隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

Summary

我々は、直接筋力、筋パワー、収縮動態との単離された骨格筋の疲労を測定する方法を説明します

Abstract

ここで説明するには、隔離された骨格筋の収縮を測定する方法である。そのような筋力、筋パワー、収縮動態、易疲労感、疲労後の回復などのパラメータは、そのような興奮性として興奮収縮連関の特定の側面（ECC）のプロセスは、収縮機構とCa ^{2 +}ハンドリング能力を評価するために得ることができます。この方法では、神経と血液供給を削除し、単離骨格筋自体に焦点を当てています。我々は日常的に変調のCa ^{2 +}シグナル伝達経路のに骨格筋の収縮特性を変更する遺伝的要素を識別するためにこのメソッドを使用します。ここでは、in vitroでの筋収縮性アッセイで使用して得ることができる様々な、豊かな情報の一例として新たに同定された骨格筋の表現型、 すなわち 、機械的交互脈を記載している。単一細胞アッセイ、遺伝的アプローチと生化学とこのアッセイの組み合わせstryアッセイは、骨格筋のECCのメカニズムに重要な洞察を提供することができます。

Introduction

骨格筋は、骨格の骨に付着し、中枢神経系の制御の下で収縮力を発生させる。興奮収縮連関（ECC）は機械的な応答に電気刺激に変換するプロセスを指します。 Ca ^{2 +}シグナル伝達は骨格筋における収縮機能の重要なコンポーネントです。効果的なのCa ^2は筋小胞体（SR）から⁺動員は重要な筋肉細胞^1、2、ECCのための成分と、細胞内Ca ^{2 +}シグナル伝達の変化は、筋疾患^3-5の番号に対応する収縮機能障害の根底にある。筋収縮性の適切な評価は、Ca ²に不可欠と無料でご利用いただけます⁺イメージングおよび他のアッセイは、収縮性のレベルではなく、運動レベルではないだけで、骨格筋の機能についての洞察を得るために。力と速度はまたの重要な特性を知らせるために得ることができる筋力と異なる生理学的および病態生理学的条件下でECC処理のステータス。

この研究分野は非常に肥沃な豊かな歴史と筋収縮の多くの理論は、二千⁶の上に現れました。近代的な筋肉の研究はおそらくレーウェンフック⁶による筋線維のクロス線条と筋原繊維の顕微鏡観察で1674年から1682年に始まる。その神経が遠い電気機械^7月9日から火花放電時にメスで触れたときの、ほぼ一世紀後、ルイジ·ガルバーニはカエルの筋肉の収縮を激しくすることを観察した。収縮はまた、金属導体を介して筋肉に脚の神経を接続することによって生成することができる。ガルバーニが提唱する複雑な電気シグナル伝達機構の詳細は、最終的には電気生理学の基礎となった彼らの有名な方程式^10,11にホジキン、HuxleyとKatzによって策定されました。凛の驚くべき観察カエルの心臓や骨格筋^12月15日の収縮に細胞外Ca ^{2 +}の影響についてドイツは筋収縮性^16、17の重要な調節因子としてのCa ^{2 +}の認識の最初の大きな一歩を表しています。 1980年代から現在に至るまで筋収縮フィールドで発見のバーストが原因で筋肉の収縮およびマウス骨格筋¹⁸で疲労プロトコルの導入を実現しました。ジョーンズとエドワーズは、低周波断続的疲労（力の運動誘発還元^）19は ECCの機械ではなく、収縮装置の変化は認められなかった。示唆する最初でした一方、1980年代後半と1990年代前半に、Kolkeck ら ^20、ベックとノセク^21、リード^22は 、骨格筋の収縮にテオフィリン、cortiosterone、およびフリーラジカルの影響を研究する齧歯類モデルから横隔膜筋を使用していたブルックスとFaulknerがマウス²²から高速と低速の筋肉の力が繰り返されると、パワー測定の測定結果を報告する最初でした。また、Lannegren、Westerblad、子羊、そしてWesterbladは直接細胞内Ca ^{2 +}調節にex vivoでの収縮をリンクした最初と筋肉疲労^23,24におけるアシドーシスの役割に疑問を始めました。

