Ex Vivo Vurdering av kontraktilitet, trettbarhet og Alternans i isolerte skjelettmuskulatur

Summary

Vi beskriver en metode for å direkte måle muskelkraft, muskelkraft, kontraktile kinetikk og trettbarhet av isolerte skjelettmuskulatur i en

Abstract

Beskrevet her er en metode for å måle kontraktilitet av isolerte musklene. Parametere som muskel styrke, muskel kraft, kontraktile kinetikk, trettbarhet, og restitusjon etter utmattelse kan fås til å vurdere konkrete aspekter ved eksitasjon-kontraksjon kopling (ECC) prosess som oppstemthet, kontraktile maskiner og Ca ^{2 +} håndtering evne. Denne metoden fjerner nerve og blod forsyning og fokuserer på den isolerte skjelettmuskulatur selv. Vi rutinemessig bruker denne metoden for å identifisere genetiske komponenter som endrer kontraktile eiendom skjelettmuskulatur om modulerende Ca ^{2 +} signalveier. Her beskriver vi en nylig identifisert skjelettmuskulatur fenotype, dvs. mekaniker alternans, som et eksempel på de forskjellige og rike informasjon som kan oppnås ved å bruke in vitro muskelen kontraktilitet analysen. Kombinasjonen av denne analysen med encellede analyser, genetiske metoder og biochemistry analyser kan gi viktig innsikt i mekanismene for ECC i muskel-skjelettlidelser.

Introduction

Skjelettmuskulatur feste til bein i skjelettet og generere kontraktile styrker under kontroll av det sentrale nervesystemet. Eksitasjon-kontraksjon kopling (ECC) refererer til prosessen med å konvertere en elektrisk stimulans til en mekanisk respons. Ca ^{2 +} signalering er en essensiell komponent av den kontraktile funksjon i skjelettmuskel. Effektiv Ca ^{2 +} mobilisering fra sarcoplasmic retikulum (SR) er en viktig komponent for ECC i muskelcellene ^{1, 2,} og endringer i intracellulær Ca ^{2 +} signalering ligger til grunn for tilsvarende kontraktile dysfunksjon i en rekke muskelsykdommer ^3-5. Riktig vurdering av muskel kontraktilitet er viktig og gratis til Ca ^{2 +} bildebehandling og andre analyser for å få innsikt i skjelettmuskulatur funksjon, ikke bare på den kontraktile nivå, men også på den kinetiske nivå. Kraft og hastighet kan også fås til å informere viktig egenskapmuskelkraft og status for ECC-prosessen under ulike fysiologiske og patofysiologiske forhold.

Dette fruktbar forskningsfeltet har en meget rik historie og mange teorier om muskelkontraksjon dukket opp over to årtusener ^6. Moderne muskel forskning begynner trolig i 1674-1682 med mikroskopiske observasjon av kryss-striations og myofibrils i muskelfibre av Leeuwenhoek ^6. Nesten et århundre senere, observerte Luigi Galvani at frosk muskel kontrakter kraftig når det nerve er berørt med skalpell under en gnist utslippet fra et fjernt elektrisk maskin ^7-9. Sammentrekning kunne også bli produsert ved å koble beinet nerve til muskel gjennom et metall dirigent. Detaljene i komplekse elektriske signaler mekanisme orde av Galvani ble til slutt formulert av Hodgkin, Huxley og Katz i sin berømte ligning ^{10, 11} som ble grunnlaget for elektrofysiologi. Den bemerkelsesverdige observasjoner av Ringer om virkningene av ekstracellulært Ca ^{2 +} på kontraktilitet av frosk hjertet og skjelettmuskulaturen ^12-15 representerer det første store skrittet i erkjennelsen av Ca ^{2 +} som en viktig regulator av muskel kontraktilitet ^{16, 17.} Fra 1980-tallet til i dag en serie av funn i muskel kontraktilitet feltet ble realisert på grunn av innføring av muskel kontraktilitet og trettbarhet protokoller i murine skjelettmuskulatur ^18. Jones og Edwards var de første til å foreslå at lav frekvens intermitterende tretthet (anstrengelsesutløst reduksjon i kraft) ¹⁹ var assosiert med endringer i ECC maskiner og ikke kontraktile apparat. På slutten av 1980-tallet og tidlig 1990-tallet, ble Kolkeck et al ^20, Kolbeck og Nosek ^21, og Reid ²² bruker blender muskel fra gnagere modeller for å studere effekter av teofylliner, cortiosterone, og frie radikaler på skjelettmuskulatur kontraktilitet, mens Brooks og Faulkneh var de første til å rapportere om målinger av gjentatt kraft og effektmålinger i raskt og slow-muskler fra mus ^22. I tillegg var Lannegren, Westerblad, Lamb, og Westerblad den første til å direkte koble ex vivo kontraktilitet med intracellulær Ca ^{2 +} regulering og begynte avhør rolle acidose i muskeltretthet ^{23, 24.}

