Summary
Ved at kombinere en poleret og forstærket tynd-skull (havne) kraniel vindue og glioblastom (GBM) celleinjektion, kan vi observere glioma initiering og vækst fra injicerede GBM celler i hjernen hos en levende mus i længderetningen.
Abstract
Gliom er en af de mest dødelige former for human cancer. Den mest effektive gliom terapi til dato-kirurgi efterfulgt af strålebehandling-tilbyde patienterne kun beskedne fordele, da de fleste patienter ikke overlever mere end fem år efter diagnosen på grund af gliom tilbagefald 1,2. Opdagelsen af cancer stamceller i humane hjernetumorer det lover godt for at have en enorm indflydelse på udviklingen af nye terapeutiske strategier for gliom 3. Cancerstamceller er defineret ved deres evne til både selv forny og til at differentiere, og menes at være de eneste celler i en tumor, der har kapacitet til at initiere nye tumorer 4. Gliom tilbagefald efter strålebehandling menes at hidrøre fra modstand glioma stamceller (GSCS) til behandling 5-10. In vivo er GSCS vist at opholde sig i en perivaskulær niche, der er vigtig for at bevare deres stamcelle-lignende egenskaber 11-14 . Centralt i organining af GSC niche er vaskulære endothelceller 12. Eksisterende tyder på, at GSCS og deres samspil med de vaskulære endothelceller er vigtige for tumor udvikling, og identificere GSCS og deres samspil med endotelceller som vigtige terapeutiske mål for gliom. Tilstedeværelsen af GSCS bestemmes eksperimentelt ved deres evne til at igangsætte nye svulster på orthotopisk transplantation 15. Dette opnås typisk ved at injicere et bestemt antal GBM celler isoleret fra humane tumorer i hjernen på alvorligt immun-deficiente mus, eller af muse-GBM-celler ind i hjernen på kongene værtsmus. Analyser for tumorvækst udføres derefter efter tilstrækkelig tid til at tillade GSCS blandt de injicerede GBM cellerne give anledning til nye tumorer, typisk flere uger eller måneder. Derfor behøver eksisterende analyser ikke kunne undersøges, om den vigtige patologiske proces af tumorinitiering fra enkelte GSCS in vivo. Derfor væsentligt insights i de specifikke roller GSCS og deres samspil med de vaskulære endotelceller i de tidlige stadier af tumor initiering mangler. Sådanne indsigter er afgørende for udvikling af nye terapeutiske strategier for gliom, og vil få store konsekvenser for forebyggelse af gliom tilbagefald hos patienter. Her har vi tilpasset portene craniale vindue procedure 16 og in vivo to-foton mikroskopi for at tillade visualisering af tumorinitiering fra injicerede GBM celler i hjernen af en levende mus. Vores teknik vil bane vejen for fremtidige indsats for at belyse de centrale signaleringsmekanismer mellem GSCS og vaskulære endotelceller i løbet af gliom indvielse.
Protocol
1. Protokol
- Bedøve mus med ketamin og xylazin i en dosis på 0,1 mg ketamin og 0,01 mg xylazin pr 1 g legemsvægt. Carprofen (0,005 mg per 1 g legemsvægt) anvendes til analgesi og administreres præoperativt.
- Alle de kirurgiske værktøjer, herunder den dentale bor, er vanddamp steriliseret i en autoklave. Hvis batch operationer skal udføres, skal spidserne af kirurgiske instrumenter resteriliseres med en glasperle sterilisator (Fine Science Tools FST 250) før hver efterfølgende operation.
- Når musen har nået et kirurgisk plan af anæstesi, vurderet ved manglende svar på en tå pinch, placeres på en vattampon og efterfølgende placeres på en opvarmet pude for at opretholde en legemstemperatur på ~ 37 ° C. Dybden af bedøvelse overvåges hyppigt under operationen.
- Fur fjernes fra den dorsale hovedet i en stort set trekantet område ~ 3 mm caudalt til næseborene og strækker sig caudalt til cervical ryghvirvler. Ophthalmisk salve påføres øjnene for at beskytte dem mod dehydrering og irritation.
- Musen anbringes i ventrale recumbancy og huden desinficeres med kirurgisk iod, 70% ethanol, og sterile vatpinde. 0,8 x 1,0 cm hudlap omfatter den dorsale aspekt af den frontale og parietale knogler i kraniet fjernes under anvendelse af fine sakse.
- En topisk analgetisk, 0,5% lidocain, påføres lokalt til periosteum og de eksponerede væv ved periferien af såret. Periosteum fjernes ved forsigtigt at skrabe kraniet med en skalpel blad, dette vil hjælpe cyanoacrylat lim til at klæbe til knoglen.
- Det kortikale område af interesse er skitseret på kraniet med en markør. Det område af interesse bør ikke placeres i løbet af kranium sutur linjer, for at undgå skader på underliggende store skibe.
- Et tyndt lag af cyanoacrylat-klæbemiddel påføres på sårkanterne, at forhindre udsivning af serosanguinous fluidum, og til skallen undtagen iområdet af interesse.
- Lysaktiveret dentalcement anvendes i vores protokol til forsegling af skallen. Inden anvendelse af dentalcement, er alle udsatte kraniet bortset fra området bestemt til udtynding behandles med primerne, og derefter med bindemidlet fra lysaktiveret dentalcement kit. Når bindemidlet tørres, er lysaktiveret dentalcement anvendes til at dække kraniet. At stabilisere hovedet af musen til efterfølgende kirurgi og billeddannelse, er en steril # 00-90 møtrikken indlejret i dentalcement i en afstand fra det område, der skal fortyndes. Brugen af lysaktiveret dental cement giver os mulighed for at forberede kraniet uden at skulle haste til at afslutte hele proceduren. Når dentalcement præparatet på skallen er afsluttet, dental cement hærdes med synligt lys.