私たちの研究所では、大幅に細胞内Ca ^{2 +}の監視で、そのままマウスの筋収縮の研究の組み合わせを使用することによって2000年代初頭に新規遺伝子の理解に向けて調節し、筋肉の収縮、疲労、老化において重要な役割を持つ筋肉のECCに関する規制の役割を持つので、貢献してきました無傷の肌の筋線維と分子遺伝子操作^{3-5、25から29。}

ここでは、マウス孤立ヒラメ筋と長趾伸筋（EDの収縮を測定するための実験プロトコルを詳述L）が異なる収縮特性を主に遅い酸化（タイプIおよびIIa筋線維）と、主に高速glyocolytic筋（IIb型とIIxの筋線維）に対応して筋肉、。このプロトコルでは、無傷の筋腱複合体を単離し、純酸素または酸素（95％）と、CO _2（5％）の混合物のいずれかに付属して、ADI PowerLabのRadnottiチャンバーシステムでびっしょり。収縮力は、草の刺激からの電気刺激によって生成され、マクロのルーチンのカスタマイズは、データの取得、収集、デジタル化、およびストレージを制御することができ、アナログ·デバイセズPowerLab/400システムと統合された力変換器を用いて検出した。このセットアップでは、筋力、筋パワーだけでなく、力対周波数の関係、筋肉疲労、筋肉疲労、スピード、筋収縮の全体的な速度論的性質からの回復を測定することができます。また、筋収縮に対する薬物の効果は、これらの実験を通して監視することができます。 この方法の利点は、筋肉を収縮させるの固有の特性を直接評価できるように、骨格筋から離れて神経や血管成分を除去することにあった。また、ex vivoでの収縮性アッセイは、骨格筋の機能のための彼らの生理的役割を定義するために、様々なイオン透過チャネルやトランスポーターの薬理操作の使用を可能に孤立筋肉を取り囲む細胞外環境の操作を可能にする。

このex vivoのシステムは、私たちが最近変更された細胞内Ca ^{2 +}ハンドリング性⁴に結合されていた特定の変異体の筋肉の準備、の明確なalternan動作を発見することができました。交互脈は疲労プロファイルの衰退期の間に収縮力の変動バーストエピソードとして定義されています。これらのイベントの間に収縮力が瞬間的に力Dのその前のレベルを超えて増加多くのCa ^{2 +が}リリースされているまたは収縮機械がCa ^{2 +を30}に敏感になっているのどちらかが原因と考えられるため、辛い刺激をuring。その交互脈は直接に関係している示唆リアノジンチャネル（RyR）を繰り返し疲労刺激のアゴニストは、すべての機械的交互脈を誘発することができるシクロピアゾン酸（CPA）は、筋小-小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）の可逆的遮断薬、カフェインの治療^4、 ECの結合過程の変調。 in vitroでの収縮のセットアップでのメカニックの交代を誘導し、記録する方法のデモンストレーションは、個々の研究の関心に基づいて、このシステムまたは類似のものを得ることができた多様な実験パラメータを表示する例となっています。

この方法は、筋肉生理学を勉強し研究者に興味があるかもしれません。同様のセットアップは、他から隔離された骨格muscle-tendon/ligament複合体にも使用できます解剖学的部位と同様、単繊維や筋肉のストリップのため。

Protocol

溶液組成：

2.5mMのCa ^{2 +の}タイロード溶液：140mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのHEPES、2.5 mMのCaCl _2、2mMのMgCl _2、10mMグルコース

0 mMのCa ^{2 +の}タイロード溶液：140mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのHEPES、2mMのMgCl _2、0.1mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、10mMのグルコース

注：入浴液は、上記の溶液を使用している場合は_、100％酸素で飽和したが、pHを一定に保つために重炭酸塩ベースのバッファを使用している場合は、5％のCO ₂とO _2を 95％する必要があります。 2.5mMのCa ^{2 +の} Ca ^{2 +}のレベルを再現するために入浴バッファに追加されます⁺細胞外空間に存在し、ミトコンドリアがまだ継続的にグルコースの存在下でATPを生成するように、これらの筋肉に機能しているので、10mMグルコースが重要である。