Våre laboratorier har bidratt vesentlig siden tidlig 2000-tallet mot forståelse av nye gener med modulerende og regulatoriske roller på muskel ECC med kritiske roller i muskel kontraktilitet, trettbarhet, og aldring ved hjelp av en kombinasjon av intakte mus muskel kontraktilitet studier, intracellulær Ca ^{2 +} overvåking i intakt og skinned muskelfibre og molekylærgenetiske manipulasjoner ^{3-5, 25-29.}

Her har vi detaljert forsøksprotokollen for måling kontraktilitet av murine isolerte soleus og extensor digitorum longus (EDL) muskler, som svarer til et hovedsakelig langsomt oksidativt (type I og IIA muskelfibre) og en hovedsakelig raskt glyocolytic muskel (attraksjon IIb og IIx muskelfibre) med distinkte kontraktile egenskaper. I denne protokollen, ble intakte muskel-sene komplekser isolert og badet i en ADI PowerLab Radnotti kammer system levert med enten rent oksygen eller en blanding av oksygen (95%) og CO ₂ (5%). Kontraktile krefter ble generert av elektriske stimuleringer fra en Grass stimulator og oppdaget ved hjelp av en kraft svinger som ble integrert med en ADI PowerLab/400 system, slik at tilpasning av makro rutiner for å kontrollere oppkjøpet, innsamling, digitalisering og lagring av data. Dette oppsettet kan måle muskelkraft, muskelkraft, samt kraft vs frekvens forholdet, muskeltretthet, utvinning fra muskeltretthet, hastighet og samlede kinetiske egenskaper muskelkontraksjon. I tillegg kan effekten av medikamenter på muskelkontraksjon overvåkes ved disse eksperimentene. Fordelene med denne metoden lå i å fjerne neuronal og vaskulære komponenter unna skjelettmuskulatur, som tillater direkte vurdering av de iboende egenskapene til kontrahering muskel. I tillegg, ex vivo kontraktilitet assays tillate manipulering av ekstracellulære miljøet rundt de isolerte muskler, som muliggjør bruk av farmakologiske manipulasjoner av ulike ion permeasjon kanaler og transportører for å definere deres fysiologiske roller for skjelettmuskel funksjon.

Dette ex vivo systemet har tillatt oss å nylig oppdage en tydelig alternan atferd i visse mutant muskel preparater, som var knyttet til endret intracellulær Ca ^{2 +} håndtering egenskaper ^4. Alternans er definert som varierende burst episoder av kontraktile kraft i løpet av nedgangen fasen av slitsom profilen. I løpet av disse hendelsene kontraktile krefter øyeblikk øke over sitt tidligere nivå av makt during strabasiøs stimulering, kanskje fordi enten mer Ca ^{2 +} blir lansert eller den kontraktile maskiner har blitt mer følsomme for Ca ^{2 + 30.} Behandling av cyclopiazonic acid (CPA), en reversibel blokkering av sarkoplasmatisk-endoplasmatisk retikulum kalsium ATPase (SERCA), koffein, en agonist av ryanodine kanal (Ryr) og gjentatt slitsom stimuleringer kan alle indusere mekaniske alternans ^4, noe som tyder på at alternans er direkte relatert til modulering av EC koblingen prosessen. Demonstrasjon av metoden for å indusere og registrere mekaniker alternans i in vitro kontraktilitet oppsett fungerer som et eksempel for å vise den diversifiserte eksperimentelle parametre som kan oppnås med dette systemet eller lignende som, basert på individuelle forskningsinteresser.

Denne metoden kan være av interesse for forskere som studerer muskel fysiologi. Lignende oppsett kan også brukes for isolerte skjelett muscle-tendon/ligament komplekser fra andreanatomiske steder, så vel som for enkle fibre og muskel strimler.

Protocol

Løsning sammensetning:

2,5 mM Ca ^{2 +} Tyrode løsning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM ₂ CaCl, 2 mM MgCl ₂ og 10 mM glukose

0 mM Ca ^{2 +} Tyrode løsning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl _2, 0,1 mM etylenglykol-tetraeddiksyre (EGTA) og 10 mM glukose

Merk: bading løsningen bør være mettet med 100% O ₂ hvis bruker ovennevnte løsning, men med 95% O ₂ med 5% CO ₂ hvis bruker bikarbonat-baserte buffere å holde pH konstant. 2,5 mM Ca ^{2 +} tilsettes til bading buffer å rekapitulere nivået av Ca ^{2 +} funnet i det ekstracellulære rom og 10 mM glukose er viktig siden mitokondrier er fortsatt fungerer i disse musklene å kontinuerlig produsere ATP i nærvær av glukose.

