muskelsammentrækninger, der skal analyseres fra nul. Isolerede muskler er derefter stimuleret med squared-bølge pulserder kan variere bredt som funktion af kammerets størrelse, platin ledninger tykkelse, afstanden mellem trådene, og selv sammensætningen af ​​den eksperimentelle opløsning. Vi har ansat strøm på 60 mA (vi har bemærket, at strømme over 350 mA lader til at være til skade for muskel præparater) og stimulerende tog på 350, 500 og 1000 ms, afhængig af målene for en særlig protokol. De enkelte firkantbølgepulserne burde have varighed spænder fra 0,3 til 1 ms.
2. Det næste trin er at vælge en frekvens for stimulering stand til at producere et fusioneret tetanisk stimulation (ex: ~ 100 Hz for at muliggøre produktion af maksimal styrke i EDL muskler og ~ 60 Hz i soleus-muskel), medens langsomt og forsigtigt strække muskler til at identificere optimal længde af disse muskler. Da muskler omhyggeligt strækkes, vent 30 sekunder og stimulere ved 100 Hz; vente 30 sekunder og strække igen, og derefter gentage stimulation, indtil det punkt, hvor kraften ikke stiger længere.
3. Disse muskler har undergone væsentlige ændringer i miljøet. Det anbefales, at musklerne får lov til at tilpasse sig det nye miljø, et skridt i vores protokoller kaldes "ækvilibrering". Ækvilibrere disse muskler på samme frekvens af stimulation anvendes under strækningen fase, 100 Hz for 20-30 min, indtil mindst 5 på hinanden følgende tetaniske sammentrækninger er helt stabil (ikke reducere, ikke stigende, stabil baseline). Hyppighed af de stimulerende togene (100 Hz, 500 ms varighed, 1 ms individuel puls) under ligevægt er 1 min, hvilket svarer til en arbejdscyklus på 1,66%, en ikke-trættende stimulation. I denne sammenhæng betyder en arbejdscyklus på 1,66%, at over i alt 100%, der muskler arbejder 1,66% af tiden, ved at øge arbejdscyklussen musklerne i sidste ende kan induceres til træthed. Hvis ellers muskler sunde, vildtype mus viser en anstrengende profil i denne ækvilibreringsperiode, er det muligt, at de blev beskadiget under dissektion, er hypoxi forekommer i kamrene / muskler, eller overdreven electrolysis gennem de stimulerende elektroder genererer frie radikaler. Westerblad har tidligere foreslået, at strømme større end 400 mA inducere dannelsen af frie radikaler ^23. Naturligvis er den højeste kvalitet platin foreslås, idet andre metaller sikkert vil føre til dannelse af frie radikaler og muskel toksicitet.
4. Opnå den kraft vs frekvens forhold (FF) ved at stimulere musklerne med følgende stimulation frekvenser: 1-140 Hz (i intervaller på 5-10 Hz), med en hyppighed på 30-60 s, når du udfører eksperimenter ved 25 ° C. Når du udfører eksperimenter ved 37 ° C, udvide FF til højere frekvenser på op til 300 Hz for mellemgulvet muskler, 180-200 Hz til soleus og 220-250 Hz til EDL. Dernæst identificere hyppigheden af stimulation, der genererer maksimal tetanic kraft (T _max) og ca ½ maksimal tetanic kraft (1/2 T _max), nogle gange er det svært at opnå den nøjagtige ½ _Tmax for både EDL og tungeos muskler hvis kun én stimulator kilde bliver brugt, på grund af de iboende forskelle mellem disse muskler. En mulig løsning er at identificere en frekvens, der frembringer 30-70% af _Tmax. Begrundelsen for disse frekvenser af stimulation er, at T _max giver vigtig information af kontraktile maskiner events / graduering, mens ½ T _max indeholder oplysninger mere relevante for Ca ^{2 +} regulering og ECC-processen. For at være sikker på, at maksimal kraft er opnået, kan 10-20 mM koffein sættes til badopløsningen samtidig stimulere musklen. Hvis maksimal kraft er naaet, vil styrke ikke stige i nærværelse af koffein. FF forskydes til højre og kræfter har tendens til at være lidt højere ved højere eksperimentelle temperaturer. Ved hjælp af dette system kan enhver anden stimulering frekvenser udføres om ønsket. Den tydelige kontraktile profil af en hurtig glykolytisk EDL muskler og en langsom-oxidativ soleus muskel ervist i figur 2.
5. Efter ækvilibrering træthed musklerne på ½ T _max for 5 min, med stimulation interval på 2 s og 25% arbejdscyklus (figur 3). Denne specifikke trættende protokol menes at bedre at afspejle bidrag sarkoplasmiske reticulum Ca ^{2 +} overgang til muskel kontraktilitet ^31.
6. Opsaml musklen på ½ _Tmax for 30 min, eller indtil styrken er stabil, ved 1 min interval. En yderligere trættende protokol kan udføres nu ved hjælp af T _max stimulation, som menes at afspejle status for den kontraktile maskiner ^31. En anden mulighed er at udvide anstrengende protokol til interkalerer stimulerende tog, der genererer T _max og ½ T _max under træthed og inddrive musklerne med samme type stimulation.