1。使用段取りエクスビボ収縮実験ADI PowerLabのシステム

1. 4チャンネルエクスビボ収縮システムの概略図を図1に示します。コンピュータはそれぞれ孤立筋腱複合体を取り巻く白金線のペアに到達するために隔離ユニットによってフィルタリングされた矩形波パルスを生成するために刺激を制御します。これは、電場刺激と呼ばれています。刺激に応答して筋肉の収縮は、そこから生成された信号はA / D変換器（シグナル·コンディショニング）することにより、増幅し、濾過し、パソコンに戻す移し、力変換器によって感知された。信号はその後、デジタル化され、後の分析のために保存することができます。
2. ex vivoでの収縮実験、フィールド刺激に最初のターン、A / Dコンバータ（このケースでは、ADIパワー·ラボ）、またはコンピュータに続く同じようなソフトウェア（ 例えば 、LabViewの）ための準備をします。
3. Chart4ソフトウェア（またはシステムと互換性のある他のソフトウェア·バージョン）とinitiatを開くEAの4チャネル·タスク、ソフトウェアおよびハードウェアの適切な通信は、ハードウェアの構成を開始することによって示されており、ソフトウェアのSTARTボタン（ライブ）動作可能になる、4チャンネル機能から筋肉のペアの同時測定を可能に野生型と変異マウス、または2のEDLと同じマウスから2ヒラメ筋、それはそのようなダイアフラム（振動板全体、半絞り、または横隔膜筋ストリップ）と前脛骨筋など他の筋肉に使用することができる;それはまた、1は、ラットの筋肉を使用している場合は特に、心臓の筋肉の準備のためにと筋肉の束のために使用することができます。筋束は、このように優れた選択肢となりますので、この場合は筋肉の大きさは、酸素の拡散を制限することがあります。しかし、専門家の解剖技術は筋束の準備が必要になります。
4. 力変換器の校正：これは別のチャンネルで、異なる時点で生成されたデータセットの比較可能性を確保することです。最初のスタートの記録、セクエンツィアLLY力変換器のサンプル木立に1グラム、2グラムと5グラムの重みをハング、録音を停止し、Chart4ソフトウェアの各チャンネルに示すmVで対応する変化を計算し、直線性を確認するためにΔMVと体重をプロットし、 mVと力のグラムの間の変換係数を決定する。我々は、特定のキャリブレーションは、それぞれの特定の実験のために得られることを保証するために、冒頭または各実験の終了時にこれらのいずれかの校正を行うことをお勧めします。
5. 組織浴チューブ内の任意の存在する液体を排出し、テフロンチューブの適切な接続を確認し、ddH ₂ Oでチャンバーを3回以上洗浄し、20〜25ミリリットルの2.5mMのCa ^{2 +}タイロード液で満たす。 Ca ^{2 +の}ミトコンドリアは、これらの製剤中に完全に機能しているので、及びグルコースは、膜の完全性、SRの最適なCa ^{2 +の}読み込みや、筋肉自体によるATPの生成のためのエネルギーの容易に利用可能なソースを維持するために入浴液中に提供されています。
6. 、酸素供給の適切な接続を確認して酸素ボンベを開き、チャンバーの拡散と均質バブリングを提供するために、酸素の流量を調整します。酸素レベルは容易に収縮力対時間の関数として測定することができる。流量計は、研究者は、低酸素症または高濃度酸素の効果を研究することに興味を持っている場合は特に、インストールすることができます。筋肉が低酸素状態になる場合には、力が自然に減少します。高濃度酸素はまた筋肉を損傷する可能性がありますが、ほとんどの実験は、筋肉への正常な血液供給の欠如を補うために人工的な高酸素条件下で行われているため、その影響が検出されるように難しいかもしれませんが。ほとんどのシステムでは、単に各チャンバ定数への酸素の流れを制御することにより、酸素同量の泡に異なるチャンバーが可能です。
7. 飽和させずにチャネルを最大の力の解像度を確保するために、すべてのチャネルの感度を調整します。チャネル感度は関数としてかなり異なりますD動物の年齢、実験温度、遺伝子操作、筋肉のサイズ、マウス系統、きちんと損害賠償の自由筋肉を解剖する実験者の能力。 EDLの場合、感度が1から20 MV / cmでから変わる可能性がありながら、我々の経験では、ヒラメ筋収縮力を測定する場合、感度は、0.5から10 MV / cmで異なります。
8. 疲労を刺激するためのプロトコルが確立される必要があります。 Chart4ソフトウェアでマクロを使用することができます。新しいマクロをプログラムするには：Chart4ソフトウェアで、測定を開始する]をクリックし、[終了リピート[マクロ]をクリックし、マクロコマンド、録音を開始し、繰り返し開始、所望の刺激周波数を選択します。平衡プロトコルの場合は、刺激を30分間毎分繰り返され、プロトコルを疲労のために、刺激を5分間毎に2秒後に繰り返されます。刺激の周期におけるこれらの変化は、直接的にも刺激持続時間の関数であるデューティ·サイクルに影響します。これらのパラメータは、異なるASPEをテストするために変化させることができる収縮性および易疲労感のCTS。

