İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

Summary

Biz doğrudan kas kuvveti, kas gücü, kasılma kinetiği ve izole iskelet kaslarında yorulma ölçmek için bir yöntem tarif

Abstract

Burada tanımlanan izole edilmiş iskelet kaslarının kasılmasına ölçmek için bir yöntemdir. Bu tür kas kuvveti, kas gücü, kasılma kinetiği, bitkinlik ve yorgunluk sonrası toparlanma gibi parametreler gibi heyecanlanma gibi eksitasyon-kasılma kenet belirli yönlerini (ECC) süreci, kontraktil makine ve Ca ^{2 +} taşıma yeteneğini değerlendirmek için elde edilebilir. Bu yöntem, sinir ve kan akımı kaldırır ve izole iskelet kası odaklanır. Biz rutin modüle Ca ^{2 +} sinyal yolları olsa iskelet kası kasılma özelliğini değiştiren genetik bileşenleri tanımlamak için bu yöntemi kullanın. Burada, in vitro kas kasılması tayininde kullanılarak elde edilebilir çok çeşitli ve zengin bir bilgi örneği olarak yeni tanımlanan bir iskelet kas fenotip, yani mekanik alternansı, tarif. Tek hücre deneyleri, genetik yaklaşımlar ve biyokimyasal ile bu tahlil kombinasyonustry deneyler iskelet kasındaki ECC mekanizmaları konularında önemli ipuçları sağlayabilir.

Introduction

Iskelet kasları, merkezi sinir sisteminin kontrolü altında kontraktil güçler iskelet kemik yapışır ve üretir. Eksitasyon-kasılma kenet (ECC), mekanik bir yanıt için bir elektrik uyaran dönüştürme sürecini ifade eder. Ca ^{2 +} sinyalizasyon iskelet kaslarında kasılma fonksiyonu önemli bir bileşenidir. Etkili Ca ² sarkoplazmik retikulum (SR) ^{+ 'dan} harekete önemli bir kas ^{hücresi, 1, 2} içinde ECC bileşen, ve hücre içi ^{Ca2 +} sinyali değişiklikler kas hastalıklarında ^3-5 arasında bir sayı karşılık gelen kontraktil fonksiyon bozukluğu altında yatan olup. Kas kasılması Uygun değerlendirme ⁺ görüntüleme ve diğer testler sadece kasılma düzeyinde, iskelet kası fonksiyonu içgörü kazanmak değil, aynı zamanda kinetik düzeyde önemlidir ve Ca ² ücretsizdir. Kuvvet ve hızı da önemli tesise bildirmeleri elde edilebilirfarklı fizyolojik ve patofizyolojik durumlardaki kas gücü ve ECC işleminin durumunu.

Bu araştırma bereketli alanında çok zengin bir tarihe sahiptir ve kas kasılması birçok teoriler iki bin üzerinde ⁶ çıktı. Modern kas araştırma muhtemelen Leeuwenhoek tarafından ⁶ kas liflerinin çapraz çizgiler ve miyofibril mikroskobik gözlem ile 1674-1682 yılında başlar. Onun sinir uzak bir elektrikli makine ^7-9 bir kıvılcım deşarj sırasında bistüri ile dokunulduğunda Neredeyse bir yüzyıl sonra, Luigi Galvani kurbağa kas sözleşmeleri şiddetle görülmektedir. Daralma ayrıca bir metal iletken ile kas için bacak sinirin bağlanması ile elde edilebilir. Galvani tarafından savunulan karmaşık elektriksel sinyal mekanizmasının ayrıntıları sonunda elektrofizyoloji temeli oldu onların ünlü denklemi ^{10, 11} Hodgkin, Huxley ve Katz tarafından formüle edildi. Rin çarpıcı gözlemlerger ⁺ kurbağa kalp ve iskelet kaslarının ^12-15 kasılma ekstraselüler Ca ² etkileri Ca ² tanınmasında ilk önemli adım ⁺ kas kontraktilite ^{16, 17} önemli bir düzenleyici olarak temsil eder. 1980'lerden günümüze kadar kas kasılması alanında keşifler bir patlama nedeniyle kas kontraktilite ve murin iskelet kaslarında ¹⁸ yorulma protokollerin tanıtımı gerçekleştirildi. Jones ve Edwards ¹⁹ ECC makine değişiklikleri değil, kontraktil aparat ile ilişkili olduğu düşük frekanslı aralıklı yorgunluk (kuvvet egzersizle oluşan azalma) önermek için ilk idi. Ise geç 1980 ve erken 1990 yılında, Kolkeck ark ^20, Kolbeck ve NOSEK ^21, ve Reid ^22, iskelet kası kasılma theophyllines, cortiosterone ve serbest radikallerin etkilerini incelemek için kemirgen modelleri diyafram kası kullandığınız Brooks ve Faulkner fareler ²² hızlı ve yavaş kasları tekrar kuvvet ve güç ölçümleri ölçümleri rapor için ilk idi. Buna ek olarak, Lannegren, Westerblad, Kuzu ve Westerblad doğrudan hücre içi Ca ^{2 +} yönetmeliğe ex vivo kontraktilite bağlamak için ilk ve kas yorgunluğu ^{23, 24} asidoz rolünü sorgulamaya başladı.

