Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

Summary

Descriviamo un metodo per misurare direttamente la forza muscolare, potenza muscolare, cinetica contrattili e affaticabilità dei muscoli scheletrici isolati in un

Abstract

Qui descritto è un metodo per misurare la contrattilità dei muscoli scheletrici isolati. Parametri come forza muscolare, potenza muscolare, cinetica contrattili, affaticabilità, e il recupero dopo la fatica può essere ottenuta per valutare aspetti specifici della eccitazione-contrazione (ECC) di processo quali eccitabilità, contrattilità macchinari e Ca ^{2 +} capacità di movimentazione. Questo metodo elimina la fornitura nervoso e sangue e si concentra sul muscolo scheletrico isolato stessa. Abbiamo regolarmente usare questo metodo per identificare i componenti genetiche che alterano la proprietà contrattile del muscolo scheletrico se modulanti Ca ^{2 +} vie di segnalazione. Qui, descriviamo un fenotipo appena identificato muscolo scheletrico, cioè, alternans meccanico, come esempio di varie informazioni e ricco che può essere ottenuto usando la prova in vitro contrattilità muscolare. La combinazione di questo test con saggi su cellule singole, approcci genetiche e biochimichesaggi Stry in grado di fornire importanti informazioni sui meccanismi di ECC nei muscoli scheletrici.

Introduction

Muscoli scheletrici allegare ossa dello scheletro e generano forze contrattili sotto il controllo del sistema nervoso centrale. Eccitazione-contrazione (ECC) si riferisce al processo di conversione di uno stimolo elettrico ad una risposta meccanica. Ca ^{2 +} segnalazione è un componente essenziale della funzione contrattile nel muscolo scheletrico. Efficace Ca ^{2 +} mobilitazione dal reticolo sarcoplasmatico (SR) è un componente importante di ECC in cellule muscolari ^{1, 2,} e cambiamenti intracellulare Ca ^{2 +} segnalazione alla base della disfunzione contrattile corrispondente in una serie di malattie muscolari ^3-5. Corretta valutazione della contrattilità muscolare è essenziale e gratuito per Ca ^{2 +} imaging e altri test per acquisire conoscenze in funzione dei muscoli scheletrici, non solo a livello contrattile, ma anche a livello cinetico. Forza e velocità possono anche essere ottenuti per informare l'importante proprietà dimuscolo potenza e lo stato del processo ECC in diverse condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.

Questo campo fecondo di ricerca ha una storia molto ricca e molte teorie di contrazione muscolare è apparso più di due millenni ^6. Di ricerca del muscolo moderna comincia probabilmente in 1674-1682 con l'osservazione microscopica di cross-striature e le miofibrille nelle fibre muscolari di Leeuwenhoek ^6. Quasi un secolo dopo, Luigi Galvani ha osservato che muscolo si contrae rana vigorosamente quando il suo nervo è toccato con bisturi durante una scarica di scintille da una macchina elettrica distante ^7-9. Contrazione potrebbe anche essere prodotto collegando il nervo gamba al muscolo attraverso un conduttore metallico. I dettagli del complesso meccanismo di segnalazione elettrica sostenuti da Galvani finalmente sono stati formulati da Hodgkin, Huxley e Katz nella loro famosa equazione ^{10, 11} che divenne il fondamento di elettrofisiologia. Le osservazioni notevoli di Ringer sugli effetti di Ca ^{2 +} extracellulare sulla contrattilità del cuore rana e nei muscoli scheletrici ^12-15 rappresentano il primo passo importante nel riconoscimento di Ca ^{2 +} come un regolatore chiave della contrattilità muscolare ^{16, 17.} Dal 1980 ad oggi una raffica di scoperte nel campo contrattilità muscolare è stato realizzato a causa dell'introduzione della contrattilità muscolare e affaticabilità protocolli in murine muscoli scheletrici ^18. Jones e Edwards sono stati i primi a suggerire che la fatica a bassa frequenza intermittente (indotta da esercizio fisico riduzione della forza) ¹⁹ è stato associato con modifiche ai macchinari ECC e non l'apparato contrattile. Alla fine del 1980 e all'inizio del 1990, Kolkeck et al ^20, Kolbeck e Nosek ^21, e Reid ²² sono stati utilizzando muscolo diaframma da modelli di roditori per studiare gli effetti della teofillina, cortiosterone, e dei radicali liberi sulla contrattilità del muscolo scheletrico, mentre Brooks e Faulkner sono stati i primi a riferire sulle misure di forza ripetute e misure di potenza in rapida-e-lenti i muscoli di topi ^22. Inoltre, Lannegren, Westerblad, Agnello, e Westerblad stati i primi a collegare direttamente la contrattilità ex vivo con intracellulare di Ca ^{2 +} regolamento e ha iniziato a mettere in discussione il ruolo di acidosi nella fatica muscolare ^{23, 24.}