7. Gentag FF som beskrevet i trin 3.4, begrundelsen er, at fænotypiske forskelle mellem different stammer, sygdomsmodeller eller medicinske behandling kan observeres ved at analysere FF før og efter træthed. Vi har for eksempel tidligere rapporteret, at efter materialesvækkelse FF af unge vildtype muskler forskydes mod venstre, mens der i muskler fra ældede muskler, er den forskudt til højre, hvilket tyder differentielle modulatoriske virkninger af skeletmuskel træthed som en funktion af ældning.
8. At undersøge bidraget af ^{ekstracellulær} Ca2 ⁺ optagelse i muskulatur, kan badopløsningen ændres i en opløsning, der ikke indeholder ^{Ca2 +,} men 0,1 mM EGTA (0 ^mM Ca2 ⁺ Tyrode-opløsning) ^32. Alternativt kan forskellige blokkere af store-betjent kanal anvendes i badopløsningen. Som eksempler kan nævnes: 2-aminoethyl diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-bis (trifluormethyl) pyrazol 2 (BTP-2) og azumolene, etc. ^{33, 34.} Koffein kan anvendes til at undersøge funktionen af ​​ryanodine receptoren, og KCl kan anvendes til at vurdere den samlededepolarisering egenskaber af disse præparater. Andre medikamenter kan også anvendes til at undersøge den vigtige modulering af kraft under træthed af Na ^+, K ⁺ og Na ^{+-K +} pumper ^35. De fleste af disse stoffer har relativt små størrelser og synes at hurtigt diffundere ind i disse muskel præparater som det fremgår af deres umiddelbare effekter. Manglen på en effekt ved en given medicin betyder ikke nødvendigvis, at lægemidlet er ineffektiv og yderligere tests med doser langt højere end den, der anvendes i enkelt muskelfiber eksperimenter er undertiden nødvendigt.
9. En unik anvendelse af denne ex vivo-system ført til den nylige opdagelse af mekaniker alternans i Tric-a ^{- / -} muskler ^{4, 30.} Alternans defineres som svingende burst episoder af kontraktil kraft under tilbagegangen fase af trættende profil. Under disse begivenheder kontraktile kraft kan momentant øges ud over det tidligere niveau af kraft undertrættende stimulation fordi det enten mere Ca ^{2 +} bliver frigivet eller den kontraktile maskineri er blevet mere følsom over for Ca ^{2 +.} Den kontraktile kraft udbrud skal være 50% højere end den tidligere kraft, og udbruddene bør ses mindst 10 gange i løbet af 5-min træthed stimulation proces. Mekaniker alternans er ikke almindelige i skeletmuskel fra vildtypemus, men kan ses i nogle mutante muskler med forstyrrelse af intracellulær Ca ^{2 +-signalering} fremgangsmåde, såsom den trimere Intracellulær Cation Channel Type A (triske-a) ^{- / -} muskler ^4. Mekaniker alternans kan induceres ved udmattende stimulationer, behandling med koffein og cyclopiazonic acid (CPA), se figur 3 for en repræsentativ registrering af disse mekaniske alternans. Karakteren af ​​dette fænomen er ganske spændende, hvorimod en muskel, der er trættende synes i stand til kortvarigt producere mere kraft. I vores tidligere publikation, Kombineret med enkelt celle ^{Ca2 +} analyse viser, at forekomsten af alternans er et resultat af SR ^{Ca2 +-overbelastning} og ustabil SR. Vi mener, at en dybere forståelse af alternans kan føre til en bedre forståelse af ECC-processen.
10. Ved afslutningen af ​​eksperimentet måle længden og vægten af ​​individuelle muskler med kalibreret tykkelse og analytisk vægt, flash nedfrosset musklen i flydende nitrogen og gem ved -80 ° C, idet biokemiske analyser kan udføres i disse muskler. Disse muskler kan også være mekanisk flået for detaljeret sondering af ECC-processen, eller være kemisk-flås til bestemmelse af væsentlige kontraktile egenskaber i fravær af ECC reguleringsmekanismer.
11. Optaget muskelkraft (mV) omdannes først til gram tvinge baseret på kalibreringsresultaterne og derefter normaliseret til den fysiologiske tværsnitsareal (PCSA) under anvendelse af følgende formel: muskelkraft (N / cm ²⁾ = (force (g) x muskel length (cm) x 1,06) / (muskel vægt (g) x 0,00981) ^5,36. Alternativt kan muskelkraft normaliseres til totalt protein eller totalt actin indhold af den enkelte muskler ved hjælp af Bradford-proteinassay / Commossie blåfarvning kvantificering. Under visse betingelser hvorimod muskelmasse kan blive hårdt ramt på grund af sygdomme, ældning, kan medicinske behandlingsmetoder, kraft normalisering baseret på muskelmasse, protein og / eller actin indhold giver en mere stabil udlæsning.