Bizim laboratuvarlar önemli ölçüde bozulmamış fare kas kontraktilite çalışmaları bir arada kullanarak erken 2000 en yeni genlerin anlayış yönelik düzenleyici ve düzenleyici rolleri ile kas ECC ilgili kas kasılması, bitkinlik, ve yaşlanma kritik rolleri beri katkıda, hücre içi Ca ^{2 +} izleme oylandı bozulmamış ve derili kas lifleri ve moleküler-genetik manipülasyonlar ^{3-5, 25-29.}

Burada fare izole soleus ve ekstansör digitorum longus ölçme kontraktilite (ED için deney protokolünde ayrıntılıKarşılık L) kasları çoğunlukla yavaş oksidatif (tip I ve IIa kas lifleri) ve farklı kontraktil özelliklere sahip bir çoğunlukla fast-glyocolytic kas (tip IIb ve IIx kas lifleri). Bu protokol, dokunulmamış kas-tendon kompleksleri izole edilmiş ve saf oksijen veya oksijen karışımı (% 95) ve _CO2 (% 5) ile birlikte bir ya da ADI PowerLab Radnotti hücre sistemi ile yıkanır. Kasılma güçleri Çim stimülatörü elektrik stimülasyonu ile oluşturulan ve makro rutinleri özelleştirme veri toplama, koleksiyon, dijitalleşme ve depolama kontrol etmeye izin veren, bir ADI PowerLab/400 sistemi ile entegre bir kuvvet dönüştürücü kullanılarak tespit edildi. Bu kurulum kas kuvveti, kas gücü, hem de kuvvet karşısında frekans ilişkileri, kas yorgunluğu, kas yorgunluğu, hız ve kas kasılması genel olarak kinetik özelliklerine iyileşme ölçebilir. Buna ek olarak, kas kasılması üzerinde ilaçların etkilerini bu deney ile takip edilebilir. Bu yöntemin avantajları kas sözleşme içsel özelliklerinin doğrudan değerlendirmesine imkân, iskelet kası uzak nöronal ve vasküler bileşenleri çıkarmadan yatıyordu. Buna ek olarak, ex vivo kontraktilite testleri çeşitli iyon nüfuz kanalları ve nakliyecilerin farmakolojik manipülasyonlar iskelet kas fonksiyonu için onların fizyolojik rolleri tanımlamak amacıyla kullanılmasını da sağlar izole kas çevreleyen ekstraselüler ortamın, manipülasyonu sağlar.

Bu ex vivo sistem bize son zamanlarda değiştirilmiş hücre içi Ca ² ile bağlantılı olan bazı mutant kas preparatlarında ayrı alternan davranış, ⁺ özellikleri ⁴ işleme keşfetmek için izin verdi. Alternans yorucu profilin azalma aşaması esnasında kasılma kuvveti değişen seri bölüm olarak tanımlanır. Bu olaylar sırasında kasılma kuvvetlerinin anlık kuvvet d önceki seviyenin üzerinde artışDaha fazla Ca ^{2 +} piyasaya sürülüyor veya kontraktil makine Ca ^{2 + 30} daha duyarlı hale gelmiştir ya da belki de, çünkü yorucu stimülasyon uring. Siklopiazonik asit (CPA), sarkoplazmik-endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), kafein, riyanodin kanal (RYR) bir agonisti bir reversible bloker tedavisi ve uyarımlar yorucu tekrarlanan tüm bu alternans doğrudan ilişkili düşündüren, mekanik alternansı ⁴ uyarabilir AK kaplin süreci modülasyonu. In vitro kontraktilite kurulum in mekanik alternansı indükleyen ve kaydetmek için yöntem Gösterme bireysel araştırma çıkarlara dayanan bu sistem, veya benzer olanlar ile elde edilebilir çeşitlendirilmiş deneysel parametreleri göstermek için bir örnek teşkil etmektedir.

Bu yöntem, kas fizyolojisi inceleyen araştırmacılar için ilgi çekici olabilir. Benzer ayarı da diğerinden izole iskelet muscle-tendon/ligament kompleksler için de kullanılabilirlokasyon, hem de tek liflerin ve kas şeritleri için olduğu gibi.

Protocol

Çözüm bileşimi:

2.5 mM ^{Ca2 +} Tyrode çözeltisi: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2.5 mM _CaCI2, 2 mM _MgCI2 ve 10 mM glükoz

0 mM ^{Ca2 +} Tyrode çözeltisi: 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, 0,1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve 10 mM glükoz

Not: banyo çözümü yukarıdaki çözüm kullanıyorsanız, ancak% 5 CO ₂ ile% 95 O ₂ ile% 100 O ₂ ile doyurulmalıdır pH sabit tutmak için bikarbonat bazlı tamponlar kullanarak. 2.5 mM ^{Ca2 +} Ca ² seviyesinde tekrarlamak için banyo tampon ilave edilir ⁺ hücre dışı ortamda bulunabilir ve mitokondri hala sürekli glikoz varlığında, ATP üretimi için bu kasların olarak işleyen bu yana, 10 mM glikoz önemlidir.