I nostri laboratori hanno contribuito in modo significativo fin dai primi anni del 2000 verso la comprensione di nuovi geni con modulante e ruoli di regolamentazione sul muscolo ECC con ruoli critici nella contrattilità muscolare, affaticabilità, e l'invecchiamento utilizzando una combinazione di studi intatti topo muscolari contrattilità, intracellulare Ca ² monitoraggio ⁺ in fibre muscolari intatte e dalla pelle e genetico-molecolari manipolazioni ^{3-5, 25-29.}

Qui dettagliato protocollo di sperimentazione per la misurazione della contrattilità murini soleo isolate e estensore lungo delle dita (EDL muscoli), che corrispondono ad una prevalentemente lenta ossidativo (tipo I e fibre muscolari IIa) e un muscolo prevalentemente fast-glyocolytic (tipo IIb e fibre muscolari IIx) con spiccate proprietà contrattili. In questo protocollo, intatte muscolotendinee complessi sono stati isolati e immersi in un sistema PowerLab ADI Radnotti camera fornito sia con ossigeno puro o una miscela di ossigeno (95%) e CO ₂ (5%). Forze contrattili sono stati generati da stimoli elettrici da uno stimolatore Erba e rilevato utilizzando un trasduttore di forza che è stato integrato con un sistema ADI PowerLab/400, consentendo la personalizzazione delle routine macro per controllare l'acquisizione, la raccolta, digitalizzazione e archiviazione dei dati. Questa configurazione può misurare la forza muscolare, potenza muscolare, nonché il rapporto di forza rispetto a frequenza, affaticamento muscolare, recupero da affaticamento muscolare, velocità e complessivi proprietà cinetiche di contrazione muscolare. Inoltre, gli effetti dei farmaci sulla contrazione muscolare può essere monitorata attraverso questi esperimenti. I vantaggi di questo metodo consistevano nel rimuovere i componenti neuronali e vascolari dal muscolo scheletrico, consentendo la valutazione diretta delle proprietà intrinseche di contrazione muscolare. Inoltre, saggi contrattilità ex vivo consentire la manipolazione del mezzo extracellulare che circonda i muscoli isolati, che consente l'uso di manipolazioni farmacologiche dei vari canali ionici permeazione e trasportatori per definire i loro ruoli fisiologici per la funzione del muscolo scheletrico.

Questo sistema ex vivo ci ha permesso di scoprire recentemente un comportamento distinto alternan in taluni preparati muscolari mutanti, che erano legate ad una alterata intracellulare di Ca ^{2 +} la gestione delle proprietà ^4. Alternanza sono definiti come episodi scoppio fluttuanti di forza contrattile durante la fase di declino del profilo faticosa. Durante questi eventi forze contrattili momentaneamente aumentare di sopra del suo livello precedente di forza durante la stimolazione faticoso, forse perché più o Ca ^{2 +} è stato rilasciato o la macchina contrattile è diventato più sensibile alle Ca ^{2 + 30.} Trattamento con acido ciclopiazonico (CPA), un bloccante reversibile-sarcoplasmatico reticolo endoplasmatico calcio ATPasi (SERCA), caffeina, un agonista del canale rianodina (RyR) e faticoso stimolazioni ripetute possono indurre alternans meccaniche ^4, suggerendo che alternans sono direttamente collegate modulazione del processo di accoppiamento CE. Dimostrazione del metodo per indurre e registrare in alternanza meccanici in configurazione contrattilità in vitro serve come esempio per mostrare i parametri diversificati sperimentali che potrebbero essere ottenuti con questo sistema o simili, sulla base di interessi di ricerca individuali.

Questo metodo può essere di interesse per i ricercatori che studiano la fisiologia muscolare. Configurazione simile può essere utilizzato anche per isolati complessi muscle-tendon/ligament scheletrici di altrisedi anatomiche, nonché per singole fibre muscolari e strisce.

Protocol

Soluzione composizione:

2,5 mM Ca ^{2 +} soluzione di Tyrode: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl _{2, 2 mM} MgCl2 e 10 mM di glucosio

0 mM Ca ^{2 +} Tyrode soluzione: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 _mM MgCl2, 0,1 mM di etilene glicole acido tetraacetico (EGTA) e 10 mM di glucosio

Nota: soluzione balneazione deve essere saturato con 100% O ₂ se si utilizza la soluzione di cui sopra, ma con 95% O ₂ con 5% di CO ₂ se utilizza bicarbonato-based buffer per mantenere costante il pH. 2,5 mM Ca ^{2 +} viene aggiunto al buffer balneazione ricapitolare il livello di Ca ^{2 +} trova nello spazio extracellulare e 10 mM di glucosio è importante poiché mitocondri sono ancora funzionanti in questi muscoli per produrre continuamente ATP in presenza di glucosio.