1. Konfigurering av Ex Vivo kontraktilitet eksperimentere medADI PowerLab System

1. En skjematisk tegning av en 4-kanals ex vivo kontraktilitet systemet er vist i figur 1. En datamaskin styrer en stimulator for å generere firkantet bølge pulser, som blir filtrert av isolatet å nå et par platinatråd omgir hver isolert muskel-sene kompleks. Dette kalles også felt stimulering. Sammentrekning av muskelen svare på stimulering ble avfølt av en kraft svinger, signalet generert fra som ble amplifisert, filtrert og overført tilbake til datamaskinen ved en A / D-omformeren (signal condition). Signalet blir så digitalisert og kan lagres for senere analyser.
2. For å forberede for en ex vivo kontraktilitet eksperimentet første sving på feltet stimulator, A / D-omformeren (i dette tilfellet ADI Effekt Lab) eller en lignende programvare (f.eks LabView), etterfulgt av den datamaskinen.
3. Åpne Chart4 programvare (eller annen programvare versjon som er kompatibel med systemet) og initiatea 4-kanals oppgave, riktig kommunikasjon av programvaren og maskinvaren er angitt ved å starte konfigurasjon av maskinvaren, og START-knappen på programvare blir operativt (live), den 4-kanals funksjon tillater samtidig måling av et par muskler fra en villtype og en mutant mus, eller 2 og 2 EDL soleus muskler fra samme mus, og det kan brukes til andre muskler som membranen (hele membranen hemi-diafragma eller membran muskel strimler) og tibialis anterior; det kan også bli brukt til hjertemuskelceller forberedelser og for bunter av muskler, særlig hvis man bruker rotte muskler. I dette tilfellet hvor store muskler kan begrense oksygendiffusjon slik muskel bunter er således et bedre valg. Imidlertid er ekspert disseksjon teknikker som kreves for muskel bunt forberedelser.
4. Kalibrering av styrken svingeren: dette er å sikre sammenlignbarhet datasettet generert ved forskjellige kanaler og på forskjellige tidspunkt. Første start opptak, Sequentially henge en 1-g, 2-g og 5-g vekter på prøven grove av styrken transduseren, stoppe innspillingen, beregne tilsvarende endringer i mV vist i hver kanal av Chart4 programvare, plotte ΔmV og vekten for å sjekke linearitet og bestemme omregningsfaktor mellom mV og gram kraft. Vi anbefaler utføre disse kalibreringer enten ved begynnelsen eller ved slutten av hvert eksperiment for å sikre at en bestemt kalibrering blir oppnådd for hver bestemt eksperiment.
5. Sjekk riktig tilkobling av Teflon tube, avløp væske til stede i vevet bad slangen, vaske kamre tre ganger eller mer med DDH ₂ O og fyll med 20 ~ 25 ml 2,5 mM Ca ^{2 +} Tyrode løsning. Ca ^{2 +} og glukose er gitt i bading løsning for å hjelpe å opprettholde membran integritet, optimal Ca ^{2 +} lasting av SR, og en lett tilgjengelig energikilde for generering av ATP ved muskelen selv, siden mitokondriene forblir fullt funksjonell i disse preparatene.
6. Kontroller riktig tilkobling av oksygentilførselen, åpner oksygen tank, og juster oksygenstrømmen å tilveiebringe diffusiv og homogen bobling av kammeret. Oksygennivået kan lett bestemmes som en funksjon av kontraktile kraft mot tid. En flow meter kan også installeres, spesielt hvis forskere er interessert i å studere effekten av hypoksi eller hyperoksi. Hvis musklene blir hypoksisk, minsker kraft naturlig. Mens hyperoksi kan også skade muskler men effekten kan være vanskeligere å bli detektert fordi de fleste eksperimenter utføres under kunstige hyperoxic betingelser for å kompensere for fraværet av en normal blodtilførsel til musklene. I de fleste systemer er det mulig å boble på de forskjellige kamre med samme mengde oksygen ved å kontrollere strømmen av oksygen til hvert kammer konstant.
7. Justere følsomheten av alle kanaler for å sikre maksimal kraft oppløsning uten å mette kanal. Kanal følsomhet kan variere betraktelig fungere end alder av dyret, eksperimentell temperatur, genetiske manipulasjoner, muskel størrelse, mus stamme, og evnen eksperimentator til riktig dissekere muskler uten skader. I vår erfaring, ved måling soleus kontraktile kraft, varierer følsomheten 0,5 til 10 mV / cm, mens i tilfelle av EDL, kunne følsomheten varierer 1-20 mV / cm.
8. En protokoll for slitsom stimulering må etableres. I Chart4 programvaren en makro kan brukes. For å programmere en ny makro: i Chart4 programvaren, klikk begynne å måle, og klikk deretter Makro, Makro Command, starte opptak, begynner gjenta, velger ønsket stimulans frekvens, og deretter slutten gjenta. For en likevekt protokollen, er stimulus gjentas hvert minutt i 30 min og for slitsom protokollen, er stimulus gjentas hver 2 sek i 5 min. Disse endringene i periodisiteten av stimulering, direkte påvirker driftssyklus, som også er en funksjon av stimulering varighet. Disse parametrene kan varieres for å teste ulike AspeCTS av kontraktilitet og trettbarhet.