1. Kullanma Ayar-up Ex Vivo Kasılabilme DeneyiADI PowerLab Sistemi

1. 4-kanal ex vivo kasılma sisteminin bir şematik olarak Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bir bilgisayar her bir izole kas-tendon kompleksi çevreleyen platin tel çifti ulaşmak için izolasyon ünitesi tarafından filtre edilir kare dalga darbeleri üretmek için bir uyarıcı denetler. Bu, aynı zamanda, alanla uyarım denir. Stimülasyon yanıt kas kasılması bir kuvvet dönüştürücü, güçlendirilmiş süzülmüş ve bir A / D dönüştürücü (sinyal şartlandırma) tarafından bilgisayara geri transfer edildi üretilen sinyal tarafından algılanır oldu. Daha sonra sinyal sayısallaştırılmış ve daha sonra analiz için kaydedilebilir.
2. Bilgisayar tarafından izlenen bir ex vivo kontraktilite deney alanında stimülatörü ile ilgili ilk turda, A / D dönüştürücüsü (bu durumda ADI Gücü Laboratuarı'nda) veya benzer bir yazılım (örneğin, LabView), hazırlanmak için.
3. Chart4 yazılım (veya sistem ile bu uyumlu diğer yazılım versiyonu) ve başlamıştır; açınea 4-kanal görevi; yazılım ve donanım düzgün iletişim donanım yapılandırması başlayarak belirtilen ve yazılım BAŞLAT düğmesine (canlı) operasyonel hale gelir; 4-kanal işlevi kasların bir çift aynı anda ölçülmesini sağlar bir yabani tip ve mutant farelerde, ya da 2 EDS ve aynı fare 2 soleus kasları ve bu gibi diyafram (bütün diyafram, yarı diyafram, diyafram veya kas şeritleri) ve ön tibialis gibi diğer kaslar için kullanılabilir; Aynı zamanda, bir sıçan kaslar kullanan, özellikle kalp kası preparatlar için ve kas demetleri için de kullanılabilir. Kas demetleri böylece daha iyi bir seçimdir bu yüzden bu durumda kas boyutunu oksijen difüzyon sınırlayabilir. Ancak, uzman diseksiyon teknikleri kas demeti hazırlıkları için gereklidir.
4. Kuvvet dönüştürücü kalibrasyonu: Bu farklı kanalları ve farklı bir zamanda oluşturulan dataset karşılaştırılabilirliğini sağlamaktır. İlk başlangıç ​​kaydı, sequentially kuvvet dönüştürücü örneklem grove bir 1-g, 2-g ve 5 g ağırlıkları asmak, kaydı durdurmak, Chart4 yazılımının her kanalda gösterilen mV gelen değişiklikleri hesaplamak, doğrusallık kontrol etmek ΔmV ve ağırlığı çizmek ve mV ve kuvvet gram arasındaki dönüşüm faktörü belirler. Bu, belirli bir kalibrasyon her biri belirli bir deney için elde edilmesini sağlamak için, başlangıçta ya da her deney sonunda ya da bu Ayarlamayı yaptıktan önerilir.
5. Doku banyo tüp herhangi bir sıvı mevcut drenaj, teflon tüp doğru bağlantısını kontrol edin, GKD ₂ O ile odaları üç kez veya daha fazla yıkama ve 20 ~ 25 ml 2.5 mM Ca ^{2 +} Tyrode solüsyonu ile doldurun. Ca ^{2 +} mitokondri bu hazırlıkların tamamen işlevsel kalır yana ve glikoz, membran bütünlüğü, SR optimal Ca ^{2 +} yükleme ve kas tarafından ATP üretimi için enerji bir hazır kaynak korumaya yardımcı olmak için banyo çözümü sağlanır.
6. , Oksijen kaynağı doğru bağlantısını kontrol oksijen tankı açın ve odanın difüzif ve homojen köpürme sağlamak için oksijen akışını ayarlamak. Oksijen seviyesinin kolayca kasılma kuvveti vs zamanın bir fonksiyonu olarak tespit edilebilir. Araştırmacılar hipoksi veya hiperoksinin okuyan ilgilenen özellikle bir debimetre de monte edilebilir. Kasları hipoksik hale gelirse, gücü doğal olarak azalır. Hiperoksinin zamanda kasların zarar verebilir ama çoğu deneyler kaslara normal kan arz eksikliği telafi etmek için yapay hiperoksik koşullarda yapılır çünkü etkileri tespit edilmesi zor olabilir iken. Çoğu sistemde bu kabarcık sadece sabit her bir bölme için oksijen akışını kontrol ederek oksijen, aynı miktarda farklı odalara mümkündür.
7. Doyurarak kanal olmaksızın maksimal kuvvet çözünürlüğü sağlamak için tüm kanalların hassasiyetini ayarlayın. Kanal duyarlılığı bir işlev olarak önemli ölçüde değişebilirhayvan d yaş, deneysel sıcaklık, genetik manipülasyonlar, kas büyüklüğü, fare zorlanma ve düzgün zararların ücretsiz kasları teşrih deneyci yeteneği. Bizim tecrübelerimize göre, soleus kasılma kuvveti ölçerken, hassasiyet, 0,5 ile 10 mV / cm arasında değişir EDL durumunda iken, hassasiyet 1-20 mV / cm arasında değişebilir.
8. Yorucu uyarılması için bir protokol oluşturulması gerekmektedir. Chart4 yazılım bir makro kullanılabilir. Yeni bir makro programlamak için: Chart4 yazılım, ölçüm başlatmak tıklatın ve sonra sonunda tekrar ardından Makro tıklatın, Makro Komutanlığı, kayda başlamak, tekrar başlaması, istenen uyaran frekansı seçin ve. Bir dengeleme protokolü için, uyarıcı 30 dakika boyunca her dakikada tekrarlanır ve protokol için zahmetli, uyarıcı 5 dakika boyunca her 2 saniye tekrarlanır. Stimülasyon dönemsellik Bu değişiklikler, doğrudan da stimülasyon süresinin bir fonksiyonudur görev döngüsü, etkiler. Bu parametreler farklı Aspe test etmek için değiştirilebilirkontraktilite ve kolay yorulma cts.

