Summary
ポリッシュと補強薄頭蓋骨（ポート）頭蓋窓と神経膠芽腫（GBM）の細胞注入を組み合わせることによって、我々は、神経膠腫の開始と縦ライブマウスの脳内に注入GBM細胞からの成長を観察することができます。
Abstract
神経膠腫は、ヒト癌の最も致命的な形態の一つです。日付手術に最も効果的な神経膠腫の治療は、放射線に続くほとんどの患者は神経膠腫の再発1,2に起因診断後五年以上生きていけないように、患者にわずかな利益を治療しています。ヒト脳腫瘍における癌幹細胞の発見は、神経膠腫の3のための新規治療戦略の開発に多大な影響を持っていることのための可能性を秘めています。がん幹細胞は、その能力、自己再生すると区別するために、新たな腫瘍4を開始する能力を持っている腫瘍で唯一の細胞であると考えられているの両方で定義されています。神経膠腫再発以下の放射線療法は、治療へのグリオーマ幹細胞の抵抗（GSCs）から発生すると考えられている5-10。 生体内では 、GSCsは、その幹細胞様の特性11-14を維持するために重要である血管周囲のニッチに存在することが示されている。 organiに中央GSCニッチのzationは12血管内皮細胞である。既存のエビデンスは、血管内皮細胞とGSCsとそれらの相互作用が腫瘍の開発のために重要であり、神経膠腫のための重要な治療標的としての内皮細胞とGSCsとそれらの相互作用を識別することを示唆している。 GSCsの存在は、同所移植15時に新しい腫瘍を開始するために彼らの能力によって実験的に決定される。これは典型的には深刻な免疫不全マウスの、またはホストコンジェニックマウスの脳にマウスGBM細胞の脳にヒト腫瘍から単離されたGBM細胞の特定の数を注入することによって達成される。腫瘍の成長のためのアッセイはその後注入GBM細胞間GSCsが新しい腫瘍 - 典型的には数週間あるいは数ヶ月を生じさせることができるのに十分な時間後に実行されます。したがって、既存のアッセイは、in vivoでのシングルGSCsから腫瘍の開始の重要な病理学的過程の検査を許可していません。したがって、本質的なIGSCsと腫瘍の開始の初期段階では血管内皮細胞との相互作用の具体的な役割にnsightsが不足している。このような洞察は、神経膠腫の新しい治療戦略を開発するために重要であり、患者では神経膠腫の再発を防止するための大きな意味を持つでしょう。ここでは、ポートの頭蓋のウィンドウプロシージャは16を適応していると、生体内で二光子顕微鏡は、生きたマウスの脳内に注入されたGBM細胞から腫瘍の開始の可視化を可能に。我々の技術は、神経膠腫の開始時GSCsと血管内皮細胞との間の重要シグナル伝達機構を解明するための今後の取り組みへの道を開くでしょう。
Protocol
1。プロトコル
- 0.1 mgのケタミンと体重1グラム当たりキシラジンの0.01 mgの用量でケタミンおよびキシラジンでマウスを麻酔。カルプロフェン（体重1グラム当たり0.005 mg）を、鎮痛のために使用され、術前に投与される。
- 歯科用ドリルビットを含む外科的なツールのすべては、オートクレーブで蒸気滅菌されています。バッチ手術が実行される場合には、手術器具の先端が、後続の各手術前にガラスビーズ滅菌器（ファイン科学ツールFST 250）で再滅菌しなければならない。
- マウスはつま先のピンチへの応答の有無によって評価麻酔の外科平面に達していると、それは、その後〜37℃の体温を維持するために加熱されたパッドの上に置かれる綿のパッド上に配置され麻酔の深さは、手術中に頻繁に監視されています。
- 毛皮はほぼ三角形の面積の背側頭部〜鼻孔に尾3ミリメートルから削除され、CEに尾側に延びているrvical椎骨。眼軟膏は、脱水や刺激から守るために目に適用されます。
- マウスは腹recumbancyに配置され、皮膚を外科ヨウ素、70％エタノール、滅菌綿棒で消毒されています。頭蓋骨の前頭葉と頭頂骨の背側面を覆う皮膚の0.8×1.0 cm商品フラップは細かいハサミを用いて除去する。
- 外用鎮痛、0.5％リドカイン、傷の周囲の骨膜と露出組織に局所的に適用されます。骨膜を穏やかにメスの刃で頭蓋骨を削って除去され、これが骨に付着するシアノアクリレート系接着剤を助けるでしょう。