2. Forbereder Intakte Muscle Bundles

1. EDL disseksjon: musen er ofret etter NIH retningslinjer og IACUC institusjonelle dyr protokoller. Musen er ofret av cervical forvridning. Mus blir deretter anordnet ved sideleie. EDL muskel er en rask glycolytic muskel med blek rosa-hvit farge. Det er ca 10-13 mm lang og veier 8-11 mg i villtype C57BL / 6 mus. EDL har funksjonene utvide tær 2-5, og dorso-bøye foten ved ankelen. Det er innerverte av peroneal nerve. Å dissekere EDL, lage et overfladisk hud innsnitt og kutte åpne fascia mellom fremre tibialis og bakre muskel gruppe, og lokalisere opprinnelsen (proksimal) hvor ligamentet er koblet til den laterale knokkelen av tibia og overlegen trekvart av fremre overflaten av fibula (interosseous margin). Skjær ligament med delikate ophthalmica saks som distalt som mulig fra muskel, dette procedure frigjør proksimale opprinnelsen til EDL muskel. Hold ligament med en sløv pinsett og dra sakte å frigjøre EDL. Det kan være nødvendig å kutte noen av Bratzler verdiene rundt EDL og andre musklene rundt EDL, et skritt som er kritisk siden skader kan oppstå til EDL muskel under denne delikate trinnet. Deretter flytter til innsetting regionen der de fire distale sener sette inn i midten og distale falanger av tall 2-5. Skjær senene så langt som mulig fra muskler.
2. Overfør den isolerte EDL muskel i en disseksjon parabolen som inneholder isotonisk Tyrode løsning. Noen mutant, transgene, og knockout dyremodeller har svært skjøre muskler og utnyttelse av Ca ^{2 +-free} Tyrode løsning er nødvendig for å hindre Ca ^{2 +-indusert} muskelskade før kontraktilitet målinger. Deretter bruker du en kirurgisk knute for å binde fast i begge ender av EDL muskel som distalt fra muskel som mulig. Et godt mål er å knytte litt over midten point lengderetning av ligament eller sene. Bruk 6-0 size sutur for denne prosedyren, og overføre EDL muskelen til O _2-mettet vev badekammer, montere muskel på prøven sporet kraften transduceren og skrivesaker kroken på bunnen av badekaret kammeret, gjenta Prosessen for det andre benet. Vi begynner også å benytte en ny metode som holder musklene med klemmer i stedet for suturer. Hvis hovedmål er å studere kinetiske egenskaper og / eller for å oppnå muskelkraft, anbefales det at sutur være så kort som mulig eller sutur erstattes med en metallstang.
3. Soleus disseksjon: den soleus er en hovedsakelig langsom oksidativ muskel med rik rød farge. Det er ~ 1 mm kortere enn EDL, men veier litt mer enn EDL. Det er innerverte av tibial nerve og den utfører handlingen av plantar fleksing foten. Å dissekere de soleus, tilgang til bakre lateral side av benet, skyve til side gastrocnemius muskel som normalt dekker soleus, og identifisere muskel med mørk rød farge. I origo (proksimal), kuttet senene kobler til den proksimale halvdelen av posterior tibia langs soleal linjen og proksimal 1/3 av den bakre fibula, neste, på innsetting (distal), klipp calcaneal sene som settes inn i bakre calcaneus. Nøye frigjøre soleus og riktig monter soleus muskelen i badekaret kammer som for EDL.