2. Bozulmamış kas demetleri hazırlanması

1. EDL diseksiyonu: fare NIH kılavuzunda ve IACUC kurumsal hayvan protokolleri takip feda edilmektedir. Fare servikal dislokasyon ile sakrifiye edilmiştir. Fare sonra yanal konumda düzenlenmiştir. EDL kasının soluk pembe-beyaz renkli, hızlı glikolitik kas. O hakkında 10-13 mm uzunluğunda ve vahşi tip C57BL / 6 fare 8-11 mg ağırlığındadır. EDL ayak 2-5 uzanan ve ayak bileği ayak dorsolomber esneme işlevleri vardır. Bu peroneal sinir tarafından innerve edilir. EDL teşrih için, yüzeysel bir cilt kesi yapmak ve tibialis anterior ve posterior kas grubu arasındaki fasya kesip, ve ligament anterior tibia ve 3/4 superior lateral kondil bağlı kökenli (proksimal) yerelleştirilmesine fibula yüzey (interosseöz marj). Bu prosedüründe; kas hassas oftalmik makas gibi distale mümkün olan bağ kesE EDL kasının proksimal kökenli serbest bırakır. Bir künt forseps ile bağ tutun ve EDL boşaltmak için yavaşça çekin. Bu EDS etrafında EDS ve diğer kas çevreleyen perimysium bazı hasar hassas bu adım sırasında EDL kas meydana çünkü kritik bir adım kesmek için gerekli olabilir. Sonra, dört distal tendon basamak 2-5 orta ve distal falanks takın ekleme bölgeye taşıyın. Kasların mümkün olduğunca tendonlar kesin.
2. Izotonik Tyrode çözeltisi içeren bir diseksiyon çanak içine izole EDL kasının aktarın. Bazı mutant transgenik ve nakavt hayvan modelleri çok kırılgan kasları ve ⁺ ücretsiz Tyrode solüsyonu Ca ² kontraktilite ölçümleri öncesi ^{+-indüklenen} kas hasarını önlemek için gerekli olan Ca ² kullanımı var. Daha sonra, mümkün olduğu kadar kas itibaren distal EDL kas her iki ucunda da sıkı bir şekilde bağlamak için bir cerrahi düğüm kullanır. İyi bir ölçü biraz orta-p Yukarıda kravat etmektirboyuna ligament veya tendon OINT. Bu işlem için 6-0 boyutu sütür kullanın ve, O _2-doymuş doku banyo odasına EDL kasının aktarmak kuvvet dönüştürücü ve banyo odasının altındaki kırtasiye kanca örnek oluk kas monte tekrarlayın Diğer bacak için süreci. Biz de kelepçeler yerine dikişlerle kasları tutan yeni bir yöntem kullanmaya başlıyor. Büyük hedefi kinetik özellikleri ve / okumak veya kas gücü elde etmek için ise, sütür mümkün olduğunca kısa olması önerilir veya sütür bir metal çubuk ile değiştirilmelidir.
3. Soleus diseksiyonu: soleus zengin kırmızı renk ile bir çoğunlukla yavaş oksidatif kas. Bu EDL daha ~ 1 mm daha kısa ama EDL biraz daha fazla ağırlığa sahip. Bu tibial sinir tarafından innerve ve plantar esneme ayak eylemi gerçekleştirir. Soleus teşrih için, bacak arka yan tarafa erişmek, normal soleu kapsar gastroknemius kas kenara itmeks ve koyu kırmızı renk ile kas tanımlamak. Kökeni At (proksimal), soleal hattı ve posterior fibula 1/3 proksimal birlikte posterior tibia proksimal yarısı bağlanırken ligamentler kesilmiş;, ekleme (distal) de, sonraki kalkaneal tendonu kesilmiş olduğunu posterior ekler kalkaneus. Soleus kadar dikkatlice ve düzgün EDL için de banyo odasında soleus monte.