2。無傷筋束の準備

1. EDLの解剖：マウスがNIHガイドライン及び動物実験委員会制度の動物プロトコールに従って犠牲にされる。マウスを頸椎脱臼により屠殺されています。マウスは、その後、横位置に​​配置されている。 EDLの筋肉は淡いピンクに白い色で高速解糖系筋肉です。それは10月13日程度の長さであり、野生型C57BL / 6マウスに8から11ミリグラムの重量を量る。 EDLはつま先2-5、および足首の背屈曲足を延長する機能を有している。それは、腓骨神経によって支配されています。 、EDLを解剖する表面的な皮膚切開を行い、前脛骨筋と後方筋群間の筋膜を切開し、原点をローカライズ（近位）靭帯は脛骨の外側顆に接続されていると前方の3月4日には、優れた腓骨の表面（骨間縁）。このprocedur;筋から遠位にできるだけ繊細な眼科用ハサミで靭帯を切断eはEDL筋肉の近起源を解放します。鈍鉗子で靱帯を押さえ、EDLを解放するためにゆっくりと引き抜きます。それは、EDLの周りのEDLと他の筋肉を取り巻く筋周膜の一部損傷がこの繊細な工程の間に、EDL筋肉に発生する可能性があるため、重要であるステップを切断する必要があるかもしれません。次に、4つの遠位腱がケタ2-5の中間および遠位指骨に挿入する挿入領域に移動します。筋肉から可能な限りの腱を切った。
2. アイソトニックタイロード溶液を含む解剖皿に孤立EDL筋肉を転送します。いくつかの、変異トランスジェニック、ノックアウト動物モデルは非常に壊れやすい筋肉を持っているとCa ^{2 +}の利用無料タイロード溶液は、収縮性の測定前のCa ^{2 +}誘発性筋損傷を防止することが必要である。次に、できるだけ筋肉から遠位にEDL筋肉の両端にしっかりと結ぶために外科結びを使用しています。良い測定は若干半ばP以上結び付けることです縦靭帯または腱のOINT。この手順には、6から0サイズの縫合糸を使用し、O ₂飽和組織浴室にEDL筋肉を転送、力変換器、入浴室の底部にある文房具·フックのサンプル溝に筋肉をマウントし、繰り返し他の脚のためのプロセス。また、クランプの代わりに縫合糸で筋肉を保持する新しい方法を活用し始めている。主要な目標は、速度論的性質を研究および/または筋肉のパワーを得るためにすることである場合は、縫合糸はできるだけ短くすることをお勧めしますまたは縫合糸は金属棒で置き換えられる。
3. ヒラメ筋解剖：ヒラメ筋が豊かな赤の色で大抵遅い酸化筋肉です。それはEDLより約1mm短くなりますが、EDLよりも若干の重量を量る。これは、脛骨神経によって支配、それは足底の屈曲、足のアクションを実行しています。ヒラメ筋を解剖するために、脚の後部側面にアクセスすると、正常にsoleuをカバー腓腹筋を掻き分けs、および暗赤色で筋肉を識別します。原点に（近位）、ヒラメ筋線と後方腓骨の1/3近に沿って後方脛骨の近位半分に接続している靭帯を切る;、挿入（遠位）で、次のアキレス腱を切って、その後部に挿入踵骨。ヒラメ筋まで丁寧に無料で適切なEDL用として入浴室でヒラメ筋をマウントします。