3. Måling kontraktilitet av de isolerte skjelettmuskulatur

1. Når musklene er montert i enkelte vev bad kamre, starte opptak. Mest lignende systemer tillate nullstilling av grunnlinjen i kraft opptak. Denne funksjonen er vanligvis forbundet med forsterkeren, i det konkrete tilfelle av PowerLab systemet, som funksjon av broen forsterkeren. Den letter observasjon av baseline endringer og gir en praktisk måte for alle muskelsammentrekninger som skal analyseres fra null. Isolerte musklene er så stimulert med squared-bølge pulsersom kan variere vidt som funksjon av kammeret størrelse, platina ledninger tykkelse, avstand mellom ledningene, og selv sammensetningen av den eksperimentelle løsningen. Vi har ansatt strøm på 60 mA (vi har registrert at strømninger over 350 mA synes å være skadelig for muskel preparater) og stimulerende tog på 350, 500, og 1000 ms, avhengig av målene til en bestemt protokoll. De enkelte square wave pulser bør ha varighet varierer 0,3 til 1 ms.
2. Det neste trinnet er å velge en frekvens på stimulering stand til å produsere en smeltet tetanic stimulering (ex: ~ 100 Hz for å tillate produksjon av maksimal kraft i EDL muskel og ~ 60 Hz i soleus muskelen) mens sakte og forsiktig strekke musklene for å identifisere optimale lengden av disse muskler. Som musklene er nøye strukket, vente i 30 s og stimulere til 100 Hz, vent 30 s og strekke på nytt, og deretter gjenta stimulering, til det punktet hvor kraften ikke øker lenger.
3. Disse musklene har undergone vesentlige endringer i miljøet. Det anbefales at musklene få lov til å tilpasse seg det nye miljøet, kalt et skritt i våre protokoller "likevekt". Equilibrate disse musklene på samme frekvens av stimulering benyttet under strekking fasen, 100 Hz i 20-30 min, inntil minst 5 påfølgende tetanic sammentrekninger er helt stabile (ikke redusere, ikke øker, stabil grunnlinje). Periodisitet av stimulerende togene (100 Hz, 500 ms varighet, 1 ms individuell puls) under ekvilibrering er 1 min, noe som tilsvarer til en driftssyklus på 1,66%, et ikke-utmattende stimulering. I denne sammenheng betyr en driftssyklus på 1,66% som over totalt 100%, er musklene jobber 1,66% av tiden, ved å øke driftssyklus muskler kan til slutt bli overtalt til trøtthet. Hvis annet musklene sunn, villtype mus viser en strabasiøs profil under denne ekvilibreringsperiode, er det mulig at de ble skadet under disseksjon, er hypoksi skjer i kamrene / muskler, eller overdreven electrolysis gjennom stimulerende elektroder genererer frie radikaler. Westerblad har tidligere antydet at strømninger større enn 400 mA indusere dannelsen av frie radikaler ^23. Selvfølgelig er den høyeste kvalitet platina foreslått, siden andre metaller vil sikkert føre til dannelse av frie radikaler og muskel toksisitet.
4. Skaff kraften g. frekvens relasjon (FF) ved å stimulere musklene med følgende frekvenser: stimulering 1-140 Hz (i trinn på 5-10 Hz), med en periodisitet av 30-60 s når utførte eksperimenter ved 25 ° C. Når du utfører eksperimenter ved 37 ° C, forlenge FF til høyere frekvenser opp til 300 Hz for membran muskler, 180-200 Hz for soleus, og 220-250 Hz for EDL. Deretter identifisere hyppigheten av stimulering som genererer maksimal tetanic kraft (T _max) og ca ½ maksimal tetanic kraft (1/2 T _max), noen ganger er det vanskelig å få eksakte ½ T _max for både EDL og såleoss muskler hvis bare en stimulator kilde blir brukt, på grunn av de iboende forskjeller mellom disse musklene. En levedyktig løsning er å identifisere en frekvens som produserer 30-70% av T _maks. Begrunnelsen for disse frekvensene av stimulering er at T _max gir viktig informasjon for kontraktile maskineri hendelser / modulasjon, mens ½ T _max gir informasjon mer relevant for Ca ^{2 +} regulering og ECC-prosessen. For å være sikker på at maksimal kraft er oppnådd, kan 10 til 20 mM koffein tilsettes bading løsningen mens stimulere muskelen. Hvis maksimal kraft er nådd, vil kraft ikke øke i nærvær av koffein. FF er forskjøvet til høyre, og kreftene virker å være noe høyere ved høyere eksperimentelle temperaturer. Ved hjelp av dette system, kan alle andre stimulering frekvenser utføres hvis ønskelig. Den distinkte kontraktile profilen til en rask glykolytisk EDL muskler og en langsom oksidativ soleus muskelen ervist i figur 2.
5. Etter ekvilibrering, tretthet musklene ½ T _max i 5 min, med stimulering intervall på 2 s og 25% driftssyklus (figur 3). Denne spesifikke strabasiøs protokollen antas å bedre reflektere bidrag sarkoplasmatisk retikulum Ca ^{2 +} release for muskel kontraktilitet ^31.
