Ex Vivo оценке сократимости, утомляемость и аНегпапз в изолированных скелетных мышц

Summary

Мы описываем метод непосредственного измерения мышечной силы, мышечной силы, сократительная кинетики и утомляемость изолированных скелетных мышц в

Abstract

Описанный здесь метод измерения сократимость изолированной скелетной мускулатуры. Такие параметры, как сила мышц, мышечная сила, сократительная кинетики, утомляемость, и восстановления после усталости может быть получена для оценки конкретных аспектов возбуждения сокращения связи (ECC) процессов, таких как возбудимость, сократительная техники и Ca ^{2 +} обработка способности. Этот метод удаляет нерв и кровоснабжение и делает акцент на изолированном скелетные мышцы. Мы регулярно использовать этот метод для выявления генетических компонентов, которые изменяют сократительные свойства скелетных мышц, хотя модуляции Ca ^{2 +} сигнальных путей. Здесь мы описываем вновь выявленных скелетных мышц фенотип, то есть, механик аНегпапз, как пример разнообразной и богатой информации, которая может быть получена с использованием в пробирке анализа сократимости мышц. Сочетание этого анализа с одной анализы клетки, генетический подходы и биохимическихСтрый анализов может предоставить важную информацию о механизмах ECC в скелетных мышцах.

Introduction

Скелетные мышцы прикрепляются к костям скелета и генерировать сократительной силы под контролем центральной нервной системы. Возбуждение-сжатия связи (ECC) относится к процессу преобразования электрических стимулов для механического ответа. Ca ^{2 +} сигнализация является важным компонентом сократительной функции скелетных мышц. Эффективное Ca ^{2 +} мобилизации из саркоплазматического ретикулума (СР) является важным компонентом для ECC в мышечных клетках ^{1, 2,} и изменения внутриклеточного Ca ^{2 +} сигнализация лежат в основе соответствующего сократительной дисфункции в ряде мышечных заболеваний ^3-5. Правильная оценка сократительной способности мышц является важным и бесплатный Ca ^{2 +} визуализации и другие анализы, чтобы получить представление функции скелетных мышц, а не только на сократительную уровне, но и на кинетическом уровне. Сила и скорость могут быть также получены сообщить важное свойствомышечной силы и состояние процесса ECC при различных физиологических и патофизиологических условиях.

Это плодородный области исследований имеет очень богатую историю и множество теорий мышечного сокращения появилось более двух тысячелетий ^6. Современные исследования мышц, вероятно, начинается в 1674-1682 с микроскопическим наблюдением крест-страт и миофибрилл в мышечных волокнах Левенгук ^6. Почти столетие спустя, Луиджи Гальвани заметил, что контракты мышцы лягушки активно, когда его нерв коснулся скальпелем во время искрового разряда из далекого электрических машин ^7-9. Сокращение может также быть произведено путем подключения ногу нерва к мышце через металлический проводник. Подробная информация о комплексе электрический механизм сигнализации выступают Гальвани в конечном итоге были сформулированы Ходжкина, Хаксли и Кац в своем знаменитом уравнении ^{10, 11,} который стал основой электрофизиологии. Замечательные наблюдения Rinгер о воздействии внеклеточного Ca ^{2 +} на сократимость сердца лягушки и скелетных мышцах ^12-15 представляют собой первый важный шаг в признании Ca ^{2 +} в качестве ключевого регулятора мышечной сократимости ^{16, 17.} С 1980-х годов до наших дней всплеск открытий в области сократимость мышц был реализован в связи с введением сократимости мышц и утомляемость протоколов в мышиных скелетных мышц ^18. Джонс и Эдвардс были первыми, чтобы предположить, что низкая частота прерывистого усталости (упражнение вызванных сокращением в силу) ¹⁹ были связаны с изменениями в механизме ECC, а не сократительного аппарата. В конце 1980-х и начале 1990-х годов, Kolkeck и др. ^20, Kolbeck и Nosek ^21, и Рид ²² были использованием мышцы диафрагмы от грызунов моделей для изучения влияния теофиллины, cortiosterone, и свободных радикалов на скелетные сократимости мышц, в то время как Брукс и Faulknэ были первыми сообщить о повторяющихся измерений силы и мощности в быстрых и медленных мышц у мышей ^22. Кроме того, Lannegren, Westerblad, Lamb, и Westerblad были первыми, чтобы напрямую связать бывшие сократимость естественных условиях с внутриклеточного Са ^{2 +} регулировании и начали подвергать сомнению роль ацидоз в мышечной усталости ^{23, 24.}