4. Repræsentative resultater

Typisk stuetemperatur kontraktile kræfter EDL-og soleus reagerer på lav-, mellem-og højfrekvente stimuli vist i figur 2. EDL kontraktion induceret af 5 Hz stimulus forbliver som individuelle ryk på grund af den hurtige virkning af SERCA Ca ^{2 +} ATPase og den iboende ^{Ca2 +} følsomhed egenskaber af kontraktile maskiner, medens soleus kontraktion med 5 Hz begynder at smelte (langsommere ATPase end højere følsomhed over for Ca ^{2 +} fra den kontraktile maskiner), men peak kræfter er stadig adskilt. Ved 20 Hz stimulation, er EDL kontraktioner delvist fusioneret medens den for soleus danner en fuldstændig kondenseret tetanisk kraft. På hyppigheden af stimulation, der producerer T _max stimulation, som kan variere ved stuetemperatur fra 80 til 110 Hz for EDL og 60-90 Hz for soleus, hurtig upstroke og hurtig lempelse af tetanic kraft i EDL er noteret, hvilket er i strid med de langsomme egenskaber soleus-muskel. Figur 2B viser, at kraft-frekvenskurven for EDL muskel er forskudt til højre i forhold til soleus-muskel, hvilket indikerer, at soleus muskler er mere følsomme for ^{Ca2 +-frigivelse} ved en given frekvens af stimulering på grund af tilstedeværelsen af ​​den langsomme myosin-og troponin-isoformer. Desuden reagerer den kontraktile maskiner med relativ større kraft i soleus-muskel ved lavere frekvenser. Figur 3 visersa normal træthed profil EDL (øverste panel) og soleus-muskel (midterste panel). Bemærk hurtigere fald i kontraktil kraft under trættende stimulation i EDL muskler og den højere fald i kraft ved udgangen af ​​den 5-min træthed protokol. Endelig blev en typisk mekanisk alternan profil af en mutant muskel vist i figur 3 (nedre felt), som blev defineret som momentane kraft udbrud i den faldende fase af muskeltræthed profil. Den kontraktile kraft udbrud skal være 50% højere end den tidligere kraft, og udbruddene bør ses mindst 10 gange i løbet af 5-min træthed stimulation proces.

Figur 1. Skematisk tegning af et 4-kanal ex vivo kontraktilitet system. Firkantpulser er genereret af en computer, der styrer en Grass stimulator. To stimulering isolation enheder filtrere stimulus stammer fra eltrisk stimulator enheden for at fjerne eventuelle svingninger i det elektriske signal og etablere en stabil firkantbølgesignal. Det filtrerede elektrisk signal sendes til de 4 badning kamre indeholdende platin trådelektroder omgiver hver isoleret muskel. I sidste ende er det den nuværende tværs af de to elektroder (kaldet felt stimulation), der genererer en handling potentiale, inducere sammentrækning af musklen. Denne sammentrækning detekteres ved en bestemt krafttransducere, overføres til broen forstærkere, filtreret, gennemsnit (signalbehandling) og registreres af computersoftware via en A / D konverter.

Figur 2. . Repræsentative kontraktile kræfter EDL-og soleus (A) Kontraktile kræfter induceret af 5 Hz (øverste panel), 20 Hz (midterste panel) og maksimal tetanisk kraft (T _max) (nedre felt), indløb viser et spor af kontraktil kraft af en beskadiget muskel, (B) enrepræsentativt sæt viser de enkelte sammentrækninger af en kraft versus frekvens forholdet i EDL (FF, øverste panel) og den plottede kurve følge af FF (nederste panel). se større tal .

Figur 3. Repræsentative trættende profil og mekaniske alternans. En typisk hurtig nedgang trættende profil EDL muskler (øverste panel) og det langsomme fald trættende profil soleus-muskel (midterste panel). Trættende stimulation fører til fremkomsten af mekaniske alternans i en triske-a ^{- / -} muskler med forstyrret ^{Ca2 +} håndteringsegenskaber (nederste panel).