3。隔離された骨格筋の収縮を測定

1. 筋肉は、個々の組織浴室に搭載されたら、録音を開始します。ほとんど似たようなシステムは、力記録のベースラインのゼロ許す。この関数は、通常のブリッジ·アンプの機能として、PowerLabのシステムの特定のケースでは、増幅器に関連付けられています。これは、ベースラインの変化の観察を容易にし、ゼロから分析されるすべての筋肉の収縮のための便利な方法を提供します。隔離された筋肉は、その後、乗波パルスで刺激されるそれは、チャンバーサイズの関数、白金線の太さ、線の間の距離、さらに実験的な溶液の組成として広く及ぶことができます。我々は、特定のプロトコルの目標に応じて、60ミリアンペア（我々は、350 mA以上の電流が筋肉の準備に有害と思われることを指摘している）と刺激列車350、500、1000 msの現在採用している。個々の矩形波パルスが0.3から1ミリ秒に至るまでの期間を持っている必要があります。
2. 次のステップは、溶融テタヌス刺激を作り出すことができる刺激の周波数を選択することであること（例：ヒラメ筋でEDL筋肉や〜60 Hzで最大の力の生産を可能にするために〜100Hz）をゆっくりと慎重に筋肉をストレッチ識別しながら、これらの筋肉の最適な長さ。筋肉は慎重に引き伸ばされたように、30秒間待ってから、100 Hzで刺激し、30秒待ってから、もう一度ストレッチしてから、力はもう増加しない点まで、刺激を繰り返す。
3. これらの筋肉はundergonを持っている環境におけるe大幅な変更。それは筋肉が新しい環境に適応するために許容されていることが推奨され、我々のプロトコルでのステップは、 "平衡"と呼ぶ。少なくとも5つの連続テタヌス収縮は（安定したベースラインを減らすことではなく、増加していない）完全に安定するまで引き伸ばし相、20〜30分間は100Hz、中に使用される刺激の同じ周波数でこれらの筋肉を平衡化します。刺激列車（100 Hzで、500ミリ秒持続時間、1 msの個々のパルス）平衡時の周期は1.66％のデューティサイクルに等しい1分、非辛い刺激である。この文脈では、1.66％のデューティ·サイクルが100％の合計で、筋肉は、デューティ·サイクルの筋肉が最終的に疲労するように誘導することができる増加することによって、時間の1.66パーセント働いていることを意味します。健康、野生型マウスのそれ以外の筋肉はこの平衡期間中に疲労のプロファイルを示している場合、それは彼らが解剖中に損傷された可能性があり、低酸素室/筋肉、または過度のエレメントで発生している刺激電極を通じてctrolysisは、フリーラジカルを発生させています。 Westerbladは以前に400ミリアンペア以上の電流がフリーラジカル²³の形成を誘導することを示唆している。他の金属は確かにフリーラジカルの形成と筋毒性につながるので、明らかに、最高品質の白金は、提案されている。
4. 25℃での実験を行うときに30から60秒の周期で、1から140 Hzの（5-10 Hzの単位）：以下刺激周波数で筋肉を刺激することにより、力対周波数の関係（FF）を取得する37℃で実験を行う際には、横隔膜筋、ヒラメ筋のために180から200 Hzで、EDLのための220から250ヘルツ、300ヘルツまでの高い周波数にFFを拡張します。次に、最大強縮力（T _max）と約半最大テタヌス力（1月2日の_T max）を生成する刺激の周波数を識別し、時にはそれはEDLとソールの両方で正確な半_T max _を得ることが困難であるなぜなら、これらの筋肉の間に本質的な違いの一方のみ刺激源が使用されているかどうか私達は筋肉、。実行可能な解決策は_、T maxの30から70パーセントを生産し、周波数を特定することです。 _½T max _は Ca ^{2 +の}規制およびECCプロセスへのより適切な情報を提供しながら、刺激のこれらの周波数の理論的根拠は_、T max _は収縮機械イベント/変調の重要な情報を提供することである。筋肉を刺激しながら最大の力が達成されたことを確実にするには、10〜20 mMのカフェインは、入浴の溶液に添加することができる。最大の力に達している場合、力はカフェインの存在下で増加することはありません。 FFは右にシフトし、軍はより高い温度で実験若干高くなる傾向がされています。このシステムを使用して、他の刺激周波数が望ましい場合に行うことができます。高速解糖EDL筋肉と遅い酸化ヒラメ筋での明確な収縮プロフィール図2に示す。
5. 2秒の刺激間隔と25％のデューティ·サイクル（ 図3）、5分間½、T _maxで筋肉疲労、平衡化した後。この特定の疲労プロトコルはより良い筋肉の収縮³¹の筋小胞体Ca ^{2 +}放出の寄与を反映すると考えられている。