Наши лаборатории внесли значительный вклад с начала 2000-х годов к пониманию новых генов с модулирующим и нормативной роли на мышцы ECC с важнейшую роль в мышечной сократимости, утомляемость и старение, используя сочетание нетронутой исследований мышцы мыши сократимость, внутриклеточный Ca ^{2 +} мониторинг неповрежденной и кожей мышечных волокон и молекулярно-генетических манипуляций ^{3-5, 25-29.}

Здесь мы подробно экспериментальный протокол для измерения сократимость изолированного мышиного камбаловидной и разгибателей пальцев мышцы (EDL) мышц, которые соответствуют главным образом медленным окислительного (тип I и IIa волокон мышц) и по большей части быстро glyocolytic мышцы (тип IIb и волокон IIx мышцы) с различными сократительных свойств. В этом протоколе целой мышцы, сухожилия комплексы были выделены и купались в ADI PowerLab Radnotti камерная система поставляется либо с чистым кислородом или смесью кислорода (95%) и CO ₂ (5%). Сократительных сил, создаваемых электрическими раздражениями из травы стимулятора и обнаружить, используя датчик силы, которая была интегрирована с системой ADI PowerLab/400, позволяя настраивать макро-процедур контроля приобретения, сбора, оцифровки и хранения данных. Эта установка может измерять силу мышц, мышечной силы, а также силы от частоты отношения, мышечной усталости, восстановления мышечной усталости, скорость и общую кинетические свойства мышц. Кроме того, воздействие наркотиков на сокращение мышц можно контролировать с помощью этих экспериментов. Преимущества этого метода заключается в удалении нейронов и сосудистого компонентов от скелетных мышц, что позволяет прямой оценки внутренних свойств сокращающейся мышцы. Кроме того, экс анализы сократимость естественных условиях позволяют манипуляции с внеклеточной средой окружающих изолированной мышцы, что позволяет использовать фармакологические манипуляции различных ионных каналов проникновения и перевозчиков с целью определения их физиологической роли функции скелетных мышц.

Это бывшая система естественных условиях позволил нам недавно обнаружили различные поведения alternan в некоторых мутантов подготовки мышц, которые были связаны с измененными внутриклеточного Ca ^{2 +} обработка свойства ^4. АНегпапз определяется как колебания эпизодов взрыв сократительной силы во время снижения фазы утомительно анкету. Во время этих событий сократительной силы мгновенно увеличить выше прежнего уровня силы Dтором утомительно стимуляции, возможно потому, что либо более Ca ^{2 +} в настоящее время освобождены или сократительной техника стала более чувствительной к Ca ^{2 + 30.} Лечение циклопьязониковой кислоты (CPA), обратимые блокатор саркоплазматического-эндоплазматической сети кальция АТФазы (SERCA), кофеин, агонист рианодиновых каналов (RyR) и утомительно повторяющихся раздражений могут вызвать механическое аНегпапз ^4, предполагая, что аНегпапз которые непосредственно связаны с модуляции процесса связью ЕС. Демонстрация метод, чтобы побудить и записывать механиком в аНегпапз в настройках сократимость пробирке служит в качестве примера, чтобы показать самые разнообразные экспериментальные параметры, которые могут быть получены с этой системой или подобные, основанные на индивидуальных интересов исследования.

Этот метод может представлять интерес для исследователей, изучающих физиологию мышц. Похожие настройки также могут быть использованы для изолированных скелетных комплексов muscle-tendon/ligament от другиханатомических местах, а также для одиночных волокон и мышечных полосок.

Protocol

Решение составе:

2,5 мМ Ca ^{2 +} Tyrode решение: 140 мм NaCl, 5 мМ KCl, 10 HEPES мм, 2,5 мм CaCl _2, 2 мМ MgCl ₂ и 10 мМ глюкозы

0 мМ Ca ^{2 +} Tyrode решение: 140 мм NaCl, 5 мМ KCl, 10 HEPES мм, 2 мм MgCl _2, 0,1 мМ этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA) и 10 мМ глюкозы

Примечание: купание раствор должен быть насыщен на 100% O ₂ при использовании выше решение, но с 95% O ₂ с 5% CO ₂ при использовании бикарбоната на основе буфера рН держать постоянно. 2,5 мМ Ca ^{2 +} добавляется в буфер для купания повторять уровня Ca ^{2 +} находятся в межклеточном пространстве и 10 мМ глюкозы важно, так как митохондрии по-прежнему функционируют в эти мышцы постоянно производить АТФ в присутствии глюкозы.