1. Messa a punto la Ex contrattilità esperimento in vivoil PowerLab ADI sistema

1. Un disegno schematico di un 4-channel contrattilità sistema ex vivo è mostrato in Figura 1. Un computer controlla uno stimolatore per generare impulsi ad onda quadra, che vengono filtrati dall'unità di isolamento a raggiungere una coppia di fili di platino che circonda ciascun isolato muscolotendineo complesso. Questo è anche chiamato stimolazione di campo. Contrazione del muscolo rispondere alla stimolazione è stata rilevata da un trasduttore di forza, il segnale generato dal quale è stato amplificato, filtrato e trasferiti al computer da un convertitore A / D (condizionamento del segnale). Il segnale viene quindi digitalizzato e può essere salvato per successive analisi.
2. Per preparare un esperimento contrattilità ex vivo, prima a stimolatore campo, il convertitore A / D (in questo caso ADI Potenza Lab) o un software simile (per esempio, LabView), seguita dal computer.
3. Aprire Chart4 software (o altra versione di software che è compatibile con il sistema) e initiatea 4 canali compito, una corretta comunicazione del software e l'hardware è indicato avviando configurazione dell'hardware, e il pulsante START sul software diventa operativa (live), il 4 canali funzione permette la misurazione simultanea di una coppia di muscoli da un tipo selvatico e mutante, un mouse o 2 EDL e 2 soleo dal mouse stesso, e può essere utilizzato per altri muscoli come il diaframma (diaframma intero, emi-membrana, o strisce muscolo diaframma) e il tibiale anteriore; può anche essere utilizzata per preparazioni muscolari cardiache e per fasci di muscoli, in particolare se si sta usando muscoli di ratto. In questo caso la dimensione dei muscoli può limitare la diffusione di ossigeno così fasci muscolari sono quindi una scelta migliore. Tuttavia, le tecniche di dissezione esperti sono necessari per le preparazioni fascio muscolare.
4. Taratura del trasduttore di forza: questo è quello di garantire la comparabilità dei set di dati generata in canali diversi e in tempi diversi. In primo luogo di inizio della registrazione, Sequentially appendere un 1-g, 2-ge 5 g-pesi sul boschetto campione del trasduttore di forza, arrestare la registrazione, calcolare le variazioni corrispondenti mV mostrati in ciascun canale di Chart4 software, tracciare la ΔmV e il peso per controllare linearità e determinare il fattore di conversione tra mV e grammi di forza. Si consiglia di eseguire tali calibrazioni o all'inizio o alla fine di ciascun esperimento per assicurare che una taratura specifica si ottiene per ciascun esperimento.
5. Verificare il corretto collegamento del tubo in Teflon, svuotare qualsiasi liquido presente nel tubo bagno di tessuto, lavare le camere di tre volte o più con DDH ₂ O e riempire con 20 ~ 25 ml 2,5 mM Ca ^{2 +} soluzione di Tyrode. Ca ^{2 +} e glucosio sono forniti nella soluzione balneazione per aiutare a mantenere l'integrità della membrana, ottimale Ca ^{2 +} caricamento del SR, e una fonte prontamente disponibile di energia per la produzione di ATP dal muscolo stesso, poiché mitocondri rimangono pienamente funzionale in queste preparazioni.
6. Controllare il corretto collegamento dell'alimentazione di ossigeno, aprire il serbatoio di ossigeno, e regolare il flusso di ossigeno per fornire bubbling diffusiva ed omogenea della camera. Livelli di ossigeno può essere facilmente determinato in funzione della forza contrattile rispetto al tempo. Un misuratore di portata può anche essere installato, in particolare se i ricercatori sono interessati a studiare gli effetti di ipossia o iperossia. Se i muscoli diventano ipossica, la forza diminuisce naturalmente. Mentre iperossia può anche danneggiare muscoli ma i suoi effetti potrebbe essere più difficile da rilevare in quanto molti esperimenti effettuati in condizioni artificiali iperossico per compensare l'assenza di un normale apporto di sangue ai muscoli. Nella maggior parte dei sistemi è possibile bolla diverse camere con la stessa quantità di ossigeno semplicemente controllando il flusso di ossigeno per ogni camera costante.
7. Regolare la sensibilità di tutti i canali per garantire la risoluzione massima forza senza saturare il canale. Sensibilità del canale può variare considerevolmente in funzione di und età dell'animale, la temperatura sperimentale, manipolazioni genetiche, massa muscolare, deformazione del mouse, e la capacità di sperimentatore per analizzare correttamente i muscoli privi di danni. Nella nostra esperienza, quando si misura soleus forza contrattile, la sensibilità varia da 0,5 a 10 mV / cm, mentre nel caso di EDL, la sensibilità può variare 1-20 mV / cm.
8. Un protocollo per la stimolazione affaticante deve essere stabilito. Nel software Chart4 una macro può essere utilizzato. Per programmare una macro nuova: nel software Chart4, fare clic su Start misura, quindi fare clic su Macro, comando Macro, avviare la registrazione, iniziare a ripetere, scegliere la frequenza desiderata stimolo, e quindi di fine ripetizione. Per un protocollo equilibrazione, stimolo viene ripetuto ogni minuto per 30 min e faticoso per il protocollo, stimolo viene ripetuto ogni 2 secondi per 5 min. Questi cambiamenti nella periodicità della stimolazione, influenzano direttamente il ciclo di lavoro, che è anche una funzione della durata di stimolazione. Questi parametri possono essere variati per testare aspe diversatti di contrattilità e affaticabilità.