Discussion

Måling af kontraktile kraft og udmattelse er vigtig for den samlede vurdering af skeletmuskulatur funktion. Hovedformålet med denne analyse er at identificere forandringer i muskelkraft og trættende egenskaber under visse patologiske tilstande, såsom sarcopenia og muskeltræthed, og for at afprøve effekten af ​​narkotika / reagenser på muskel kontraktilitet. Eftersom muskelkraft er tæt forbundet med ^{intracellulære} Ca2 ⁺ release, ^{ekstracellulær} Ca2 ⁺ indgang og krydstale mellem disse to, kan vi også samle oplysninger om ^{Ca2 +} signalering status i skeletmuskel anvendelse af denne fremgangsmåde. Her viste vi et unikt fænotype betegnes "mekaniker alternans", når svingende burst episoder af kontraktile kraft i tilbagegang fase af anstrengende profil blev set under et overbelastet og ustabil SR. Man kunne forvente, at en bred vifte af skeletmuskulaturen fænotyper herunder ændret kraft, FF, udmattelse, kontraktile kinetik og inddrivelse ABility efter træthed kan påvises under anvendelse af in vitro kontraktilitet assay under forskellige patologiske tilstande.

Det mest kritiske trin for dette assay er at isolere hele intakte muskler (eller muskel bundter og muskelstrimler) der er fri for skader. Et sådant mål er lettere at opnå i hele muskler præparater. Her viser vi, at efterlade nok ledbånd og sener til at binde hele muskler er meget vigtigt at forhindre, at binde selve musklen, hvilket fører til muskelskader og i sidste ende muskel død. Desuden er konstant gennembobling af opløsninger med enten 100% _O2 for HEPES-løsninger eller en blanding af _O2 og _CO2 til bicarbonatbaserede opløsninger kritisk. Forebyggelse af hypoxi og hyperoxi er vigtigt, mens et flowmeter kan anvendes. Vi har også brugt i visse situation, en bestemt enhed, der måler opløst ilt i væsker badning vævet. Under visse forhold, hvor musklerne er more udsat for skader, vil håndtere det isolerede muskler i en ^{Ca2 +-fri} opløsning, før montering på krafttransducer bidrage til at slappe af musklen og minimere muskelskader før forsøget. Lægemidler, såsom 2,3 - butandion monoxime (BDM) eller N-benzyl-p-toluen-sulfonamid (BTS) kan også tilsættes under dissektion for at minimere skader, især hvis muskel bundter eller muskel strimler fremstilles, som er fælles for kontraktilitet undersøgelse af membranen ^{37, 38.} Under optagelse vil beskadigede præparater skaber normalt mindre kraft og har øget baseline støj og svingninger (se indløb i figur 2), og resultaterne fra disse muskler kan udelukkes fra analysen datasættet, medmindre det er en del af forsøget på at analysere svarene fra beskadigede muskler. Et andet punkt, der nemt kan ignoreres eller glemt, er, at den elektriske stimulation selv kan være en kilde til toksicitet for muskler. Vi anbefaler periodisk rengøring elektroderne og chambis med en 1% hypochloritopløsning at fjerne eventuelle forureninger, protein rester, oxidation akkumulering etc. Særlige forsigtighedsregler kræves også ved justering af længden af ​​den monterede muskel. Det er vigtigt at strække i små skridt for at undgå over-stretching som den optimale tilpasning af tynde og tykke filamenter er kritisk for en effektiv cross-bridge funktion ^39. Desuden anbefales det, at den relative position af de monterede muskel bundter til feltet stimulation elektroder holdes konstant og rettet ind blandt alle kanaler for at sikre, at samme mængde elektrisk strøm anvendes til de isolerede muskler. Under vores forsøgsbetingelser, forbliver muskler fra unge vildtypemus stabilt i mere end 12 timer, og endnu længere, hvis antibiotika, 0,2% FBS og aminosyrer sættes til badopløsningen.

Med omhu og ordentlig kontrol, kan dette ex vivo-system giver oplysninger om sammenhængen mellem Ca ^{2 +} signalering af end muskelkontraktion uden den kompleksitet af vaskulaturen, endokrine og nervesystem. Eksempelvis ⁺ tab af afhængighed af ^{ekstracellulær} Ca2 er en signatur af ældet skeletmuskel medens ^SR Ca2 ⁺ release dysfunktion giver normalt lavere kontraktile kraft og hurtig trættende profil. Som exampled her, udseende af mekaniske alternans indikerer ustabil SR, hvilket vi mener er ikke begrænset til pædiatriske-a ^{- / -} muskler, men også i andre skeletmuskulatur under patologiske tilstande genererer SR ^{Ca2 +-overbelastning} og ustabilitet. Denne opsætning giver mulighed for direkte adgang af musklen for forskellige fysiologiske og farmakologiske manipulationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5