1. Создание Ex эксперимент Сократимость Vivo помощьюСистема ADI PowerLab

1. Схематическое изображение 4-канальные системы бывшего сократимость естественных условиях показано на рисунке 1. Компьютер управляет стимулятором для генерации прямоугольных импульсов, которые фильтруются по изолятор для достижения парой из платиновой проволоки, окружающих каждый изолированный мышц и сухожилий комплекса. Это также называется поле стимуляции. Сокращение мышцы в ответ на стимуляцию ощущалось силой датчик, сигнал, из которого был усиливаются, фильтруются и передаются обратно на компьютер A / D конвертер (сигнала). Затем сигнал в цифровую форму и могут быть сохранены для последующего анализа.
2. Для подготовки к бывшим эксперимент сократительной естественных условиях, в первую очередь на поле стимулятор, A / D конвертер (в данном случае ADI питания Lab) или аналогичное программное обеспечение (например, LabView), а затем с помощью компьютера.
3. Откройте Chart4 программного обеспечения (или другой версии программного обеспечения, совместимого с системой) и инициировалишт 4-канальный задачи; надлежащей связи программного обеспечения и аппаратных указывается стартовой конфигурации аппаратных средств, и кнопку Пуск на программное обеспечение становится все оперативные (живой); 4-канальная функция позволяет одновременное измерение пара мышц дикого типа и мутантных мышей, или 2 EDL и 2 камбаловидной мышцы из той же мыши, и она может быть использована для других мышц, таких как мембрана (диафрагма целом, геми-диафрагма, или полоски мышцы диафрагмы) и передней большеберцовой; он также может быть использован для подготовки сердечной мышцы и для пучков мышц, особенно если используется крысы мышц. В этом случае размер мышц может ограничить диффузию кислорода так мышечные пучки, таким образом, лучший выбор. Тем не менее, эксперт методов диссекции, необходимых для подготовки мышц расслоение.
4. Калибровка датчик силы: это обеспечение сопоставимости набора данных генерируются на разных каналах и в разное время. Первой начала записи, SequentiaLLY повесить 1-г, 2-г и 5-г веса на образце роща датчик силы, остановить запись, рассчитать соответствующие изменения в мВ показано на каждый канал Chart4 программного обеспечения, построить ΔmV и веса, чтобы проверить линейность и определить коэффициент преобразования между мВ и грамма силы. Мы рекомендуем выполнения этих калибровок либо в начале, либо в конце каждого эксперимента, чтобы гарантировать, что конкретные калибровки, полученные для каждого конкретного эксперимента.
5. Проверьте правильность подключения тефлоновой трубки, слейте жидкости, находящейся в трубке ванна ткани, промыть камеры в три раза или больше с DDH ₂ O и залейте 20 ~ 25 мл 2,5 мМ Ca ^{2 +} Tyrode решение. Ca ^{2 +} и глюкоза содержится в растворе ванны, чтобы помочь сохранить целостность мембраны, оптимальный Ca ^{2 +} загрузка SR и доступный источник энергии для генерации АТФ самой мышце, так как митохондрии остается полностью функциональным в этих препаратах.
6. Проверьте правильность подключения кислорода, откройте баллон с кислородом, и регулировать поток кислорода, чтобы обеспечить диффузионное и однородной журчание камеры. Уровень кислорода может быть легко определена в зависимости от сократительной силы от времени. Расходомер может быть установлен, особенно, если исследователи заинтересованы в изучении воздействия гипоксии и гипероксии. Если мышцы становятся гипоксически, сила, естественно, уменьшается. В то время гипероксии может также повредить мышцы, но его последствия могут быть тяжелее, чтобы быть обнаружены, поскольку большинство экспериментов проводится при искусственном гипероксической условия, чтобы компенсировать отсутствие нормального кровоснабжения мышцы. В большинстве систем можно пузыря различных камер с таким же количеством кислорода, просто путем регулирования притока кислорода к каждой камере постоянно.
7. Настройка чувствительности всех каналов для обеспечения максимального разрешения силу без насыщения канала. Канал чувствительность может значительно изменяться как функцияг возраста животного, экспериментальная температура, генетические манипуляции, размер мышц, мыши штамма, и способность экспериментатора правильно препарировать мышцы бесплатно убытков. По нашему опыту, при измерении камбаловидной сократительную способность, чувствительность колеблется от 0,5 до 10 мВ / см, в то время как в случае EDL, чувствительность может варьироваться от 1-20 мВ / см.
8. Протокол утомительно стимуляции должна быть установлена. В Chart4 программного обеспечения макрос может быть использован. Для программирования новых макросов: в Chart4 программного обеспечения, нажмите кнопку начала измерения, затем нажмите Макро, Макро команды, начать запись, начинают повторяться, выбрать желаемую частоту стимула, а затем повторите конца. Для уравновешивания протокол, стимул повторяется каждую минуту в течение 30 мин и утомительно протокол, стимул повторяется каждые 2 секунды в течение 5 мин. Эти изменения в периодичность стимуляции, непосредственно влияют на рабочий цикл, который также является функцией стимуляции продолжительности. Эти параметры могут быть изменены, чтобы проверить различные AspeТТ сократимость и утомляемость.