6. Gjenopprette muskel på ½ T _max for 30 min eller til kraften er stabil, på 1 min intervall. En ytterligere strabasiøs protokoll kan utføres nå bruker T _max stimulering, noe som antas å avspeile statusen av den kontraktile maskineri ^31. Et annet alternativ er å utvide strabasiøs protokollen til intercalate stimulerende tog som genererer T _max og ½ T _max under tretthet og å gjenopprette muskler med samme type stimulering.
7. Gjenta FF som beskrevet i trinn 3.4, begrunnelsen er at fenotypiske forskjeller mellom different stammer, sykdom modeller, eller medikamentelle behandlinger kan observeres ved å analysere FF før og etter tretthet. Vi har for eksempel tidligere rapportert at etter utmatting FF unge villtype muskler er forskjøvet til venstre, mens det i muskler fra alderen muskler, er det forskjøvet til høyre, noe som tyder differensielle regulerende effekt av skjelettmuskler utmattelse som en funksjon av aldring.
8. Å sondere bidraget av det ekstracellulære Ca ^{2 +} oppføring i muskel kontraktilitet, kan bading løsning bli forandret til en oppløsning som ikke inneholder noe Ca ^{2 +} men 0,1 mM EGTA (0 mM Ca ^{2 +} Tyrode løsning) ^32. Alternativt kan forskjellige blokkere av butikk-opererte kanalen anvendes ved bading løsningen. Noen eksempler er: 2-aminoetyl diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-bis (trifluormetyl) pyrazol 2 (BTP-2) og azumolene, ^{33 osv., 34.} Koffein kan brukes til å undersøke funksjonen av ryanodine reseptoren, og KCl kan brukes til å vurdere den generelledepolarisering egenskapene til disse preparater. Andre medikamenter kan også brukes til å undersøke den viktige modulering av kraft under tretthet ved Na ^+, K ^+, og Na ^{+-K +} pumper ^35. De fleste av disse stoffene har relativt små størrelser og synes å raskt diffundere inn disse muskel preparater som dokumentert av deres umiddelbare effekter. Mangelen på en effekt ved en gitt narkotika betyr ikke nødvendigvis at stoffet er ineffektiv og flere tester ved hjelp dose mye høyere enn det som brukes i enkle muskel fiber eksperimenter er noen ganger nødvendig.
9. Ett unikt anvendelsen av denne ex vivo-system førte til den nylige oppdagelsen av mekaniker alternans i tric-a ^{- / -} muskler ^{4, 30.} Alternans er definert som varierende burst episoder av kontraktile kraft i løpet av nedgangen fasen av slitsom profilen. I løpet av disse hendelsene kontraktile kraft kan øyeblikk øke over sitt tidligere nivå av makt underslitsom stimulering fordi det enten mer Ca ^{2 +} blir lansert eller den kontraktile maskiner har blitt mer følsomme for Ca ^{2 +.} Den kontraktile kraft utbruddet må være 50% høyere enn den forrige kraft og utbruddene bør sees minst 10 ganger i løpet av 5-min tretthet stimulering prosess. Mekaniker alternans er ikke vanlig i skjelettmuskel fra vill type mus, men kan sees på noen mutante muskler med perturbasjon av intracellulær ^{Ca2 +} signalering prosess som trimere Intracellulær Cation Kanaltype A (tric-a) ^{- / -} muskel ^4. Mekaniker alternans kan induseres gjennom utmattende stimuleringer, behandling med koffein og cyclopiazonic acid (CPA), se figur 3 for et representativt opptak av disse mekaniske alternans. Naturen i dette fenomenet er ganske spennende, mens en muskel som slitsom synes i stand til å midlertidig produsere mer kraft. I vår forrige publisering, Kombinert med enkelt celle Ca ^{2 +} analyse viser at utseendet alternans er et resultat av SR Ca ^{2 +} overbelastning og ustabil SR. Vi tror at en dypere forståelse av alternans kan føre til en bedre forståelse av ECC-prosessen.
10. På slutten av eksperimentet, måle lengden og vekten av de enkelte musklene hjelp kalibrert caliper og analytisk balanse, flash frosset muskelen i flytende nitrogen og lagre ved -80 ° C, siden biokjemiske analyser kan utføres i disse musklene. Disse musklene kan også være mekanisk flådd for detaljert sondering av ECC-prosessen, eller være kjemisk-flådd for bestemmelse av essensielle kontraktile egenskaper i fravær av ECC reguleringsmekanismer.
11. Fart muskelkraft (mV) er først omdannes til gram tvinge basert på kalibrering resultater og deretter normalisert til den fysiologiske tverrsnittsareal (PCSA) ved hjelp av følgende formel: muskel kraft (N / cm ²⁾ = (kraft (g) x muskel Length (cm) x 1,06) / (muskel vekt (g) x 0,00981) ^5,36. Alternativt, kan muskel makt bli normalisert til totalt protein eller total aktin innholdet av enkelte muskel bruker Bradford protein assay / Commossie blå farging kvantifisering. Under visse forhold, mens muskelmasse kunne bli sterkt påvirket på grunn av sykdommer, senescence kan medikamentell behandling, force normalisering basert på muskelmasse, protein og / eller aktin innholdet gir en mer stabil avlesning.