6. 1分間隔で30分間_½T maxは、または力が安定するまで、筋肉を回復します。追加の疲労プロトコルが収縮機械³¹の状態を反映すると考えられている_T maxは刺激_を 、使用してすぐに実行することができます。別のオプションは、疲労時に_T maxおよび_½T max _を生成し、刺激は同じタイプの筋肉を回復するために刺激列車をインターカレートする疲労プロトコルを拡張することです。
7. 手順3.4で説明したようにFFを繰り返し、論理的根拠は、diffの間の表現型の違いであるerent株、疾患モデル、または薬物治療は疲労の前後FFを分析することによって観察することができます。我々は、例えば以前に高齢者の筋肉から筋肉に、それは加齢の関数として骨格筋疲労の差調節作用が示唆され、右にシフトしている間に疲労した後に、若い野生型の筋肉のFFは、左にシフトしていることを報告している。
8. 筋収縮における細胞外Ca ^{2 +流入}の寄与を調べるために、入浴液は全くのCa ^{2 +}が0.1mMのEGTA（0 mMのCa ^{2 +の}タイロード溶液^）32を含まない溶液に変更することができます。あるいは、ストア作動性チャネルの異なるブロッカーは入浴液に適用することができます。いくつかの例は、2 -アミノエチルdiphenylborinate（2-APB）、SKF96365、3,5 -ビス（トリフルオロメチル）ピラゾール2（BTP-2）およびazumoleneなど^33、34。カフェインは、リアノジン受容体の機能を調べるために使用することができ、KClは全体を評価するために使用することができますこれらの製剤の脱分極特性。他の薬剤はまたのNa ^{+、K +}およびNa ^{+-K +}ポンプ³⁵による疲労時の力の重要な変調を調査するために使用することができます。これらの薬のほとんどは、比較的小さいサイズを持っており、迅速に即効で明らかなように、これらの筋肉の準備中に拡散しているようだ。任意の薬物による効果の欠如は、必ずしも薬物は無効であり、単一筋線維の実験で使用されているものよりもはるかに高い用量を使用して、追加のテストが時々必要であることを意味するものではありません。
9. ^{- / -}筋肉^4,30このex vivoでのシステムの一つのユニークなアプリケーションがTRIC-Aのメカニック交互の最近の発見につながった。交互脈は疲労プロファイルの衰退期の間に収縮力の変動バーストエピソードとして定義されています。これらのイベントの間に収縮力が一瞬の間に力のその前のレベルを超えて増加するそのどちらかの多くのCa ^{2 +が}リリースされているまたは収縮機械がCa ^{2 +}に敏感になっているので、刺激を疲労。収縮力の発生は、その前の力よりも50％高いことがあり、流行は5分疲労刺激·プロセス中に、少なくとも10回、見られるべきである。メカニック交互脈は、野生型マウス由来の骨格筋では一般的ではないが、このような三量体細胞内陽イオンチャネル型（TRIC-）などの細胞内Ca ^{2 +}シグナル伝達プロセスの摂動を持ついくつかの変異体の筋肉で見ることができます^{- / -}筋肉^4。メカニック交代がカフェインとシクロピアゾン酸（CPA）を用いた治療、疲労の刺激を介して誘導することができ、これらの機械的交互脈の代表的な録音のために図3を参照してください。疲れている筋肉が瞬間的に多くの力を生成することができると思われる一方で、この現象の本質は、かなり興味をそそられる。私たちの前の発行で、単一細胞のCa ^{2 +}の分析との組み合わせが交互のその外観は、SRのCa ^{2 +}過負荷と不安定なSRの結果で明らかになった。私たちは、交互のより深い理解がECCプロセスのより良い理解につながるかもしれないと信じています。
10. 実験終了時に、校正されたキャリパーと天秤を使用して、個々の筋肉の長さと重さを測定し、フラッシュは液体窒素で凍結させ、筋肉を-80℃で保存し、生化学的な分析は、これらの筋肉に行うことができるので。これらの筋肉はまた、ECC処理の詳細なプロービングのために機械的に肌のことができます、またはECC調節機構の不在に不可欠な収縮特性を決定するために、化学的に肌のこと。
11. 筋肉の力（N / cm ^2）を=（力（グラム）×筋肉：録画筋力（MV）が第一グラム校正結果に基づいており、以下の式を用いて生理学的断面積（PCSA）に、正規化を強制的に変換されますlengtH（センチ）×1.06）/（筋肉の重さ^{（g）×0.00981）5,36。}あるいは、筋肉の力を総タンパク質またはブラッドフォードタンパク質アッセイ/ Commossieブルー染色の定量化を使用して、個々の筋肉の総アクチン含量に対して正規化することができます。筋肉量を大幅に疾患、老化、薬物治療に起因する影響を受ける可能性があるのに対し、一定の条件の下で、筋肉量、タンパク質および/またはアクチンの内容に基づいて、力の正規化は、より安定した読み出しを提供することができます。