2. Подготовка неповрежденном мышечных пучков

1. EDL рассечения: мышь приносится в жертву после NIH принципы и IACUC институциональных протоколов животных. Мышь приносится в жертву путем смещения шейных позвонков. Мышь затем расположены на боковой позиции. EDL мышцы быстро гликолитических мышцы с бледно-розовый-белый цвет. Речь идет о 10-13 мм в длину и весит 8-11 мг в дикого типа C57BL / 6 мышей. EDL имеет функции расширения пальцев 2-5, и спинно-сгибание стопы в голеностопном. Это иннервируется малоберцового нерва. Чтобы вскрыть EDL, сделать поверхностный разрез кожи и разрезать фасцию между передней большеберцовой мышцы и заднюю группу мышц, и локализовать происхождение (проксимальный), где связки соединен с боковой мыщелок большеберцовой кости и превосходные 3/4 от переднего поверхности малоберцовой кости (межкостной маржи). Вырезать связки с тонким ножницы офтальмологической как дистально как можно дальше от мышц; это procedurэлектронной освобождает проксимального происхождения EDL мышцы. Держите связки с тупым пинцетом и осторожно потяните, чтобы освободить EDL. Это может быть необходимо сократить некоторые из perimysium окружающих EDL и другие мышцы вокруг EDL, шаг, который является критическим, поскольку повреждение может произойти в мышце EDL во время этой деликатной шаг. Далее, переходим к вставке области, где четыре дистального сухожилия вставить в средних и дистальных фаланг 2-5 цифр. Вырезать сухожилий как можно дальше от мышц.
2. Передача изолированные EDL мышцы в рассечение блюдо, содержащее изотонический раствор Tyrode. Некоторые мутанты, трансгенных и нокаут животных моделях есть очень хрупкие мышцы и использование Ca ^{2 +-бесплатная} Tyrode решения, необходимые для предотвращения Ca ^{2 +-индуцированной} повреждения мышц перед сократимость измерений. Затем с помощью хирургического узел, чтобы туго завяжите на обоих концах EDL мышцы, дистально от мышц насколько это возможно. Хорошая мера, чтобы связать чуть выше середины-рoint продольной связки или сухожилия. Используйте 6-0 размер шва для этой процедуры, и передать EDL мышцы O _{2-насыщенных} камеры ванны ткани, мышцы установить на образец паз датчика силы и канцелярские крючок на дне ванны камеры, повторите процесс для другой ноги. Мы также начинаем использовать новый метод, который держит мышцы с зажимами вместо швов. Если основной целью является изучение кинетических свойств и / или для получения мышечной силы, рекомендуется, чтобы шов быть как можно короче, или шовный быть заменен на металлический стержень.
3. Soleus рассечения: камбаловидной, по большей части медленно окислительного мышцы насыщенный красный цвет. Это ~ 1 мм короче, чем EDL, но весит чуть больше, чем EDL. Это иннервируется большеберцового нерва и он выполняет действия подошвенного сгибания стопы. Чтобы вскрыть камбаловидной, к задней боковой стороне ноги, отодвинуть в сторону икроножной мышцы, которая обычно охватывает soleuы, а также определить мышцы с темно-красным цветом. По происхождению (проксимальный), сократить связок подключения к проксимальной половины задней большеберцовой кости вдоль линии soleal и проксимальных 1/3 от задней малоберцовой кости; дальше, в место вставки (дистальных), сократить пяточные сухожилия, которая вставляет в задний пяточной кости. Аккуратно освободите камбаловидной и правильно смонтировать камбаловидной мышцы в бане камеры, как и для EDL.