2. Preparazione fasci muscolari intatte

1. Dissezione EDL: mouse viene sacrificato secondo le linee guida NIH e IACUC protocolli animali istituzionali. Mouse è sacrificati mediante dislocazione cervicale. Mouse viene poi disposto in posizione laterale. Muscolo EDL è un fast-glicolitico muscolare con rosa pallido di colore bianco. Si tratta di circa 10-13 mm di lunghezza e pesa 8-11 mg in di tipo selvatico C57BL / 6 del mouse. L'EDL ha le funzioni di estensione dita 2-5, e dorso-flettere il piede alla caviglia. E 'innervato dal nervo peroneo. Sezionare la EDL, praticare un'incisione cutanea superficiale e tagliare aprire la fascia tra il tibiale anteriore e il gruppo muscolare posteriore, e localizzare l'origine (prossimale) a cui è collegato legamento al condilo laterale della tibia e superiore 3/4 della anteriore superficie della fibula (margine interosseo). Tagliare il legamento con le forbici oftalmici delicati più distalmente possibile del muscolo, questo immissioe rilascia l'origine prossimale del muscolo EDL. Tenere il legamento con una pinza smussate e tirare lentamente per liberare l'EDL. Potrebbe essere necessario tagliare alcuni dei perimisio che circonda i muscoli EDL e gli altri in tutto il EDL, un passo che è critica in quanto potrebbero verificarsi dei danni al muscolo EDL durante questa fase delicata. Quindi, passare alla zona di inserimento in cui i quattro tendini distali inserire nelle falangi medie e distali di 2-5 cifre. Tagliare i tendini quanto possibile dai muscoli.
2. Trasferire il muscolo EDL isolato in un piatto dissezione contenente soluzione isotonica Tyrode. Alcuni modelli animali mutanti, transgenici e knockout hanno muscoli molto fragili e l'utilizzo di Ca ^{2 +} senza soluzione di Tyrode è necessario per evitare di Ca ^{2 +} indotto danno muscolare prima delle misurazioni contrattilità. Successivamente, utilizzare un nodo chirurgico per legare saldamente ad entrambe le estremità del muscolo EDL distalmente dal muscolo possibile. Una buona misura è di legare leggermente superiore alla metà point longitudinale del legamento o tendine. Utilizzare 6-0 sutura dimensioni per questa procedura, e trasferire il muscolo EDL al _2-satura camera di carta igienica O, montare il muscolo sulla scanalatura campione del trasduttore di forza e il gancio cancelleria sul fondo della camera di bagno, ripetere la Procedimento per l'altra gamba. Stiamo anche iniziando a utilizzare un nuovo metodo che contiene i muscoli con morsetti invece di suture. Se l'obiettivo principale è studiare le proprietà cinetiche e / o per ottenere la potenza muscolare, si raccomanda di sutura essere il più breve possibile e la sutura essere sostituito con un asta di metallo.
3. Dissezione Soleo: il soleo è per lo più lento-ossidativo muscolare con ricco di colore rosso. E '~ 1 mm più corta della EDL, ma pesa poco più del EDL. È innervato dal nervo tibiale ed esegue l'azione di flessione plantare del piede. Per analizzare il soleo, accedere al lato posteriore laterale della gamba, mettere da parte il muscolo gastrocnemio che copre normalmente il soleus, e identificare il muscolo con il colore rosso scuro. All'origine (prossimale), tagliare i legamenti collegano alla metà prossimale della tibia posteriore lungo la linea soleal prossimale e 1/3 del perone posteriore; successivo, per l'inserimento (distale), tagliare il tendine calcaneale che si inserisce nella parte posteriore calcagno. Cautela liberare il soleo e installare correttamente il muscolo soleo nella camera bagno come per la EDL.