- 興味のある皮質領域はマーカーで頭蓋骨に概説されています。関心領域は、基礎となる大型船への損傷を避けるために、頭蓋骨の縫合線の上に位置するべきではありません。
- シアノアクリレート系接着剤の薄層を除いてserosanguinous流体の漏出を防止するために、創傷の縁に適用され、頭蓋骨のことです関心のある領域。
- 光によって活性化された歯科用セメントは、頭蓋骨を封止するための我々のプロトコルで使用されています。歯科用セメントを塗布する前に、間伐のために意図された領域以外のすべての露出頭蓋骨をプライマーとし、続いて光活性歯科用セメントキットから接着剤で処理されます。接着剤が乾燥したら、光によって活性化された歯科用セメントは、頭蓋骨をカバーするために適用されます。その後の手術とイメージングのためのマウスの頭部を安定させるために、滅菌した＃00から90六角ナットを薄くする領域からの距離に歯科用セメントに埋め込まれています。光によって活性化された歯科用セメントの使用は、私たちは全体の手順を完了するために急いでしなくても、頭蓋骨を準備することができます。頭蓋骨に歯科用セメントの準備が完了すると、歯科用セメントは、可視光で硬化させる。
- 歯科用セメントを硬化させた後、定位固定装置からヘッドピースホルダーは、＃00から90ネジを使用して、マウスの頭の上に六角ナットに取り付けられている。
- DR室温のop、0.9％滅菌生理食塩水を薄くするために頭蓋骨の領域に適用されます。実体顕微鏡の助けを借りて、高速マイクロドリルは、関心のある領域にわたって頭蓋骨の円形領域（通常は直径〜4,5 mm）を薄くするために使用されます。掘削と掘削面積に生理食塩水のアプリケーションは、基礎となる脳組織への熱損傷を避けるために、間伐手順の間に断続的に行われている。生理食塩水は、熱を吸収し、また、骨を柔らかくするのに役立ちます。
- マウスの頭蓋骨は海綿骨の厚い層を挟んで、緻密骨の2つの薄層を含む。緻密骨と海綿骨の大部分の外部層は、ドリルを使用して除去される。
- 海綿骨の大部分が除去された後、海綿骨内の残りの空洞が掘削は内部コンパクト骨層に近づいていることを示し、解剖顕微鏡下で見ることができます。この段階では、頭蓋骨の厚さは依然として以上50μm以下である必要があります。間伐頭蓋骨は次のようになります非常に薄い（〜20μm）と滑らかな製剤を得るために慎重に続けた。
- 頭蓋骨の所望の厚さ（〜20μm）を達成されたら、頭蓋骨が最初の約10分間、ダイヤモンドペーストを使用したカスタムメイドのシリコーンホイップ（6から15μm）を用いて研磨されています。ダイヤモンドペースト研磨は2つの目的があります。まず最初に、それはさらにそれによって、基礎となる脳組織への偶発的な損傷を回避すること、間伐頭蓋骨に圧力をかけることなく頭蓋骨を薄く。ファイングレイン·スズ酸化物は、さらに頭蓋骨の研磨に使用される前に、第二に、それは薄くなった頭蓋骨の初期研磨工程として機能します。
- ダイヤモンドペースト研磨後、薄くなった頭蓋骨は、約10分間酸化スズで研磨されています。頭蓋骨を研磨したら薄くなった頭蓋骨がきれいに表示されるまで、酸化スズは、生理食塩水で流されています。
- 頭蓋窓が in vivoイメージングに縦に使用する場合は、このステップで、洗浄薄い頭蓋骨領域を乾燥させる。クリアの小滴シアノアクリレート系接着剤は頭蓋窓を密閉するために適用されます。間伐頭蓋骨とカバーガラスの間にシアノアクリレート系接着剤の層はできるだけ薄くする必要があります。
- 注射はポート頭蓋ウィンドウの作成後に実行する必要がある場合は、この段階では、26ゲージの注射針は、洗練された薄頭蓋骨ウィンドウの片側に小さな開口部を作成するために使用されます。この開口はGBM細胞注入のために使用されます。
- 直径約50μmを開く先端で滅菌ガラスピペット、ピペットプラーを使用してプルアップされています。このピペットはGBM細胞注入のために使用されるでしょう、そして、マイクロマニピュレータ上にロードされます。ピペットはGBM細胞注射部位は、最終的な撮像部位から離れるとなるように、30度の角度でロードされます。ピペットの先端は、解剖顕微鏡下で除去する。 GBMの細胞懸濁液をシリンジポンプを用いて吸引することによりピペットにフロントロードされます。