3. Измерение сократительной способности изолированных скелетных мышц

1. Как только мышцы крепятся в отдельных камерах ванны ткани, начать запись. Большинство подобных систем позволяет обнуление базовой силы записи. Эта функция обычно ассоциируется с усилителем, в конкретном случае системы PowerLab, как функцию моста усилителя. Это облегчает наблюдение базовые изменения и предоставляет удобный способ для всех мышечных сокращений, которые будут проанализированы с нуля. Изолированные мышцы затем стимулировали квадрат-волновых импульсовкоторые могут варьироваться широко, как функция камеры размер, толщина платины проводов, расстояние между проводами, и даже состав экспериментального решения. Мы использовали ток 60 мА (мы отметили, что токи выше 350 мА, кажется, быть вредным для подготовки мышц) и стимулирующие поезда 350, 500 и 1000 мс, в зависимости от целей конкретного протокола. Отдельных прямоугольных импульсов, должны были продолжительностью от 0,3-1 мс.
2. Следующим шагом является выбор частоты стимуляции способны производить плавленый стимуляции тетаническое (например: ~ 100 Гц позволяет производить максимальную силу в EDL мышцы и ~ 60 Гц в мышцах камбаловидной), а медленно и осторожно растягивая мышцы, чтобы определить Оптимальная длина этих мышц. Как мышц тщательно растянуты, подождите 30 секунд и стимулировать при 100 Гц, подождите 30 секунд и снова растянуть, а затем повторить стимуляцию, до точки, где сила не увеличится больше.
3. Эти мышцы имеют undergonэлектронной значительные изменения в окружающей среде. Рекомендуется, чтобы мышцы иметь возможность адаптироваться к новой среде, шаг в наших протоколах называют "равновесия". Уравновесьте эти мышцы на той же частоте стимуляции использовали при растяжении фазы, 100 Гц в течение 20-30 мин, по крайней мере до 5 последовательных сокращений тетаническое полностью стабильным (не сокращение, а не увеличение, стабильный базовый уровень). Периодичность стимулирующего поездов (100 Гц, 500 мс, 1 мс отдельного импульса) в течение равновесия в 1 мин, что соответствует скважности 1,66%, не утомительное стимуляции. В связи с этим, рабочий цикл 1,66% означает, что в общей сложности на 100%, мышцы работают 1,66% времени, за счет увеличения мышц рабочий цикл в конечном итоге может быть привлечен к усталости. Если в противном случае мышцы здоровые, дикий тип мыши показать утомительно профиля в течение этого периода уравновешивания, вполне возможно, что они были повреждены во время вскрытия, гипоксия, происходящих в камерах / мышцы, или чрезмерное элементовctrolysis через стимулирующие электроды генерации свободных радикалов. Westerblad ранее предположил, что ток более 400 мА вызывают образование свободных радикалов ^23. Очевидно, что высокое качество платины предложил, так как другие металлы, безусловно, приведет к образованию свободных радикалов и мышечной токсичности.
4. Получить силу в зависимости от частоты отношения (FF), стимулируя мышцы со следующими частотами стимуляции: 1-140 Гц (с шагом 5-10 Гц), с периодичностью 30-60 сек при проведении экспериментов при 25 ° C. При проведении экспериментов при 37 ° C, расширить FF на более высокие частоты до 300 Гц в течение мышцы диафрагмы, 180-200 Гц для камбаловидной и 220-250 Гц для EDL. Далее, определить частоты стимуляции, которая генерирует максимальную силу тетаническое _(Т мах) и примерно ½ максимальной силы тетаническое (1/2 T _макс), иногда трудно получить точные ½ T _макс для EDL и единственныйнам мышц, если только один стимулятор источника используется, из-за внутренних различий между этими мышцами. Жизнеспособным решением является определение частот, который производит 30-70% T _макс. Основанием для этих частотах стимуляции является то, что T _макс предоставляет важную информацию о событиях сократительной техника / модуляции, в то время как ½ T _макс предоставляет информацию более актуальной в Ca ^{2 +} регулирование и процесс ECC. Чтобы быть уверенным, что максимальная сила была достигнута, 10-20 мм кофеина могут быть добавлены в растворе ванны в то время как стимулирующие мышцы. Если максимальная сила была достигнута, сила не будет увеличиваться в присутствии кофеина. FF смещается вправо и сил, как правило, несколько выше при более высоких температурах экспериментальная. Используя эту систему, любые другие частоты стимуляции может быть выполнено, если желательно. Различных сократительных профиля быстро гликолитических EDL мышцы и медленно окислительного камбаловидной мышцепоказано на рисунке 2.
5. После уравновешивания, усталость мышц ½ T _макс течение 5 мин, при стимуляции интервалом 2 с и 25% рабочего цикла (рис. 3). Этот конкретный протокол утомительно, как полагают, чтобы лучше отразить вклад саркоплазматического ретикулума Са ^{2 +} в мышцах сократимость ^31.