3. İzole İskelet Kası Kasılma Ölçme

1. Kasların tek tek organ banyosunda odalarına monte edildikten sonra, kayda başlamak. Çoğu benzer sistemlerin kuvvet kayıt bazal sıfırlamayı sağlar. Bu fonksiyon, genellikle köprü amplifikatör bir fonksiyonu olarak, PowerLab sisteminin özel durumda, amplifikatör ile ilişkilidir. Bu temel değişikliklerin gözlenmesi kolaylaştırır ve sıfırdan analiz edilecek tüm kas kasılmaları için uygun bir yol sağlar. İzole kasları sonra kare dalga darbeleri ile uyarılırki oda büyüklüğünün fonksiyonu, platin tellerden kalınlığı, teller arasındaki mesafe, ve hatta deneysel çözeltisinin bileşimi olarak geniş ölçüde değişebilir. Biz 60 mA akım istihdam var (biz 350 mA üzerinde akım kas preparatlarında zararlı gibi görünüyor kaydetti var) ve 350 uyarıcı trenler, 500, ve 1000 ms, belirli bir protokol hedeflerine bağlı. Bireysel kare dalga darbe süresi ms 0.3-1 arasında değişen gerekirdi.
2. Bir sonraki adım, sigortalı tetanik stimülasyon üretebilen stimülasyon frekansı seçmek için (örn: soleus kas EDL kasının ve ~ 60 Hz maksimal kuvvet üretimi sağlamak için ~ 100 Hz) yavaş ve dikkatli kasları germe tanımlamak için ise Bu kasların optimal uzunluğu. Kasları dikkatlice uzatılır olarak, 30 s bekleyin ve 100 Hz'de canlandırmak; 30 sn bekleyin ve tekrar germek ve sonra kuvvet artık artmaz noktaya kadar, stimülasyon tekrarlayın.
3. Bu kaslar undergon varçevrede e önemli değişiklikler. Bu kaslar yeni ortama izin tavsiye edilir, bizim protokolleri bir adım "dengeleme" olarak adlandırılır. En az 5 ardışık tetanik kasılmalar (stabil bazal azaltarak değil, artan değil) tamamen stabil oluncaya kadar uzanan aşaması, 20-30 dakika süreyle 100 Hz, sırasında kullanılan stimülasyon aynı frekansta bu kaslar denge. Uyarıcı trenler (100 Hz, 500 ms süresi 1 ms, bireysel pulse) dengeleme sırasında periyodikliği 1.66% bir görev döngüsü eşittir 1 dk, olmayan bir yorucu uyarılmasıdır. Bu bağlamda,% 1,66 'lık görev döngüsü% 100 toplam fazla kas görev döngüsü kasları sonunda yorgunluk indüklenen olabilir artırarak, zaman 1.66% çalışıyorsunuz demektir. Sağlıklı, vahşi tip fare aksi kaslar bu dengelenme dönemde yorucu profili göstermeye devam ederse, onlar diseksiyonu sırasında hasar görmüş olması mümkündür, hipoksi odaları / kaslarda meydana gelen, ya da aşırı ele almaktadıruyarıcı elektrotlar aracılığıyla ctrolysis serbest radikaller oluşturuyor. Westerblad önce 400 mA den büyük akımlar serbest radikallerin ²³ oluşumunu teşvik önerdi. Diğer metaller kesinlikle serbest radikal oluşumunu ve kas toksisitesi yana Açıkçası, yüksek kalite platin, önerilmektedir.
4. 25 ° C'de deneyler yaparken 30-60 s periyodik, 1-140 Hz (5-10 Hz artışlarla): Aşağıdaki stimülasyon frekansları ile kasları uyararak kuvveti vs frekans ilişkisi (FF) elde 37 ° C'de deneyler yaparken, daha yüksek diyafram kası için 300 Hz kadar frekansları, soleus için 180-200 Hz, ve EDS için 220-250 Hz FF uzatmak. Sonraki, maksimal tetanik kuvveti (T _max) ve yaklaşık ½ maksimal tetanik kuvvet (1/2 T _max) üretir stimülasyon frekansı belirlemek; bazen EDL ve tek hem de tam ½ T _max elde etmek zordurÇünkü bu kaslar arasındaki içsel farklılıkların tek uyarıcısı kaynağı kullanılmakta ise bize kasları. Bir kalıcı bir çözüm T _max% 30-70 üreten bir frekans tespit etmektir. Uyarım bu frekanslar için gerekçe ½ T _max Ca ^{2 +} düzenleme ve ECC sürecine daha uygun bilgi sağlarken, T _max, kontraktil makine olaylar / modülasyon önemli bilgiler sağlar olmasıdır. Kas uyarıcı iken maksimum kuvvet elde edilmiştir emin olmak için, 10-20 mM kafeinin banyo çözeltisine ilave edilebilir. Maksimal kuvvet gelinmişse, kuvvet kafein varlığında artmaz. FF sağa kaydırmış ve güçleri yüksek deneysel sıcaklıklarda biraz daha yüksek olma eğilimindedir edilir. Bu sistemi kullanarak, herhangi bir diğer uyarım frekans arzu edilen ise yapılabilir. Hızlı glikolitik EDL kasının kasılma farklı profil ve yavaş oksidatif soleus kasŞekil 2 de gösterilmiştir.
5. Dengelenme sonrası, yorgunluk 2 s uyarılması aralığı ve% 25 görev döngüsü (Şekil 3) ile 5 dakika, ½ T _max kasları. Bu özel yorucu protokol daha sarkoplazmik retikulum Ca ² kas kasılması ^{31 +} sürümü katkısı yansıttığı kabul edilir.
6. 1 dk aralığında, 30 dk için ½ T _max kuvvet ya da kararlı hale gelene kadar kas kurtarma. Ek bir yorucu protokol kontraktil makine ³¹ durum yansıttığına inanılır T _max uyarım kullanılarak şu anda gerçekleştirilebilir. Başka bir seçenek halsizlik sırasında T _max ve ½ T _max üretmek ve stimülasyon aynı tip kasları kurtarmak için uyarıcı trenler enterkale için yorucu protokolü yaymaktır.
7. Olarak adım 3.4 'te açıklandığı FF tekrarlayın; gerekçesi olmasıyla fark arasındaki fenotipik farklılıklarınerent suşları, hastalık modelleri, ya da ilaç tedavileri yorgunluk öncesi ve sonrası FF analiz ederek görülebilir. Biz örneğin daha önce yaşlı kaslardan kaslarda, yaşlanmanın bir fonksiyonu olarak iskelet kas yorgunluğu diferansiyel düzenleyici etkileri düşündüren, sağa kaymış ise yorgunluk sonrası genç vahşi tip kas FF, sola kaydırılır bildirdi.