3. Misurazione contrattilità dei muscoli scheletrici isolati

1. Una volta che i muscoli sono montati in camere singole bagno del tessuto, avviare la registrazione. Maggior parte dei sistemi simili permettono l'azzeramento della linea di base della registrazione forza. Questa funzione è di solito associato con l'amplificatore, nel caso specifico del sistema PowerLab, come funzione dell'amplificatore ponte. Esso facilita l'osservazione dei cambiamenti di base e fornisce un modo conveniente per tutte le contrazioni muscolari da analizzare da zero. Muscoli isolati vengono poi stimolati con impulsi ad onda quadrache può variare ampiamente in funzione delle dimensioni della camera, platino spessore fili, distanza tra i fili, e anche la composizione della soluzione sperimentale. Abbiamo impiegato corrente di 60 mA (abbiamo notato che le correnti superiori a 350 mA sembrano essere dannoso per i preparati muscolari) e treni stimolazione di 350, 500 e 1000 ms, a seconda degli obiettivi di un protocollo specifico. I singoli impulsi ad onda quadra dovuto durata variabile 0,3-1 ms.
2. Il passo successivo è quello di selezionare una frequenza di stimolazione in grado di produrre una stimolazione tetanica fusa (es: ~ 100 Hz per consentire la produzione di massima forza nei muscoli EDL e ~ 60 Hz in soleo) mentre lentamente e allungamento dei muscoli per identificare la lunghezza ottimale di questi muscoli. Poiché i muscoli sono accuratamente tese, attendere 30 s e stimolare a 100 Hz, attendere 30 s e allungare di nuovo, e poi ripetere la stimolazione, fino al punto in cui la forza non aumenta più.
3. Questi muscoli hanno undergonelettroniche cambiamenti significativi nell'ambiente. Si raccomanda che i muscoli poter adattare al nuovo ambiente, un passo in nostri protocolli chiamato "equilibrio". Equilibrare questi muscoli alla stessa frequenza di stimolazione utilizzato durante la fase di stiramento, 100 Hz per 20-30 min, fino ad almeno 5 consecutivi contrazioni tetaniche sono completamente stabile (non ridurre, non aumentare, linea di base stabile). Periodicità dei treni stimolanti (100 Hz, 500 ms di durata, 1 ms singolo impulso) durante l'equilibrazione è 1 min, il che equivale a un ciclo di lavoro di 1,66%, un non affaticante stimolazione. In questo contesto, un ciclo di 1,66% significa che su un totale di 100%, muscoli stanno lavorando 1,66% del tempo, aumentando i muscoli duty cycle può eventualmente essere indotto a fatica. Se altrimenti muscoli sani, topo wild type mostrano un profilo faticoso durante questo periodo di equilibrio, è possibile che essi sono stati danneggiati durante la dissezione, l'ipossia si verifica nelle camere / muscoli, o ele eccessivactrolysis attraverso gli elettrodi stimolatori genera radicali liberi. Westerblad ha precedentemente suggerito che correnti superiori a 400 mA indurre la formazione di radicali liberi ^23. Ovviamente, il platino di alta qualità si suggerisce, in quanto altri metalli porterà certamente alla formazione di radicali liberi e la tossicità muscolare.
4. Ottenere il rapporto di forza rispetto a frequenza (FF) stimolando i muscoli con le seguenti frequenze di stimolazione: 1-140 Hz (in incrementi di 5-10 Hz), con una periodicità di 30-60 s quando eseguire esperimenti a 25 ° C. Durante l'esecuzione di esperimenti a 37 ° C, estendere la FF per alte frequenze fino a 300 Hz per il muscolo diaframma, 180-200 Hz per soleo, e 220-250 Hz per EDL. Successivo, identificare la frequenza di stimolazione che genera la forza massima tetanica (T _max) e circa ½ massima forza tetanica (1/2 T _max), a volte è difficile ottenere l'esatta ½ _max T sia EDL e suolasiamo muscoli se solo una fonte stimolatore viene utilizzato, a causa delle differenze intrinseche tra questi muscoli. Una possibile soluzione è quella di identificare una frequenza che produce 30-70% del T _max. La logica di queste frequenze di stimolazione è che T _max fornisce importanti informazioni di eventi macchine contrattili / modulazione, mentre il T _max ½ fornisce informazioni più pertinenti al Ca ^{2 +} regolamento e il processo di ECC. Per essere certi che la forza massima è stato raggiunto, 10-20 mM caffeina può essere aggiunto alla soluzione di bagno stimolando il muscolo. Se la forza massima è stato raggiunto, la forza non aumenta in presenza di caffeina. La FF è spostato a destra e forze tendono ad essere leggermente superiore a temperature più elevate sperimentali. Utilizzando questo sistema, eventuali altre frequenze di stimolazione può essere eseguita se desiderabile. Il profilo distinto contrattile di un fast-glicolitico muscolo EDL e un lento-ossidativo muscolo soleo èmostrato in Figura 2.
5. Dopo equilibrazione, fatica i muscoli ½ T _max per 5 min, con intervallo di stimolazione di 2 s e duty cycle 25% (Figura 3). Questo protocollo faticoso specifico si crede di riflettere meglio il contributo del reticolo sarcoplasmatico Ca ^{2 + libero} per la contrattilità muscolare ^31.