6. Восстановление мышц в ½ T _макс течение 30 мин или до тех пор пока сила является стабильной, на 1-минутного интервала. Дополнительный протокол утомительной может быть выполнено сейчас, используя T _{максимальная} стимуляция, которая, как полагают, отражает состояние сократительной техники ^31. Другой вариант заключается в расширении утомительно протокол к интеркалировать стимулирующее поездов, которые генерируют Т _макс и ½ T _макс при усталости и восстановления мышц с тем же типом стимуляции.
7. Повторите FF как описано в пункте 3.4; на том основании, что фенотипические различия между разн.различны штамма, болезнь моделей или медикаментозное лечение можно наблюдать, анализируя FF до и после усталости. Мы, например, ранее сообщалось, что после усталости FF молодого дикого типа мышц сдвигается влево, в то время как в мышцах от возраста мышцы, она смещается вправо, предполагая, дифференциальные модулирующие эффекты скелетной мышечной усталости в зависимости от старения.
8. Чтобы исследовать вклад внеклеточного Са ^{2 +} в мышечной сократимости, купание решение может быть изменено в раствор, не содержащий Ca ^{2 +,} но 0,1 ммоль EGTA (0 мМ Ca ^{2 +} Tyrode решения) ^32. Кроме того, различные блокаторы магазин управлением канала могут быть применены в растворе ванны. Несколько примеров: 2-аминоэтил diphenylborinate (2-APB), SKF96365, 3,5-бис (трифторметил) пиразол 2 (БТП-2) и azumolene, ³³ и ^{т.д., 34.} Кофеин может быть использован для исследования функции рианодиновых рецепторов, и KCl могут быть использованы для оценки общейдеполяризации свойств этих препаратов. Другие препараты также могут быть использованы для исследования важны модуляции силы при усталости, Na ^+, K ⁺ и Na ^{+-K +} насоса ^35. Большинство из этих препаратов имеют относительно небольшие размеры и, кажется, быстро диффундируют в эти мышцы препараты, как свидетельствует их непосредственных последствий. Отсутствие эффекта от любого наркотики, не обязательно означает, что препарат неэффективен и дополнительные тесты с использованием дозы гораздо выше, чем используемый в экспериментах одного мышечного волокна иногда необходимы.
9. Одной из уникальных применения этой бывшей системе естественных условиях привели к недавним открытием механик аНегпапз в ^{Трик-- / -} мышцы ^{4, 30.} АНегпапз определяется как колебания эпизодов взрыв сократительной силы во время снижения фазы утомительно анкету. Во время этих событий сократительной силы могут мгновенно увеличить выше прежнего уровня силы во времяутомительно стимуляции, потому что либо более Ca ^{2 +} в настоящее время освобождены или сократительной техника стала более чувствительной к Ca ^{2 +.} Сократительной вспышки сила должна быть на 50% выше, чем его предыдущая силы и вспышки следует рассматривать по крайней мере 10 раз в течение 5-минутной усталости процессе стимуляции. Механика аНегпапз не распространены в скелетные мышцы от мышей дикого типа, но можно увидеть в некоторых мутантов мышц с возмущением внутриклеточного Ca ^{2 +} сигнализация процесса, такие как тримерных внутриклеточного катионного типа Channel (Трик-) ^{- / -} мышцы ^4. Механика аНегпапз могут быть вызваны через утомительные раздражения, лечение с кофеином и циклопьязониковой кислоты (CPA), см. рисунок 3 для представителя запись этих механических аНегпапз. Природа этого явления довольно интригующим, в то время как мышцы, которые утомительно кажется способным мгновенно производить больше силы. В нашей предыдущей публикации, В комбинации с одной клетки Ca ^{2 +} анализ показывает, что появление аНегпапз является результатом SR Ca ^{2 +} перегрузки и неустойчивой SR. Мы считаем, что более глубокое понимание аНегпапз может привести к лучшему пониманию процесса ECC.
10. В конце эксперимента, измерения длины и веса отдельных мышц с использованием калиброванных суппорта и аналитические весы, заморозки мышцы в жидком азоте и сохранить при -80 ° С, так как биохимические анализы можно проводить в этих мышц. Эти мышцы также может быть механически кожу для подробного зондирования процесс ECC, или быть химически кожей для определения основных сократительных свойств в отсутствие ECC регулирующих механизмов.
11. Записанные мышечной силы (мВ) сначала преобразуется в грамм силы на основе результатов калибровки, а затем нормированы на физиологическом площадь поперечного сечения (PCSA), используя следующую формулу: мышечная сила (Н / см ²⁾ = (сила (д) х мышцы lengtч (см) х 1,06) / (мышечная масса (г) х 0,00981) ^5,36. Кроме того, мышечная сила может быть нормирована на общий белок или общее содержание актина отдельных мышц использованием Бредфорда белка / Commossie синего окрашивания количественной оценке. При определенных условиях в то время как мышечная масса может быть серьезно пострадали из-за болезни, старение, медикаментозное лечение, сила нормализации основан на мышечной массы, белка и / или содержание актина может обеспечить более стабильное считывание.