8. Ekstrasellüler Ca ² kas kontraktilite ⁺ giriş katkısını araştırmak için, banyo çözümü hiçbir Ca ^{2 +} ama 0.1 mM EGTA (0 mM Ca ^{2 +} Tyrode solüsyonu) ³² içeren bir çözüm içine değiştirilebilir. Alternatif olarak, depo ile çalışan, farklı kanal blokerleri banyo çözeltisi içinde uygulanabilir. Bazı örnekler şunlardır: 2-aminoetil diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-bis (triflorometil) pirazol 2 (BTP-2) ve azumolene, vs ^{33, 34.} Kafein, riyanodin reseptörünün fonksiyonunu araştırmak için kullanılabilir, ve KCl genel olarak değerlendirilmesi için kullanılabilmektedirbu preparatların depolarizasyon özellikleri. Diğer ilaçlar da Na ^+, K ile yorgunluk esnasında güç modülasyon önemli araştırmak için kullanılabilir ⁺ ve Na ^{+-K +} pompa ^35. Bu ilaçların çoğu nispeten küçük boyutlarda olması ve hızlı bir şekilde hemen ortaya çıkan etkileri ile kanıtlandığı gibi bu kas preparatlarında difüze görünüyor. Herhangi bir ilaç ile bir etkisi olmaması zorunlu olarak ilaç etkisiz olan ve tek bir kas lifi deneylerde kullanılan çok daha yüksek doz kullanılarak ek testler bazen gerekli olduğu anlamına gelmez.
9. ^{/ - -} Kasları ^{4, 30} Bu ex vivo sistemin biri benzersiz uygulama trik-bir mekanik alternansı son keşfi yol açtı. Alternans yorucu profilin azalma aşaması esnasında kasılma kuvveti değişen seri bölüm olarak tanımlanır. Bu olaylar sırasında kasılma kuvveti anlık esnasında güç önceki seviyesinden artırabilirstimülasyon yorucu olduğunu ya daha Ca ^{2 +} piyasaya sürülüyor veya kontraktil makine Ca ^{2 +} daha duyarlı hale gelmiştir çünkü. Kasılma kuvveti salgını% 50, bir önceki gücü daha yüksek ve salgınlar 5 dk yorgunluk stimülasyon sürecinde en az 10 kez görülmelidir olmak zorundadır. Mekanik alternans yabani tip farelerden alınan iskelet kası içinde yaygın değildir, ancak bu gibi hücre içi trimerik Katyon kanal tip A (mide-a) 'nın, hücre içi ^{Ca2 +} sinyali işlemi pertürbasyon ile bazı mutant kas görülebilir ^{- / -} kas ^4. Mekanik alternansı yorucu uyarımlar yoluyla indüklenen olabilir, kafein ve siklopiazonik asit (CPA) ile tedavi, bu mekanik alternansı bir temsilci kaydı için Şekil 3'e bakın. Yorucu bir kas anlık daha fazla güç üretmek mümkün gibi görünüyor, oysa bu olayın doğası, oldukça ilgi çekicidir. Bir önceki yayında, Tek bir hücre ^{Ca2 +} ile birlikte incelendiğinde, alternans görünümünü SR ^{Ca2 +} aşırı yük ve kararsız SR bir sonucu olduğunu ortaya koymaktadır. Biz alternans daha derin bir anlayış ECC sürecinin daha iyi anlaşılmasına neden olabilir inanıyoruz.
10. Deneyin sonunda, kalibre pergeli ile analitik terazi kullanılarak tek tek kas boy ve ağırlık ölçmek sıvı nitrojen içinde dondurulur flaş kas ve -80 ° C'de kurtarmak, biyokimyasal analizler bunların kaslardaki gerçekleştirilebilir beri. Bu kaslar, aynı zamanda ECC sürecinin ayrıntılı tarama için mekanik olarak derili olabilir, ya da ECC düzenleyici mekanizmaların yokluğunda gerekli kasılma özelliklerini tespit etmek için kimyasal olarak kaplanamayabilir.
11. Kaydedilmiş kas kuvveti (mV) birinci gram kuvvet dönüştürülür kalibrasyon sonuçlarına dayalı olarak ve daha sonra aşağıdaki formüle göre fizyolojik kesit alanı (PCSA) normalize: kas kuvveti (N / cm ²⁾ = (güç (g) x kas length (cm) x 1.06) / (kas ağırlığı (g) x 0,00981) ^5,36. Alternatif olarak, kas kuvveti total protein veya Bradford protein tayini / Commossie mavisi boyama kantifikasyon kullanarak bireysel kasın toplam aktin içeriğe normalize edilebilir. Belirli koşullar altında kas kütlesi ise ciddi bir hastalık nedeniyle, yaşlanma, ilaç tedavileri, kas kitlesi, protein ve / veya aktin içeriğine dayalı kuvvet normalleşme daha istikrarlı bir okuma sağlayabilir etkilenmiş olabilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Düşük, orta ve yüksek frekans uyaranlara yanıt EDS ve soleus Tipik oda sıcaklığında kontraktil güçler Şekil 2 'de gösterilmiştir. 5 Hz uyaranlar ile oluşan EDL daralma SERCA Ca ^{2 +} ATPaz ve intrinsik Ca ^{2 +} kontraktil makine hassasiyet özelliklerini, 5 Hz soleus kasılması (yavaş ATPaz kaynaştırmak için başlar iken bir en hızlı eylem nedeniyle bireysel seyirmesi olarak kalırd yüksek Ca kontraktil makine ^{2 +} duyarlılık), ancak tepe güçleri hala ayrıdır. Soleus bu tamamen erimiş tetanik kuvvet oluşturur ise 20 Hz stimülasyon anda, EDS kasılmaları kısmen kaynaşmıştır. Aksine, T _max 80-110 soleus için EDS ve 60-90 Hz Hz, hızla yukarı doğru vuruş ve EDS tetanik kuvvetinin hızlı gevşeme oda sıcaklığında değişebilir uyarım, not edilir üreten stimülasyon frekansta Soleus kasının yavaş özellikleri. Şekil 2B soleus kas herhangi bir frekansta Ca ^{2 +} sürümü daha duyarlı olduklarını gösteren, soleus göre EDL kas kuvveti-frekans eğrisi sağa kaymış olduğunu göstermektedir Yavaş miyozin ve troponin izoformlarının varlığı nedeniyle uyarılması. Buna ek olarak, kasılma makine düşük frekanslarda soleus içinde göreli daha fazla kuvvet ile cevap verir. Şekil 3 kezEDL (üst panel) ve soleus (orta panel) sa Normal yorgunluk profili. EDL kasının yorucu uyarımı altında kasılma yürürlükte hızlı düşüş ve 5 dk yorgunluk protokolü sonunda yürürlükte yüksek azalma unutmayın. Son olarak, bir mutant kas tipik bir mekanik alternan profil kas yorgunluğu profilin azalan aşamasında anlık güç salgınları gibi tanımlanmıştır Şekil 3 (alt panel) 'de gösterilmiştir. Kasılma kuvveti salgını% 50, bir önceki gücü daha yüksek ve salgınlar 5 dk yorgunluk stimülasyon sürecinde en az 10 kez görülmelidir olmak zorundadır.