6. Recuperare il muscolo a ½ T _max per 30 minuti o fino a quando la forza è stabile, a intervallo di 1 min. Un protocollo affaticante aggiuntivo può essere eseguita utilizzando ora stimolazione T _max, che si ritiene riflettere lo stato della macchina contrattile ^31. Un'altra opzione è quella di estendere il protocollo faticosa di intercalare treni stimoli che generano T _max e T _max ½ durante stanchezza e per recuperare i muscoli con lo stesso tipo di stimolazione.
7. Ripetere la FF, come descritto al punto 3.4, la logica è che le differenze fenotipiche tra diffceppi di erenti, modelli di malattia, o trattamenti farmacologici può essere osservato analizzando la FF, prima e dopo la fatica. Abbiamo per esempio precedentemente riportato che dopo l'affaticamento muscolare giovani di FF di tipo selvatico viene spostato a sinistra, mentre in muscoli di muscoli invecchiati, è spostato a destra, suggerendo effetti differenziali modulatori di affaticamento muscolare come una funzione dell'invecchiamento.
8. Per sondare il contributo del Ca ^{2 +} extracellulare iscrizione contrattilità muscolare, soluzione di bagno può essere trasformato in una soluzione non contenente Ca ^{2 +,} ma 0,1 mM EGTA (0 mM Ca ^{2 +} soluzione Tyrode) ^32. In alternativa, bloccanti diverse negozio-operated canale può essere applicato nella soluzione di bagno. Alcuni esempi sono: 2-amminoetil diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-bis (trifluorometil) pirazolo 2 (BTP-2) e azumolene, ecc ^{33, 34.} Caffeina può essere usato per sondare la funzione del recettore rianodina, KCl e può essere utilizzato per valutare la complessivaproprietà depolarizzazione di questi preparati. Altri farmaci possono anche essere usati per studiare la modulazione importante della forza durante fatica dal Na ^+, K ^+, Na ⁺ e K ^{+-pompe 35.} La maggior parte di questi farmaci sono di dimensioni relativamente piccole e sembrano diffondersi rapidamente in queste preparazioni muscolari, come evidenziato dai loro effetti immediati. La mancanza di un effetto da eventuali farmaci somministrati non significa necessariamente che il farmaco è inefficace e ulteriori test utilizzando dosi molto superiore a quello utilizzato negli esperimenti singole fibre muscolari sono talvolta necessari.
9. Un'applicazione unica di questo sistema ex vivo ha portato alla recente scoperta di alternanza meccanici in tric-a ^{- / -} muscoli ^{4, 30.} Alternanza sono definiti come episodi scoppio fluttuanti di forza contrattile durante la fase di declino del profilo faticosa. Durante questi eventi forza contrattile può momentaneamente aumentare di sopra del suo livello precedente della forza durantefaticoso stimolazione perché sia più Ca ^{2 +} è stato rilasciato o la macchina contrattile è diventato più sensibile alle Ca ^{2 +.} L'epidemia di forza contrattile deve essere superiore del 50% la sua forza precedente e le epidemie va visto almeno 10 volte durante il processo di 5 minuti stimolazione fatica. Alternans meccanico non sono comuni nel muscolo scheletrico di topi di tipo selvatico, ma può essere visto in alcuni muscoli con mutanti perturbazione intracellulare Ca ^{2 +} processo di segnalazione quali il tipo trimerica intracellulare canale cationico A (tric-a) ^{- / -} muscolare ^4. Alternanza Meccanico può essere indotta attraverso stimolazioni affaticanti, il trattamento con acido caffeina e ciclopiazonico (CPA), si veda la Figura 3 per la registrazione rappresentante di questi alternanza meccaniche. La natura di questo fenomeno è abbastanza intrigante, mentre un muscolo che è faticoso sembra in grado di produrre un attimo più forza. Nella nostra precedente pubblicazione, Combinazione con cella singola Ca ^{2 +} analisi rivela che aspetto di alternans è un risultato di SR Ca ^{2 +} sovraccarico e instabile SR. Noi crediamo che una più profonda comprensione di alternanza potrebbe condurre ad una migliore comprensione del processo di ECC.
10. Alla fine dell'esperimento, misurare la lunghezza e il peso dei singoli muscoli calibrato utilizzando pinza e bilancia analitica, Flash congelato il muscolo in azoto liquido e registrare a -80 ° C, poiché le analisi biochimiche può essere eseguita in questi muscoli. Questi muscoli possono anche essere meccanicamente di pelle per sondare dettagliata del processo ECC, o essere chimicamente scuoiati essenziali per la determinazione delle proprietà contrattili in assenza di meccanismi regolatori ECC.
11. Forza muscolare registrata (mV) viene prima convertito forzare gram sulla base dei risultati di taratura e poi normalizzati alla fisiologica sezione trasversale (PCSA) utilizzando la seguente formula: Forza muscolare (N / cm ²⁾ = (forza (g) x muscolare lungezzah (cm) x 1,06) / (peso muscolare (g) x 0,00981) ^5,36. In alternativa, la forza muscolare può essere normalizzato alle proteine ​​totali o contenuto actina totale del singolo muscolo mediante saggio Bradford proteine ​​/ Commossie quantificazione colorazione blu. In determinate condizioni, mentre la massa muscolare può essere gravemente danneggiata a causa di malattie, senescenza, trattamenti farmacologici, la normalizzazione vigore sulla base della massa muscolare, proteine ​​e / o contenuti actina in grado di fornire una lettura più stabile.