4. Представитель Результаты

Типичные комнатной температуре сократительной силы EDL и камбаловидной отвечая на низкой, средней и высокой частоты стимулов показано на рисунке 2. EDL сокращения, вызванного 5 Гц стимулом остается в виде отдельных дергается в связи с быстрым действием SERCA Ca ^{2 +} АТФазы и внутренней Ca ^{2 +} чувствительность сократительных свойств машины, в то время как камбаловидной сокращение на 5 Гц начинает плавиться (медленнее АТФазыд выше чувствительность к Са ^{2 +} сократительной машин), но пик силы по-прежнему отдельная. На 20 Гц стимуляции, EDL сокращений частично слиты в то время как камбаловидной образует полностью слиты тетаническое силу. На частоте стимуляции, которая производит Т _макс стимуляции, которая может изменяться при комнатной температуре от 80-110 Гц для EDL и 60-90 Гц для камбаловидной, быстрый ход вверх и быстрой релаксации тетаническое силы в EDL отмечается, что противоречит медленных характеристик камбаловидной мышцы. рис. 2В показывает, что сила-частотной кривой EDL мышцы смещается вправо по сравнению с камбаловидной мышцы, указывая, что камбаловидной мышцы более чувствительны к Ca ^{2 +} релиз в любой заданной частоты стимуляция в связи с наличием медленных миозина и тропонина изоформ. Кроме того, сократительная техника реагирует с относительно большей силой в камбаловидной мышцы на более низких частотах. Рис. 3, показывают,са нормальных усталость профиль EDL (верхняя панель) и камбаловидной мышцы (средняя панель). Обратите внимание на более быстрое снижение сократительной силы под утомительно стимуляции в EDL мышцы и выше снижение в силу в конце 5-минутного усталость протокол. И, наконец, типичные механические профиль alternan мутанта мышцы показано на рисунке 3 (нижняя панель), который был определен как мгновенная вспышка силы во время нисходящей фазы мышцы профиль усталость. Сократительной вспышки сила должна быть на 50% выше, чем его предыдущая силы и вспышки следует рассматривать по крайней мере 10 раз в течение 5-минутной усталости процессе стимуляции.

Рисунок 1. Схематическое изображение 4-канальная система бывший сократимость естественных условиях. Прямоугольные импульсы генерируются компьютером управления трава стимулятор. Две единицы стимуляции выделения фильтрации стимулов, происходящих из электроновческие единицы стимулятор, чтобы удалить любые колебания в электрический сигнал и создать стабильную сигнал прямоугольной формы. Это фильтруют электрический сигнал передается на 4 купания камер, содержащих платиновые электроды, проволока, окружающих каждый изолированной мышцы. В конечном счете, это ток через два электрода (так называемые поля стимуляция), которые генерируют потенциал действия, вызывая сокращение мышцы. Это сокращение определяется по конкретным датчики силы, передаваемой на мост усилители, фильтруют, усредненная (сигнала) и записал с помощью компьютерной программы через A / D конвертер.

Рисунок 2. . Представитель сократительной силы EDL и камбаловидной (A) сократительных сил индуцированные 5 Гц (верхняя панель), 20 Гц (средняя панель) и максимальный тетаническое силы (Т _макс) (нижняя панель); входе показывает след сократительную способность повреждение мышц; (B)Представитель установить демонстрация отдельных сокращений силы от частоты отношения в EDL (FF, верхняя панель) и Кривая, в результате FF (нижняя панель). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Представитель утомительно профиля и механических аНегпапз. Типичные быстрое снижение утомительно профиль EDL мышцы (верхняя панель) и медленное снижение утомительно профиль камбаловидной мышцы (средняя панель). Утомительно стимуляция приводит к появлению механических аНегпапз в ^{Трик-- / -} мышцы с нарушенным Ca ^{2 +} обработка свойств (нижняя панель).