Şekil 1. 4-kanal ex vivo kontraktilite sisteminin şematik çizimi. Kare dalga darbeler bir Grass stimülatörü kontrol bir bilgisayar tarafından oluşturulur. İki stimülasyon izolasyon üniteleri elektrik kaynaklı uyaran filtretrical stimülatör ünitesi elektrik sinyali dalgalanmaları ortadan kaldırmak ve istikrarlı bir kare dalga sinyali kurmak. Bu filtre elektrik sinyali her bir izole kas çevreleyen platin tel elektrot içeren 4 banyo odalarına gönderilir. Sonuçta, bu bir aksiyon potansiyeli oluşturur iki elektrot (alan stimülasyonu denir), kas kasılması uyaran karşısında akımıdır. Bu daralma köprü amplifikatörler aktarılan belirli bir kuvvet dönüştürücüleri tarafından algılanır, süzülür, ortalama (sinyal şartlandırma) ve bir A / D çevirici ile bilgisayar yazılımı tarafından kaydedilen.

Şekil 2. . EDL ve soleus arasında kuvvetler Örnek kasılma (A), kontraktil güçler 5 Hz (üst panel), 20 Hz (orta panel) ve maksimal tetanik kuvvet _(Tmax) (alt panel) ile oluşturulan, bir giriş kasılma gücünün bir izi gösterir düz kas hasarının, (B) birtemsili bir kuvvet vs frekans ilişkisi EDS (FF, üst panel) ve FF (alt panel) kaynaklanan eğriye bireysel kasılmalar gösteren ayarlayabilirsiniz. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. Örnek profil ve mekanik alternansı yorucudur. EDL kasının (üst panel) ve soleus (orta panel) profili yorucu yavaş düşüş tipik hızlı düşüş yorucu profili. Uyarım yorucu içinde mekanik alternans ortaya çıkmasına yol açan bir mide-a ^{- / -} rahatsız Ca ^{2 +} işleme özellikleri (alt panel) ile kas.