4. Risultati rappresentativi

Tipici forze temperatura ambiente contrattili di EDL e soleo rispondenti a bassa frequenza, stimoli intermedie ed elevate sono mostrati in Figura 2. EDL la contrazione indotta da stimolo 5 Hz rimane come contrazioni individuali dovuti all'azione veloce del Ca ^{2 +} SERCA ATPasi e l'intrinseca Ca ^{2 +} proprietà di sensibilità dei macchinari contrattile, mentre la contrazione soleo da 5 Hz inizia a fondere (ATPasi un lentod una maggiore sensibilità al Ca ^{2 +} della macchina contrattile), ma le forze di punta sono ancora separati. A 20 Hz stimolazione, contrazioni EDL sono parzialmente fuse mentre quella del soleo forma una forza completamente fusa tetanica. Alla frequenza di stimolazione che produce stimolazione T _max, che può variare a temperatura ambiente 80-110 Hz per EDL e 60-90 Hz per soleus, salita veloce e rilassamento veloce della forza tetanica in EDL sono noti, che è contrario le caratteristiche lenti del muscolo soleo. Figura 2B mostra che la forza-frequenza curva del muscolo EDL viene spostato a destra rispetto al muscolo soleo, indicando che soleo sono più sensibili al Ca ^{2 +} rilascio in qualsiasi data frequenza di stimolazione per la presenza della miosina lenta e isoforme troponina. Inoltre, il meccanismo contrattile risponde con relativa forza più in soleo a frequenze più basse. Figura 3 mostrasa profilo normale affaticamento del muscolo EDL (pannello superiore) e soleo (pannello centrale). Notare la riduzione più rapida forza contrattile sotto stimolazione affaticante nel muscolo EDL e la maggiore diminuzione vigore alla fine della 5-min protocollo affaticamento. Infine, un profilo tipico alternan meccanica di un muscolo mutante è stato mostrato in Figura 3 (pannello inferiore), che è stato definito come focolai forza momentanea durante la fase declinante profilo affaticamento muscolare. L'epidemia di forza contrattile deve essere superiore del 50% la sua forza precedente e le epidemie va visto almeno 10 volte durante il processo di 5 minuti stimolazione fatica.

Figura 1. Disegno schematico di un 4-channel contrattilità sistema ex vivo. Onda quadra impulsi vengono generati da un computer che controlla un stimolatore Grass. Due unità di isolamento stimolazione filtrare lo stimolo proveniente dalla eletstimolatore unità elettriche per eliminare eventuali fluttuazioni del segnale elettrico e di stabilire un segnale stabile onda quadra. Questo segnale filtrato elettrico viene inviato alle camere 4 balneari contenenti gli elettrodi di platino fili circostanti ciascun muscolo isolato. In definitiva, è la corrente attraverso i due elettrodi (chiamato stimolazione di campo) che generano un potenziale di azione, inducendo la contrazione del muscolo. Questa contrazione è rilevata da un trasduttore di forza specifici, trasmessi agli amplificatori a ponte, filtrata, media (condizionamento del segnale) e registrato dal software per computer tramite un convertitore A / D.

Figura 2. . Rappresentativi forze contrattili di EDL e soleo (A) forze contrattili indotta da 5 Hz (pannello superiore), 20 Hz (pannello centrale) e la massima forza tetanica (T _max) (pannello inferiore), ingresso mostra una traccia di forza contrattile di un danneggiato muscolare; (B) undi rappresentanza istituito mostrando le contrazioni singole di una forza contro relazione frequenza in EDL (FF, pannello superiore) e la curva tracciata risultante dalla FF (pannello inferiore). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Rappresentante faticoso profilo e alternanza meccaniche. Un profilo tipico rapido declino faticoso del muscolo EDL (pannello superiore) e il lento declino faticoso il profilo del muscolo soleo (pannello centrale). Faticoso stimolazione porta alla comparsa di alternanza meccanici in un tric-a ^{- / -} muscolare con disturbati Ca ^{2 +} proprietà di lavorazione (pannello inferiore).