Discussion

Измерение сократительной силы и утомляемость имеет важное значение для общей оценки функции скелетных мышц. Основной целью этого анализа является выявление изменений в мышечной силе и утомительно свойства при некоторых патологических состояниях, таких как саркопения и мышечной усталости, и проверить действие наркотиков / реагентов на мышечную сократимость. С мышечной силы тесно связано с внутриклеточной Са ^{2 +,} внеклеточный Са ^{2 +} и перекрестных помех между этими двумя, мы можем также собирать информацию о Ca ^{2 +} сигнализация состояния в скелетных мышцах с помощью этого метода. Здесь мы показали уникальный фенотип называют «механиком аНегпапз", когда колебания эпизодов взрыв сократительной силы во время снижения этап утомительного профиля были замечены в перегруженных и неустойчивой SR. Можно ожидать, что различные скелетные мышцы фенотипов в том числе измененной силы, FF, утомляемость, сократительная кинетики и восстановления ABility после усталости могут быть обнаружены с помощью анализа сократимости в пробирке при различных патологических состояниях.

Самым важным шагом для данного анализа заключается в изоляции целом нетронутыми мышц (или мышечных пучков и мышц полосы), которые свободны от повреждений. Такие цели легче достичь в целом подготовка мышц. Здесь мы показываем, что оставляя достаточно связок и сухожилий, чтобы связать все мышцы очень важны для предотвращения связывания самой мышце, что приводит к повреждению мышц и мышц в конечном итоге смерть. Кроме того, постоянное бульканье решения с или 100% O ₂ в случае HEPES-решений на основе или смеси O ₂ и CO ₂ на основе бикарбоната решения является критической. Предупреждение гипоксии и гипероксии важно в то время как расходомер может быть использован. Мы также использовали в определенной ситуации определенное устройство, которое измеряет растворенного кислорода в жидкостях купания ткани. При определенных условиях, когда мышцы морэлектронной склонны к повреждениям, обработка изолированной мышцы в Ca ^{2 +-бесплатное} решение до монтажа на датчик силы поможет расслабить мышцы и уменьшить повреждение мышц перед экспериментом. Наркотики, такие как 2,3 - бутандион monoxime (BDM) или N-бензил-п-толуол сульфаниламидами (BTS) также могут быть добавлены во время рассечения свести к минимуму ущерб, особенно если мышечные пучки или мышечные полоски готовы, которая является общей для исследования сократительной мембраны ^{37, 38.} Во время записи, поврежденные препараты, как правило, производят меньше сил и повышенный шум базовой линии и флуктуации (см. входе рис. 2), и результаты этих мышц могут быть исключены из анализа набора данных, если она не является частью эксперимента для анализа ответов поврежденную мышцах. Еще один момент, который можно легко игнорировать или забывать о том, что электрическая стимуляция сама по себе может быть источником токсичности для мышц. Мы рекомендуем периодически чистить электроды и chambэ с 1% раствором гипохлорита для удаления примесей, белков мусора, окисление накопления и т.д. Особые предостережения также требуется при регулировке длины монтируются мышцы. Важно, чтобы протянуть в небольших шагов, чтобы избежать чрезмерного растяжения в качестве оптимального выравнивания тонких и толстых нитей имеет решающее значение для эффективного поперечного моста функционирования ^39. Кроме того, рекомендуется, чтобы относительное положение установлен мышечные пучки к электродам поле стимуляции постоянным и приведены в соответствие между всеми каналами для обеспечения равного количества электрического тока наносится на изолированные мышцы. В наших условиях, мышцы от молодых мышей дикого типа остаются стабильными в течение 12 часов и даже дольше, если антибиотики, 0,2% FBS, и аминокислоты добавляют в растворе ванны.

С осторожностью и надлежащего управления, это бывшая система естественных условиях могут предоставить информацию о корреляции между Ca ^{2 +} сигнализацияг сокращение мышц без сложностей сосудистой, эндокринной и нервной систем. Например, потеря зависимости от внеклеточного Са ^{2 +} является подписание в возрасте скелетных мышц в то время как SR Са ^{2 +} дисфункция обычно дает нижнюю сократительную способность и быстрое утомительно анкету. Как exampled здесь, появление механических аНегпапз указывает неустойчивым SR, который мы считаем не ограничивается ^{Трик-- / -} мышцы, а также в других скелетных мышц при патологических условий, порождающих SR Ca ^{2 +} перегрузки и нестабильности. Эта установка обеспечивает прямой доступ из мышц для различных физиологических и фармакологических манипуляций.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg - 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5