- 注入用ピペットはGBM細胞がロードされたら、マウスが目の下で後方に移動さ電子顕微鏡。注入用ピペットは頭蓋窓にある小さい開口部に向かって下降し、最終的にマイクロマニピュレーターを用いて開口部を通って脳に挿入されます。 GBMの細胞懸濁液1μlを脳脳表面100から200ミクロン（：0.1μl/分、持続時間：10分回転数）に注入される。
- 頭蓋骨を乾燥させ、明確なシアノアクリレート系接着剤の小滴は、乾燥頭蓋骨に適用され、3ミリサイズ＃1のカバーガラス片が薄く、洗練された頭蓋骨領域に接着されている。カバースリップと隣接する歯科用セメントの間の空間は、シアノアクリレート接着剤で封止されている。
- 手術後、マウスは1ミリリットル暖かい滅菌生理食塩水を皮下注射していると完全に麻酔から回復するまで体温を維持するために補足的な暑さを備えている。
- イメージングのために、マウスは0.1 mgのケタミンと体重1グラム当たりキシラジンの0.01 mgの用量でケタミンおよびキシラジンで麻酔する。マウスはカスタム定位フレームを使用して固定化されている顕微鏡下で。マウスはケタミンの反復使用と依存の兆候を示すようにin vivoイメージングの繰り返しが日常的に行われている場合、イソフルランは、より良いオプションになります。
2。代表的な結果
成功したポート頭蓋窓手術は頭蓋窓が数週間から数ヶ月のための明確なままにすることができます。後方散乱光を用いて可視化として、 図1はポート頭蓋窓の下に血管系を示しています。これらの血管系の画像は、繰り返しイメージングのための同じ脳領域を特定するための目印として用いた。血管系の内皮細胞およびGBM細胞の両方を可視化するために、我々はB6.Cg-GT（ROSA）26Sor TM9（CAG-tdTomatoと血管内皮細胞をラベルするB6.Cg-TG（テック-CRE）1Ywa / Jマウスを、交差させる）Hze / Jマウス、および赤色蛍光タンパク質tdTomatoで標識された血管内皮細胞と生成されたマウス。そして、私たちは、これらマイル上のポートの開頭手術を行ったCE、および頭蓋窓の側の小さな開口部を通って、自分の脳にGFP標識GBM細胞を注入した。次に、注射したマウスで縦方向に二光子イメージング生体内で行った。レーザー励起波長は、GFPとtdTomato両方の励起につながっ910 nmで設定されていました。二光子イメージングは同時赤色/緑色蛍光検出能力のための2つの検出器で特注の二光子レーザー走査顕微鏡で行った。 図2は、血管系の近くに注入されたGBM細胞から神経膠腫開始の in vivoでの例に示します。ポート頭蓋窓もin vivoイメージングタイムラプス慢性ための優れた選択肢です。 図3に示すポートの手術をせずにマウスの皮質切片のGFAP染色、ポート手術後のマウスの7日間、マウス7日、次のポートの手術と生理食塩水を注入。それは手術をせずにマウスとPOR付マウスその画像からも明らかであるTSの手術は脳内浸透と生理食塩水の注射をピペットに起因し、生理食塩水注射後のに対し、グリオーシスは、マウスの脳組織で観察される、グリオーシスを持っていない。この結果は、神経膠症は頭蓋窓は、ここで説明ポートが一般的に"開かれた頭蓋骨"慢性頭蓋ウィンドウに関連付けられている神経膠症につながらないことを独立した検証を提供して、ポート頭蓋窓の下では発生しませんを示しています。 図4は高解像度を示していますPortsウィンドウもin vivoイメージングの高分解能のための優れた選択肢であることを実証して手術の日に同じマウス（0日目）からの樹状突起スパインのイメージングと32日Portsウィンドウを作成した後（32日目）。
図1：後方散乱光を用いて研磨し、補強された間伐頭蓋骨頭蓋窓下の血管系の可視化。日tを表す手術の数日後、彼は数、画像はすぐにGBM細胞注入が完了した後に手術の日に始まる撮影された。スケールバー：0.5mmの拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2：in vivoで注入されたGBM細胞と血管系の可視化。 TEK-CREおよびROSA26 CAG-tdTomato両方を持つマウスは、GBM細胞注入のために使用された。血管内皮細胞は、tdTomato（赤）で標識した、とGBM細胞は、GFP（緑色）で標識した。