Summary
通过结合抛光和增强的薄的头骨（端口）的颅窗和胶质母细胞瘤（GBM）细胞注射，我们可以观察到活老鼠大脑中的纵向注入GBM细胞胶质瘤的萌生和扩展。
Abstract
神经胶质瘤是最致命形式的人类癌症之一。最有效的神经胶质瘤治疗，手术日期，然后通过辐射处理，为患者提供只有温和的好处，因为大多数患者没有生存超过5年诊断后，由于神经胶质瘤复发1,2。在人脑肿瘤中的癌干细胞的发现带来了希望有新的治疗策略的发展产生巨大的影响脑胶质瘤3。癌症干细胞是指通过他们的自我更新和分化能力，被认为是唯一的肿瘤细胞有能力启动新的肿瘤4。神经胶质瘤复发放射治疗后产生的电阻（GSCS）治疗脑胶质瘤干细胞被认为是5-10。 在体内 ，的GSCS是居住在血管周围是很重要的利基，为保持其干细胞样特性11-14 。中央的organization的GSC利基的血管内皮细胞12。现有证据表明GSCS及其与血管内皮细胞的肿瘤的发展是重要的，和拣选GSCS及其与内皮细胞作为重要的治疗目标胶质瘤。实验确定他们的能力，引发新的肿瘤，在原位肝移植15的存在GSCS。这通常是通过注入GBM细胞的特定数目的从人类肿瘤中分离到的严重的免疫缺陷小鼠的大脑，或鼠标GBM细胞到同源宿主小鼠的大脑。检测肿瘤的生长足够的时间，让GSCS注入GBM细胞之间引起新的肿瘤，通常几个星期或几个月后进行。因此，现有的检测不允许从单一的GSCS 体内肿瘤的发生过程中的重要病理检查。因此，基本我nsights到GSCS和它们的相互作用，与血管内皮细胞的肿瘤发生的早期阶段的具体作用缺乏。这种见解是开发新的治疗脑胶质瘤的策略至关重要，并且将有很大的影响，对防止脑胶质瘤复发的患者。在这里，我们已经适应了端口颅窗口程序16和体内双光子显微镜，让可视化注入的的GBM细胞在活老鼠的大脑肿瘤的发生。我们的技术铺平了道路，为未来努力澄清的关键信号传导机制之间的GSCS和血管内皮细胞在神经胶质瘤开始。
Protocol
1。协议
- 麻醉的小鼠氯胺酮和甲苯噻嗪，剂量为0.1毫克氯胺酮和0.01毫克甲苯噻嗪每1克的机身重量。卡洛芬（0.005毫克每1克的机身重量）用于镇痛，术前进行管理。
- 所有的外科手术工具，包括牙科钻头，是在高压釜中灭菌的蒸汽。如果批处理以进行手术，手术器械的前端必须重新灭菌用玻璃珠灭菌器（精细科学工具FST 250）之前，每个后续的手术。
- 一旦鼠标已经达到了手术麻醉平面的，没有一个响应于一个脚趾捏评定，它被放置在化妆棉的加热垫，然后放置在〜37℃下保持体温在手术过程中麻醉深度监测。
- 皮草是从一个大致呈三角形面积的背头〜3 mm的尾侧鼻孔和尾部延伸向行政长官rvical椎骨。眼药膏的眼睛，以保护他们免受脱水和刺激。
- 的鼠标放置在腹侧recumbancy的皮肤消毒手术碘，70％乙醇和无菌拭子。用细剪刀，一个0.8×1.0厘米的皮瓣覆盖的头骨的正面和顶骨的背侧皮肤被删除。
- 本地骨膜和暴露在伤口的周边组织的局部止痛剂，0.5％的利多卡因，被施加。骨膜除去，用手术刀刀片轻轻刮头骨，这将有助于氰基丙烯酸酯胶，坚持到骨头。
- 皮质区的头骨的标志上列出的兴趣。感兴趣的区域不应该设在颅骨缝合线，以避免潜在的大血管的损害。
- 一层薄薄的氰基丙烯酸酯类粘合剂被施加到伤口上边距，serosanguinous流体，以防止渗漏，除了在颅骨感兴趣的区域。
- 在我们的协议中使用的光活化的牙科水泥密封的头骨。牙科用粘固剂的应用之前，所有暴露颅骨除了用于与变薄的区域用的引物，并随后用粘接剂的光活化的牙科用粘固剂套件。一旦干燥粘接剂，光活化的牙科用粘固剂被施加到覆盖颅骨。为了随后的外科手术和成像稳定的鼠标的头部，无菌＃00-90六角螺母嵌入的牙科用粘固剂在从区域的距离以变薄。光激活的牙科水泥的使用，而不必急于完成的整个过程，让我们准备的头骨。一旦在颅骨上的牙科用粘固剂制备完成时，牙科用粘固剂的固化与可见光。
- 的牙科用粘固剂固化后，头状从立体定向装置持有人使用＃00-90螺钉鼠标头被安装到上的六角螺母。