4。代表的な結果

低、中、高周波数刺激に応答EDL及びヒラメの典型的な常温収縮力を図2に示します。 5 Hzの刺激によって誘発されるEDLの収縮がSERCAのCa ^{2 + ATP}アーゼと真性のCa ^{2 +}収縮機械の感度特性、5Hzのでヒラメ筋収縮が（遅いATPaseを融合させるために起動しているときの迅速な行動のために個々のけいれんとして残るD高い収縮機械のCa ^{2 +}に対する感度）が、ピークの力はまだ分離されています。ヒラメのそれは完全に融合した強縮力を形成しながら20Hzの刺激で、EDLの収縮は、部分的に融合させる。 EDL及びヒラメのための60から90 Hzで、EDLにテタヌス力の高速アップストロークと高速緩和のために80から110 Hzから室温で変化させることができるT _最大の刺激を生成する刺激の周波数では逆になっている、記載されていますヒラメ筋の遅い特性図2Bは、ヒラメ筋は、任意の与えられた周波数でのCa ^{2 +}放出に敏感であることを示す、ヒラメ筋と比較して、EDLの筋肉の力-周波数曲線が右にシフトしていることを示している遅いミオシンおよびトロポニンアイソフォームの存在に起因する刺激。また、収縮機械は低い周波数でヒラメ筋の相対的なより多くの力を使用して応答します。 図3のショーをEDLのSA通常の疲労プロファイル（上段）とヒラメ筋（中央のパネル）。 EDL筋における疲労刺激下の収縮力で速く減少し、5分間の疲労プロトコルの最後で力の高い減少に注意してください。最後に、変異体の筋肉の代表的な機械alternanプロファイルは筋肉疲労プロファイルの衰退フェーズ中に瞬間的な力の流行のように定義された、（下のパネル）は、 図3に示した。収縮力の発生は、その前の力よりも50％高いことがあり、流行は5分疲労刺激·プロセス中に、少なくとも10回、見られるべきである。

図1。 4チャンネルex vivoでの収縮系の模式図。方形波パルスは草の刺激を制御するコンピュータによって生成されます。 2つの刺激分離ユニットは、電気から発する刺激をフィルタリングtrical刺激ユニットは、電気信号​​の任意の変動を除去し、安定した方形波信号を確立する。このフィルタリングされた電気信号は、それぞれ孤立した筋肉を取り巻く白金線電極を含む4入浴室に送信されます。最終的には、筋肉の収縮を誘発する、活動電位を発生させる2つの電極（電場刺激と呼ばれる）を横切る電流です。この収縮はブリッジアンプに伝わる固有の力変換器により検出され、濾過し、平均（シグナル·コンディショニング）とA / Dコンバータを介してコンピュータソフトウェアによって記録された。

図2。 EDL及びヒラメの代表的な収縮力 （）5 Hzの（上段）、20ヘルツ（中央のパネル）と最大強縮力（T _max）の（下のパネル）によって誘発される収縮力;入口はの収縮力の痕跡を示しています損傷した筋肉と、（B）代表者は、EDLの力対周波数の関係（FF、上部パネル）の個々の収縮を示す設定とFF（下のパネル）から得られた曲線をプロットしました。 拡大図を表示するにはここをクリック 。

図3。プロファイルと機械的交互脈を疲労代表。EDL筋（上部パネル）とヒラメ筋の緩やかな減少疲労プロファイル（中央のパネル）のプロファイルを疲れさせる典型的なファースト下落。 ^{- / -}乱れのCa ^{2 +}ハンドリング特性（下のパネル）と筋肉刺激が疲労すると、TRICインメカニカル交互脈の出現につながる。