画像はGBM細胞注射後24時間を開始を取得した。ビューの10-12隣接するフィールドの合計を採取し、最終的な画像を生成するために、合計フィールドの中央に注入された識別されたGBM細胞と、互いに隣接して組み立てた。日は、手術後の日数を表す。スケールバー：100μmである。href =の"http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg"ターゲット= "_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図3：グリオーシスは、ポート頭蓋窓手術後は発生しません。アッパーパネル：低倍率下でのマウス脳冠状断面。左のパネル：任意の頭蓋窓の手術をせずにマウス;なしGFAPの活性化は、脳組織で観察される。中央のパネル：脳の右側で生成されたポート頭蓋窓が付いているマウス、ノーGFAPの活性化は、脳組織で観察される。右のパネル：Portsウィンドウの側からポート頭蓋窓と生理食塩水の注射でマウス。 GFAPの活性化は、Portsウィンドウの側ではなく、無傷の脳組織の側に観察される。スケールバー：1ミリメートル。下部パネル：上部パネル画像のホワイトボックスに示されているように地域での脳組織の高出力画像。スケールバー：100μmである。 
図4高解像度THY-1 YFPHマウス由来の樹状突起スパインのイメージング。画像は、ポートの手術の日に取得され、32日ポートの手術後に行った。それは、ほとんどの棘が一日に提示したイメージから、0ポート手術後のはっきり見える32日アールは明らかである。スケールバー：2μmである。
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Discussion
成功したポート頭蓋窓の鍵は、間伐や研磨です。間伐初期は迅速に行うことができますが、注意が広い面積にわたって頭蓋骨の間伐均質性を確保するために取られるべきである。我々は一般的に生理食塩水がマイクロドリルは一度頭蓋骨を通過した直後に蒸発するような、頭蓋骨に生理食塩水の薄い層を適用し、薄い頭蓋骨ワンパス時。これはゆっくりと、しかし均一さらに薄い頭蓋骨に私たちをことができます。顕微鏡下で着実に手も鍵となります。頭蓋骨-間伐が意図した厚さに近づいたら、我々は通常、酸化スズを使用して、後続の研磨と、10〜15分間間伐頭蓋骨を磨くためにダイヤモンドペーストを使用します。我々はダイヤモンドペーストとの最初の間伐頭蓋骨を研磨すると、一般的により良い研磨結果が得られることを発見し、また、私たちは間伐頭蓋骨領域に多くの圧力を適用することなく、頭蓋骨領域の薄い大面積を促進することができます。
我々は、ポートcrを選んだむしろ次のような理由でそのような "開かれた頭蓋骨"ウィンドウと "間伐頭蓋骨"ウィンドウのような他の一般的に使用される頭蓋窓、よりanialウィンドウ：オープン頭蓋骨のウィンドウでは、頭蓋窓は通常、作成した直後に濁り、その後晴れる任意のイメージング実験を実行する前に、独自の最初の2週間以内に、このようにして約2週間の待機期間を要する。待機期間この2週間は、GBM細胞注射後の初期の2週間の間グリオーマ開始の可視化を防ぐことができます。間伐頭蓋骨頭蓋窓は、GBM細胞注射と毎日のように神経膠腫開始の可視化には適さないレンダリング各イメージングセッション、前に間伐繰り返しが必要です。これとは対照的に、Portsウィンドウは、私たちは脳組織への損傷を最低限に抑え、また、ウィンドウの高分解能イメージング直後作成のパフォーマンスを可能に窓の側からGBM細胞注入を行うことができます。 infファイル神経膠腫開始にormationは、研究のこのタイプのためのオープン頭蓋骨技術上の重要な利点であるGBM細胞注入、後の最初の数週間以内に収集することができる。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ジャクソン研究所がんセンターパイロットグラントとメインがん財団によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
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