- 一个博士运算室温，0.9％无菌盐水中被施加到颅骨区域以变薄。在立体显微镜的帮助下，一个高速的微钻头用于薄（通常约4-5毫米的直径）在感兴趣区域的圆形区域的颅骨。钻井和应用生理盐水钻取区域变薄过程中间歇地进行，以避免热损伤相关的脑组织。盐水吸收热量，还有助于软化骨骼。
- 小鼠颅骨包括两个薄层密质骨，中间夹了一层厚厚的海绵状骨。紧凑的骨和大部分的海绵骨的外部层中除去使用的钻头。
- 后的松质骨的大部分被除去，在海绵骨内的其余空腔可以看到在解剖显微镜下，表明钻探接近的内部致密骨层。在这个阶段，颅骨厚度仍然应该超过50微米。颅骨变薄继续仔细，得到一个非常薄的（〜20微米）和光滑的制备。
- 一旦实现所需的头骨厚度（20微米），颅骨抛光用一个特制的硅鞭钻石膏（6-15微米）约10分钟。钻石膏抛光的目的有两个。首先，它进一步变薄颅骨的减薄颅骨上不施加压力，从而避免意外损坏底层脑组织。其次，它作为一个初始抛光步骤，用于减薄颅骨细粒的氧化锡被用于进一步的颅骨抛光之前。
- 继钻石膏抛光，减薄的颅骨抛光用氧化锡为约10分钟。一旦头骨是抛光，氧化锡用生理盐水冲走直到出现减薄颅骨干净。
- 在这一步，如果颅窗口是用于纵向体内成像，清洁的薄颅骨区域干燥。一小滴明确腈基丙烯酸酯胶施加到密封颅窗。减薄的颅骨和盖玻片之间的腈基丙烯酸酯胶的层应尽可能地薄。
- 如果注射剂是创建一个端口颅窗后要执行的，在此步骤中，使用26号注射器针头的抛光薄膜颅骨窗口的一侧上创建一个小的开口。此开口用于GBM细胞注射。
- 的无菌玻璃吸移管的前端开口的直径约为50μm的拉使用的移液管的牵拉。此吸移管将用于GBM细胞注射，被加载到显微操作。吸液管是装在一个30度角，使GBM细胞注射部位会离最终的成像站点。在解剖显微镜下的前端的移液管除去。 GBM的细胞悬浮液通过吸进移液管使用的注射器泵前加载。
- 一旦被加载与GBM细胞的注射针，将鼠标移回下个Ë显微镜。降低对注射针小口颅窗和，最后插入大脑通过使用一台显微开幕。 1微升GBM细胞悬浮液被注入到大脑从大脑表面（速度：0.1微升/分钟，持续时间：10分钟）的100-200微米。
- 干燥的头骨，明确的氰基丙烯酸酯胶一小滴被施加到干燥的颅骨，和3毫米大小排名第1盖玻片一块粘接薄和抛光的头骨区域。盖玻片之间的空间中与相邻的牙科用粘固剂是氰基丙烯酸酯胶密封。
- 手术后，小鼠皮下注射1毫升温水无菌生理盐水，补充热量，以维持体温，直到完全从麻醉中恢复。
- 成像，老鼠是在0.1毫克的氯胺酮和甲苯噻嗪每1克体重0.01毫克的剂量用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉。小鼠固定使用一个自定义的立体框架在显微镜下。如果每天重复的活体成像，异氟烷将是一个更好的选择，因为老鼠会出现重复使用氯胺酮的依赖。
2。代表性的成果
一个成功的端口颅窗手术治疗颅窗保持清醒的几个星期到几个月。 图1显示了一个端口颅窗下方的血管应用后向散射光。这些的血管图像被重复成像定位相同的大脑区域的地标。为了形象化的血管内皮细胞和GBM细胞，我们穿过B6.Cg-TG（TEK-CRE）1Ywa / J小鼠血管内皮细胞，其中标注的TM9 B6.Cg-GT（ROSA）26Sor“”（CAG-tdTomato ）HZE / J小鼠，和生成的红色荧光蛋白tdTomato的标记用血管内皮细胞的小鼠。然后，我们进行这些英里的端口开颅手术过程策，并注入到他们的大脑的GFP标记的GBM细胞通过一个小口的颅窗的一侧上。然后，我们在体内进行双光子成像纵向上的小鼠注射。的激光激发波长为910 nm，这导致在激发GFP和tdTomato。双光子成像与两个探测器同时绿色/红色荧光检测能力进行一个定制的双光子激光扫描显微镜。 图2显示了脑胶质瘤开始从附近的血管注入GBM细胞在体内的例子。的端口颅窗也是一个很好的选择，长期时间的推移， 在体内成像。 图3显示了从小鼠的皮质部分没有端口的手术，鼠标端口，手术后7天，和鼠标7天的端口手术后，GFAP染色生理盐水注射。很明显，从图像中的鼠标没有手术和鼠标PORTS手术不会有胶质细胞增生，而注射生理盐水后，胶质细胞增生的小鼠在脑组织中观察到，在大脑中，由于移液渗透和生理盐水注射。这一结果表明，胶质细胞增生不会发生的颅窗下的端口，提供独立的验证颅窗这里所描述的端口不会导致胶质细胞增生，通常与“开放性颅骨”慢性颅窗。 图4显示了高清晰度树突棘的端口窗口创建后从手术当天（0天）相同的鼠标和32天（32日），显示的端口窗口也是一个很好的选择， 在体内成像的高分辨率的成像。