Discussion

収縮力と疲労の測定は、骨格筋の機能を総合的に評価するために重要である。このアッセイの主要な目的は、サルコペニアや筋肉疲労などの特定の病理学的な条件の下での筋肉の力の変化と疲労特性を明らかにし、筋収縮に薬/試薬の効果をテストすることです。筋力が密接に細胞内Ca ^{2 +の}放出と関連しているので、細胞外Ca ^{2 +流入}とこれらの2つの間のクロストークは、我々はまた、のCa ²に関する情報を収集することができます⁺骨格筋内のステータスは、このメソッドを使用することで合図。ここでは、疲労プロファイルの衰退期の間に収縮力の変動バーストエピソードが過負荷になり、不安定なSRの下で見ていた "メカニック交互脈"と呼ばれるユニークな表現型を示した。一つは、変更された力、FF、易疲労感、収縮動態および回復AB含む骨格筋の表現型の様々なことが期待できる疲労後ilityは異なる病的条件下でインビトロ収縮性アッセイで使用して検出することができる。

このアッセイのための最も重要なステップは、損傷の自由です全体無傷筋（または筋束と筋ストリップ）を分離することです。このような目標は、全体の筋肉の準備で達成することが容易になります。ここでは、全体の筋肉を結ぶために十分な靭帯と腱を残すことは、筋肉の損傷、最終的に筋肉の死につながる、筋肉自体を結ぶ防ぐために非常に重要であることを示している。さらに、重炭酸塩ベースのソリューションのHEPESベースのソリューションまたはO ₂とCO ₂の混合物の場合には100％O _2のいずれかを使用してソリューションの定数泡立ちは非常に重要です。流量計を使用することができますが、低酸素症および高濃度酸素を防止することが重要です。我々はまた、特定の状況において、組織を浸す液体中の溶存酸素を測定し、特定のデバイスを使用していました。筋肉はMORである特定の条件の下で損傷を受けやすい電子は、力変換器実装前にCa ^{2 +を}含まない溶液中で孤立した筋肉を扱うのは筋肉をリラックスさせ、実験の前に、筋肉の損傷を最小限に抑えるのに役立ちます。例えば、2,3などの薬物 - ブタンジオンモノオキシム（BDM）またはN-ベンジル-p-トルエンスルホンアミド（BTS）も収縮性の研究のために共通である、筋束や筋肉ストリップが用意されている場合は特に、被害を最小限に抑えるために解剖中に加えることができるダイアフラム^37,38の。録音中は、破損した製剤は、通常より少ない力を生成します（ 図2の入口を参照）ベースラインノイズや変動を増加している、それが破損したの応答を解析するための実験の一部でない限り、これらの筋肉からの結果は、分析データセットから除外することができる筋肉。簡単に無視したり忘れたりすることができるもう一つのポイントは、電気刺激自体は筋肉のための毒性の原因になることができるということです。当社は、定期的に電極とCHAMBの清掃をお勧めします任意の汚れを除去するため、1％次亜塩素酸塩溶液、タンパク質の破片とえー、酸化蓄積等の特別は、マウントされた筋肉の長さを調整するときにも注意が必要です。細いと太いフィラメントの最適なアライメントは効率的なクロスブリッジ機能³⁹のために重要であるとして、オーバーストレッチを避けるために小刻みにストレッチしておくことが重要です。さらに、電場刺激電極に取り付けられた筋束の相対位置を一定に保って電流のものと等しい量を確保するために、すべてのチャンネル間で整列孤立筋肉に適用されることをお勧めします。抗生物質は、0.2％のFBS、アミノ酸場合、我々の実験条件下では、若い野生型マウス由来の筋肉はさらに長く12時間以上安定していると入浴液に添加されています。

ケアと適切な制御により、このex vivoのシステムは、Ca ²の間の相関関係についての情報を提供することができる⁺シグナル血管系、内分泌系、および神経系の複雑さのないDの筋肉の収縮。 SRのCa ^{2 +}放出の機能不全は通常より低い収縮力と高速の疲労プロファイルをもたらしながら、例えば、細胞外Caの依存損失^{2 +}高齢者の骨格筋の署名である。 SRのCa ^{2 +}過負荷や不安定性を発生させる病的状態下の筋肉ではなく、また、他の骨格筋に^{- / - 、}ここexampled、機械的交互脈の出現は、我々はTRIC-に限定されるものではないと信じて不安定なSRを、示しています。このセットアップでは、様々な生理学的および薬理学的操作のための筋肉の直接アクセスが可能です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5