4. Representant Resultater

Typiske romtemperatur kontraktile krefter EDL og soleus svarer til lave, middels og høye frekvenser stimuli er vist i figur 2. EDL sammentrekning indusert av 5 Hz stimulans forblir som individuelle rykninger på grunn av rask handling av SERCA Ca ^{2 +} ATPase og egenverdi Ca ^{2 +} følsomhet egenskaper kontraktile maskineri, mens soleus sammentrekning av 5 Hz begynner å smelte (saktere ATPase end høyere følsomhet for Ca ^{2 +} av den kontraktile maskineri), men toppen styrker er fortsatt adskilt. Ved 20 Hz stimulering, blir EDL sammentrekninger delvis smeltet mens det av soleus danner en helt smeltet tetanic kraft. Ved frekvensen av stimulering som produserer T _max stimulering, som kan variere i romtemperatur 80-110 Hz for EDL og 60-90 Hz for soleus, rask upstroke og rask avslapning av tetanic kraft i EDL konstateres, som strider mot den langsomme egenskaper soleus muskelen. Figur 2B viser at kraft-frekvenskurven av EDL muskel er forskjøvet til høyre i forhold til soleus muskelen, indikerer at soleus muskler er mer følsomme for Ca ^{2 +} frigjøring til enhver frekvens av stimulering på grunn av tilstedeværelsen av det langsomme myosin og troponin isoformene. I tillegg reagerer den kontraktile maskineri med relativ mer kraft i soleus muskel ved lavere frekvenser. Figur 3 viserSA normal tretthet profil av EDL (øvre panel) og soleus muskelen (midtre panelet). Legg merke til raskere nedgang i kontraktile kraft under slitsom stimulering i EDL muskel og høyere reduksjon i kraft ved utgangen av 5-min tretthet protokollen. Endelig ble en typisk mekanisk alternan profil av en mutant muskel vist i Figur 3 (nedre panel), som ble definert som impuls force utbrudd under fallende fasen av muskeltretthet profil. Den kontraktile kraft utbruddet må være 50% høyere enn den forrige kraft og utbruddene bør sees minst 10 ganger i løpet av 5-min tretthet stimulering prosess.

Figur 1. Skjematisk tegning av en 4-kanals ex vivo kontraktilitet systemet. Square-bølge pulser blir generert av en datamaskin kontrollere en Grass stimulator. To stimulering isolater filtrere stimulans stammer fra electriske stimulator enhet for å fjerne eventuelle svingninger i det elektriske signalet, og for å etablere en stabil kantbølgesignal. Dette filtrerte elektrisk signal sendes til de 4 bading kamre inneholdende platinatråd elektrodene rundt hver isolerte muskel. Til syvende og sist er det den nåværende tvers av de to elektroder (kalt felt stimulering) som genererer en handling potensial, indusere sammentrekning av muskelen. Dette sammentrekning er oppdaget av en bestemt kraft transdusere, overføres til broen forsterkere, filtrert, i gjennomsnitt (signalbehandling) og innspilt av dataprogrammer via en A / D-konverter.

Figur 2. . Representative kontraktile krefter EDL og soleus (A) Kontraktile krefter indusert av 5 Hz (øvre panel), 20 Hz (midtre panelet) og maksimal tetanic kraft (T _max) (nedre panel); innløp viser spor av kontraktile kraft av en skadet muskel, (B) enrepresentant satt viser de enkelte sammentrekninger av en kraft vs frekvens forhold i EDL (FF, øvre panel) og kurve som følge av FF (nedre panel). Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Representant slitsom profil og mekaniske alternans. En typisk rask nedgang slitsom profil av EDL muskelen (øvre panel) og langsom nedgang slitsom profil av soleus muskelen (midtre panelet). Slitsom stimulering fører til utseendet av mekaniske alternans i en tric-a ^{- / -} muskel med forstyrret Ca ^{2 +} håndtering egenskaper (nedre panel).