图1。抛光和增强薄头骨的颅窗采用反向散射光下的血管可视化。数指吨 GBM细胞注射完成后立即采取手术当天开始他的天数，手术后的图像。比例尺：0.5毫米。 点击此处查看大图 。
图2。注入的的GBM细胞和血管在体内的可视化。小鼠被用于运载TEK-Cre和ROSA26 CAG-tdTomato的GBM细胞注射。血管内皮细胞标记与tdTomato（红色），与GFP（绿色）和GBM细胞标记。图像被收购GBM细胞注射后24小时开始。共10-12相邻的视场被组装彼此相邻的，与所识别的注入GBM细胞的总场的中心，以产生最终的图像。天手术后的天数。比例尺：100微米。HREF =“http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg”目标=“_blank”>点击这里查看大图。
图3。胶质细胞增生不会发生以下端口的颅窗手术。上面板：低倍率下的小鼠大脑冠状切面。左面板：鼠标没有任何脑神经窗口手术，没有GFAP激活的脑组织中观察到。中间面板：鼠标与A端口的大脑的右侧产生的颅窗;胶质原纤维酸性蛋白激活的脑组织中观察到。右侧面板：鼠标端口与颅窗和生理盐水注射侧的端口窗口。 GFAP的可观察到激活的端口“窗口的侧面上，但不包括在完整的脑组织的一侧。比例尺：1毫米。下面板：更高功率的图像领域的脑组织，在上部面板的图像的白框的指示。比例尺：100微米。 
图4。从THY-1 YFPH小鼠的树突棘的高分辨率成像。图像被收购的端口手术的当天，端口手术后32天。这是明显的，从图像，大多数棘上存在的天0顷清晰可见32天以下端口手术。比例尺：2微米。
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Discussion
一个成功的端口颅窗的关键是减薄和抛光。虽然最初的细化，可以迅速执行，护理应采取措施，确保在大面积同质的头骨变薄。我们通常涂上一层薄薄的生理盐水到颅骨，然后薄颅骨一通的时间，使得生理盐水溶液蒸发后不久的微钻头已经越过颅骨一次。这让我们缓慢而均匀薄头骨。在显微镜下是一个稳定的手也很关键。一旦，颅骨变薄接近预期的厚度，我们通常使用金刚石研磨膏打磨变薄颅骨10-15分钟，与随后的抛光机使用氧化锡。我们发现，减薄的头骨先用金刚石研磨膏抛光，产生更好的抛光效果一般，还没有应用到薄的颅骨面积很大的压力，使我们能够进一步瘦了大面积的颅骨面积。
我们选择的端口CRanial的窗口，而不是其他常用的头颅窗，如“开放性颅骨”窗口和“薄头骨”窗口，有以下原因：随着开放性颅骨窗口，颅窗变得混浊创建后不久，然后清除了在它自己的头两个星期，因此需要等待一段时间，大约两个星期前，可以进行任何成像实验。在最初的GBM细胞注射后两周，这两周的等待期防止脑胶质瘤开始的可视化。要求每个成像会议，这使得它不适合GBM细胞注射和可视化的神经胶质瘤开始每天重复疏薄的头骨的颅窗。相比之下，端口窗口，使我们能够从侧面的窗口，最大限度地减少损伤的脑组织，也可以表现的高分辨率成像后立即创建的窗口执行GBM细胞注射。天道酬勤ormation对胶质瘤开始后的头几个星期内可以收集GBM细胞注射，这是一个关键的优势技术，这种类型的研究在开放性颅骨。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由杰克逊实验室癌症中心的试点格兰特和美国缅因州癌症基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
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