Discussion

Misurazione della forza contrattile e affaticabilità è importante per la valutazione complessiva della funzione muscolare scheletrico. Lo scopo principale di questo test è quello di identificare i cambiamenti nella forza muscolare e le proprietà affaticanti in determinate condizioni patologiche, come sarcopenia e l'affaticamento muscolare, e per testare l'effetto dei farmaci / reagenti sulla contrattilità muscolare. Dal momento che la forza muscolare è strettamente correlato con intracellulare Ca ^{2 + libero,} extracellulare Ca ^{2 +} ingresso e il crosstalk tra i due, possiamo anche raccogliere informazioni su Ca ^{2 +} segnalazione stato nel muscolo scheletrico utilizzando questo metodo. Qui abbiamo mostrato un fenotipo unico chiamato "alternanza meccanico" quando episodi scoppio fluttuanti di forza contrattile durante la fase di declino del profilo faticosa sono stati visti nel quadro di un SR sovraccarico e instabile. Ci si potrebbe aspettare che una varietà di fenotipi muscolo scheletrico compresa la forza alterato, FF, affaticabilità, cinetica contrattili e recupero ability dopo fatica può essere rilevato utilizzando il saggio in vitro contrattilità in diverse condizioni patologiche.

La fase più critica per questo saggio è quello di isolare intere muscoli intatti (o fasci muscolari e strisce muscolari) privi di danni. Tale obiettivo è più facile da realizzare in preparazioni muscolo intero. Qui mostriamo che lasciare abbastanza legamenti e dei tendini di legare i muscoli tutto è molto importante per evitare legare il muscolo stesso, che porta ad un danno muscolare e infine la morte del muscolo. Inoltre, bolle costante di soluzioni sia con O ₂ al 100% nel caso di HEPES soluzioni a base di una miscela di O ₂ e CO ₂ di bicarbonato di soluzioni basate è critica. Ipossia prevenzione e iperossia è importante mentre un misuratore di portata può essere utilizzato. Abbiamo anche usato in certe situazioni un dispositivo specifico che misura dell'ossigeno disciolto nei liquidi balneari tessuto. In certe condizioni in cui i muscoli sono more soggetto a danni, la manipolazione del muscolo isolato in una Ca ^{2 +-free} soluzione prima di montare il trasduttore di forza aiuterà a rilassare il muscolo e ridurre al minimo il danno muscolare prima dell'esperimento. Farmaci come 2,3 - butanedione monoxime (BDM) o N-benzil-p-toluene sulfonamide (BTS) può anche essere aggiunto durante la dissezione per minimizzare i danni, in particolare se fasci muscolari o strisce muscolari vengono preparati, che è comune per studio contrattilità del diaframma ^{37, 38.} Durante la registrazione, preparazioni danneggiati si generano meno forza e sono aumentati rumore basale e fluttuazioni (vedere inserto di figura 2), ed i risultati di questi muscoli possono essere esclusi dal dataset analisi, a meno che non è parte dell'esperimento per analizzare le risposte di danneggiato muscoli. Un altro punto che può essere facilmente ignorato o dimenticato è che la stimolazione elettrica stessa può essere una fonte di tossicità per i muscoli. Si consiglia di pulire periodicamente gli elettrodi e la Chamber con una soluzione di ipoclorito 1% per rimuovere eventuali contaminanti, detriti proteine, ossidazione accumulo ecc speciali precauzioni devono anche quando si regola la lunghezza del muscolo montato. È importante allungare a piccoli passi per evitare sopra-stiramento come l'allineamento ottimale di filamenti sottili e spessi è fondamentale per un efficiente funzionamento cross-ponte ^39. Inoltre, si raccomanda che la posizione relativa dei fasci muscolari montati gli elettrodi di stimolazione di campo viene mantenuto costante e allineate tra tutti i canali per garantire che la stessa quantità di corrente elettrica viene applicata ai muscoli isolati. Nelle nostre condizioni sperimentali, muscoli da giovani topi wild type rimanere stabile per oltre 12 ore e anche di più se antibiotici, 0,2% FBS, e aminoacidi vengono aggiunti alla soluzione di bagno.

Con una cura e corretto controllo, questo sistema ex vivo in grado di fornire informazioni sulla correlazione tra Ca ^{2 +} segnalando und contrazione muscolare senza la complessità del sistema vascolare, endocrino e il sistema nervoso. Ad esempio, la perdita di dipendenza extracellulare di Ca ^{2 +} è una firma di età compresa tra muscolo scheletrico, mentre SR Ca ^{2 +} rilascio disfunzione produce generalmente minore forza contrattile e veloce profilo faticoso. Come exampled qui, aspetto di alternanza meccaniche indica SR instabile, che a nostro avviso non si limita a tric-a ^{- / -} i muscoli, ma anche in altri muscoli scheletrici in condizioni patologiche che generano SR Ca ^{2 +} sovraccarico e instabilità. Questa configurazione consente l'accesso diretto del muscolo per varie manipolazioni fisiologici e farmacologici.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5