Discussion

Måling av kontraktile kraft og trettbarhet er viktig for den samlede vurderingen av skjelettmuskulatur funksjon. De viktigste formålet med denne analysen er å identifisere endringer i muskelkraft og utmattende egenskaper under visse patologiske tilstander, for eksempel sarkopeni og muskeltretthet og å teste virkningen av narkotika / reagenser på muskel kontraktilitet. Siden muskelkraft er nært beslektet med intracellulær Ca ^{2 +} release, ekstracellulære Ca ^{2 +} oppføring og crosstalk mellom disse to, kan vi også samle informasjon om Ca ^{2 +} signaliserer status i skjelettmuskulatur bruke denne metoden. Her viste vi en unik fenotype kalt "mekaniker alternans" når varierende burst episoder av kontraktile kraft i løpet av nedgangen fasen av strabasiøs profilen ble sett under en overbelastet og ustabil SR. Man kunne forvente at en rekke muskelavslappende fenotyper inkludert endret kraft, FF, trettbarhet, kontraktile kinetikk og utvinning ability etter tretthet kan påvises ved hjelp av in vitro kontraktilitet assay under annerledes patologiske tilstander.

Den mest kritiske trinn for denne analysen er å isolere hele intakte muskler (eller muskel bunter og muskel strimler) som er fri for skade. Et slikt mål er lettere å bli oppnådd i hele muskel preparater. Her viser vi at å forlate nok leddbånd og sener å knytte hele muskler er svært viktig å hindre knytte muskelen selv, noe som fører til muskel skader og til slutt muskel død. I tillegg, er konstant boblende av løsninger med enten 100% O ₂ i tilfelle av HEPES-baserte løsninger eller en blanding av O ₂ og CO ₂ for bikarbonat-baserte løsninger kritisk. Forebygging hypoksi og hyperoksi er viktig mens en strømningsmåler kan brukes. Vi har også brukt i visse situasjoner en bestemt enhet som måler oppløst oksygen i væsker bading vevet. Under visse forhold der musklene er more utsatt for skade, vil håndtering det isolerte muskler i en ^{Ca2 +-fri} løsning før montering på styrken svingeren bidra til å slappe av muskel og minimere muskelskade før eksperimentet. Stoffer som 2,3 - butanedione monoxime (BDM) eller N-benzyl-p-toluen sulfonamid (BTS) kan også tilsettes under disseksjonen å minimere skader, spesielt hvis muskel bunter eller muskel strimler fremstilles, noe som er vanlig for kontraktilitet studie av membranen ^{37, 38.} Under opptak, vil skadede forberedelser normalt genererer mindre kraft og har økt baseline støy og svingninger (se innløpet figur 2), og resultatene fra disse musklene kan bli ekskludert fra analysen datasett, med mindre det er en del av eksperimentet å analysere svarene fra skadet muskler. Et annet punkt som lett kan ignoreres eller glemmes er at elektrisk stimulering i seg selv kan være en kilde til toksisitet for muskler. Vi anbefaler periodisk rengjøring elektrodene og ChambER med en 1% hypoklorittoppløsning for å fjerne eventuelle contaminates, protein rusk, oksidasjon akkumulering etc. Special forsiktighetsregler brukes nødvendig ved justering av lengden av den monterte muskel. Det er viktig å strekke i små trinn for å unngå over-strekking som den optimale innretting av tynne og tykke filamenter er kritisk for en effektiv kryss-bro fungerende ^39. I tillegg anbefales det at den relative posisjonen for de monterte muskel bunter til feltet stimulering elektrodene holdes konstant og justert blant alle kanaler for å sikre at lik mengde av elektrisk strøm påføres isolerte muskler. Under våre eksperimentelle forhold, muskler fra unge vill type mus holde seg stabilt i over 12 timer, og enda lenger hvis antibiotika, 0,2% FBS, og aminosyrer er lagt til bading løsning.

Med forsiktighet og god kontroll, kan dette ex vivo system gir informasjon om sammenhengen mellom Ca ^{2 +} signaliserer end muskelkontraksjon uten kompleksiteten av vaskulatur, endokrine, og nervesystem. For eksempel tap av avhengighet ekstracellulær Ca ^{2 +} er en signatur av alderen skjelettmuskulatur mens SR Ca ^{2 +} utgivelsen dysfunksjon vanligvis gir lavere kontraktile kraft og rask slitsom profil. Som exampled her, indikerer utseende mekaniske alternans ustabil SR, som vi mener ikke er begrenset til tric-A ^{- / -} muskler, men heller også i andre skjelettlidelser muskler under patologiske tilstander genererer SR Ca ^{2 +} overbelastning og ustabilitet. Dette oppsettet gir direkte tilgang til muskelen for ulike fysiologiske og farmakologiske manipulasjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5