Discussion

Kasılma kuvveti ve kolay yorulma ölçülmesi iskelet kas fonksiyonunun genel değerlendirme için önemlidir. Bu testin ana amacı bu sarkopeni ve kas yorgunluğu gibi bazı patolojik şartlar altında kas kuvveti değişiklikleri ve yorucu özelliklerini tespit etmek, ve kas kasılma uyuşturucu / reaktiflerin etkisinin test etmektir. Kas kuvveti yakından hücre içi Ca ² ile ilişkili olduğu için ⁺ sürümü, ekstrasellüler ^{Ca2 +} girişi ve bu ikisi arasındaki karışma, biz de bu yöntemi kullanarak Ca ² hakkında daha fazla bilgi ⁺ iskelet kasında sinyal durumunu toplayabilir. Burada yorucu profilinin düşüş evresinde kasılma kuvvetinin dalgalı patlama atakları bir aşırı ve dengesiz SR altında görüldü "mekanik alternansı" olarak adlandırılan benzersiz bir fenotipi gösterdi. Bir bekliyoruz ki değişmiş kuvvet, FF, bitkinlik, kasılma kinetiği ve kurtarma ab dahil iskelet kas fenotipleri çeşitliyorgunluk sonra kararlılığını çeşitli patolojik koşullar altında in vitro kontraktilitesini deneyde kullanılarak tespit edilebilir.

Bu tahlil için en kritik adım hasarsız kepekli sağlam kaslar (veya kas demetleri ve kas şeritleri) izole etmektir. Böyle bir hedef bütün kas preparatları elde edilmesi daha kolaydır. Burada yeterince bağlar ve tendonlar tüm kasları kravat bırakarak kas hasarına ve sonuçta kas ölüme kadar giden kas kendisi, bağlama önlemek için çok önemli olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, bikarbonat tabanlı çözümler için HEPES bazlı solüsyonların ya da O ile ₂ CO ₂ bir karışımı halinde% 100 _O2 ile ya da çözeltilerin sürekli köpüren önemlidir. Bir akış ölçer kullanılabilir iken önlenmesi hipoksi ve hiperoksi önemlidir. Biz de belli bir durumda doku banyo sıvılarda çözünmüş oksijen ölçer, belirli bir cihaz kullanılır. Kasları mor olan belli koşullar altındazarar eğilimli e, kuvvet dönüştürücü montaj önce bir Ca ^{2 +} ücretsiz bir çözüm olarak izole kas tutarken kas dinlenmek ve deney öncesi kas hasarı en aza indirmek için yardımcı olacaktır. Bu tür ilaçlar gibi 2,3 - butanedione monoxime (BDM) ya da N-benzil-p-toluen sülfonamid (BTS) da kasılma çalışması için yaygın olan, kas demetleri ya da kas şeritleri hazırlanmıştır, özellikle zararı en aza indirmek için teşrih sırasında eklenebilir Diyafram ^{37, 38.} Kayıt sırasında, hasarlı preparatlar normalde daha az güç üretecek ve (Şekil 2 girişine bakın) bazal gürültü ve dalgalanmalar artmış ve hasarlı yanıtları analiz deney parçası olmadıkça bu kasları gelen sonuçlar, analizler veri kümesinden hariç tutulabilir kasları. Kolayca göz ardı ya da unutulacak bir başka nokta elektriksel stimülasyon kendisi kaslar için toksisite kaynağı olabilir olmasıdır. Biz periyodik elektrotlar ve chamb temizlemenizi tavsiyemonte kas uzunluğunu ayarlamak, herhangi bir kirletici protein artıkları, oksidasyon birikim vb özel önlemler çıkarmak için bir% 1 hipoklorit çözeltisi ile er de ihtiyaç vardır. Bu, etkin bir çapraz-köprü ³⁹ işleyişi için kritik olan ince ve kalın filamentler arasındaki en iyi hizalama gibi fazla-germe önlemek için küçük adımlar halinde germek için önemlidir. Buna ek olarak, bu alan uyarımı elektrotlar için monte edilmiş kas demetleri göre göreli konumu ayarlanabilir sabit tutulur ve elektrik akımına eşit miktarda olmak için tüm kanallar arasında hizalanmış izole kas uygulanmış olması tavsiye edilir. Antibiyotikler,% 0.2 FCS, ve amino asitler banyo solüsyonu eklenir eğer bizim deneysel koşullar altında, genç vahşi tip farelerin kaslarının 12 saat boyunca stabil kalır ve hatta daha uzun.

Bakım ve uygun kontrolü ile, bu ex vivo sistem Ca ² arasındaki korelasyon hakkında bilgi verebilir ⁺ bir sinyalvasküler, endokrin ve sinir sistemlerinin karmaşıklığı olmadan d kas kasılması. SR Ca ^{2 +} sürümü disfonksiyonu genellikle düşük kasılma kuvveti ve hızlı yorucudur profili verir Örneğin, ekstraselüler Ca ² bağımlılığı kaybı ⁺ yaşlı iskelet kası bir imzadır. SR ^{Ca2 +} aşırı yük ve dengesizlik üreten patolojik koşullar altında oldukça aynı zamanda diğer iskelet kasları içinde kasları, fakat ^{- / -} burada örneklenmiştir olarak, mekanik alternans görünümünü biz mide-a ile sınırlı değildir inanmak kararsız SR belirtir. Bu kurulum çeşitli fizyolojik ve farmakolojik manipülasyonları için kas doğrudan erişim sağlar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5