- Efter at dentalcement er hærdet, et hovedstykke holderen fra stereotaktiske anordning monteret på den sekskantede møtrik på musen hovedet under anvendelse af en # 00-90 skrue.
- En drop til stuetemperatur, er 0,9% sterilt saltvand påført på kraniet område, der skal fortyndes. Ved hjælp af et stereomikroskop, er en højhastigheds-mikro-bor anvendt til at fortynde et cirkulært område af kraniet (typisk ~ 4-5 mm i diameter) over området af interesse. Boring og anvendelsen af saltvand til den borede område udføres intermitterende under udtynding procedure for at undgå termisk beskadigelse af underliggende hjernevævet. Saline absorberer varme og hjælper også blødgøre knoglen.
- Musen skull omfatter to tynde lag af kompakt knogle, sandwiching et tykt lag af svampet knogle. Det ydre lag af kompakt knogle og det meste af svampet knogle er fjernet ved hjælp af boret.
- Efter at størstedelen af det svampede knoglevæv nedbrydes, kan de resterende hulrum i den svampede knogle ses under et dissektionsmikroskop, hvilket indikerer, at boringen nærmer det indre kompakte knogle lag. På dette stadium bør kraniet tykkelse stadig være mere end 50 um. Skull udtynding børfortsættes forsigtigt til opnåelse af en meget tynd (~ 20 um) og jævn tilberedning.
- Når den ønskede tykkelse af kraniet er opnået (~ 20 um), er kraniet 1:a poleres med en skræddersyet silicone pisk med diamant pasta (6-15 um) i ca 10 min. Diamanten-paste polering tjener to formål. For det første yderligere thins kraniet uden at påføre tryk på den fortyndede kraniet, hvorved man undgår risiko for skader på underliggende hjernevæv. For det andet tjener som et første poleringstrin for det fortyndede kraniet før den finkornede tinoxid anvendes til yderligere kraniet polering.
- Efter diamant-pasta polering, er det tyndet kraniet poleret med tinoxid i ca 10 min. Når kraniet er poleret, er tinoxid skylles væk med saltvand indtil tyndet kraniet fremstår ren.
- I dette trin, hvis den kraniale vinduet skal anvendes til langsgående in vivo-billeddannelse er det rensede tynde kranium område tørret. En lille dråbe klarcyanoacrylat lim påføres til at tætne den kraniale vinduet. Laget af cyanoacrylat lim mellem den fortyndede kraniet og dækglasset bør være så tynd som muligt.
- Hvis en injektion skal udføres efter frembringelse af en porte kranie vindue på dette trin fremstilles en 26-gauge sprøjte nål, der anvendes til at skabe en lille åbning på den ene side af poleret tynde kranium vinduet. Denne åbning anvendes til GBM celleinjektion.
- En steril glaspipette med en spids åbning omkring 50 um i diameter trækkes anvendelse af en pipette puller. Denne pipette vil blive anvendt til GBM celleinjektion og anbringes på en mikromanipulator. Pipetten er lagt på en 30-graders vinkel, således at den GBM celle injektionsstedet skal være væk fra den endelige imaging site. Spidsen af pipetten fjernes under en dissektion mikroskop. Den GBM cellesuspension er front-loaded ind i pipetten ved sugning under anvendelse af en sprøjtepumpe.
- Når injektionen pipetten er fyldt med GBM celler, er musen flyttet tilbage under the mikroskop. Injektionen pipetten sænkes mod den lille åbning i kranie vinduet og endelig indsat ind i hjernen gennem åbningen ved hjælp af en mikromanipulator. 1 ml af en GBM cellesuspension injiceres i hjernen 100-200 um fra hjernen overflade (hastighed: 0,1 ul / min, varighed: 10 minutter).
- Kraniet tørres, er en lille dråbe klar cyanoacrylat lim påført til det tørrede skallen, og et stykke 3 mm størrelse nr. 1 dækglas er klæbet til den tynde og poleret kraniet område. Rummet mellem dækglasset og tilstødende dentalcement er forseglet med cyanoacrylat-lim.
- Efter operationen er mus injiceret subkutant med 1 ml varm steril saltopløsning og er forsynet med supplerende varme for at opretholde legemstemperatur indtil helt efter anæstesi.
- Til billeddannelse, er mus bedøvet med ketamin og xylazin ved en dosis på 0,1 mg ketamin og 0,01 mg xylazin pr 1 g legemsvægt. Mus er immobiliseret ved hjælp af en brugerdefineret stereotaktisk rammeunder mikroskopet. Hvis gentagne in vivo billeddannelse udføres på daglig basis, vil isofluoran være en bedre løsning, da mus vil vise tegn på afhængighed med gentagen brug af ketamin.
2. Repræsentative resultater
En vellykket porte craniale vindue kirurgi tillader kraniale vinduet forblive klar i uger til måneder. Figur 1 viser vaskulaturen under et porte kranial vindue som visualiseret under anvendelse af tilbagespredt lys. Disse vaskulatur billeder blev brugt som pejlemærker for at lokalisere de samme områder i hjernen for gentagen billeddannelse. For at visualisere både vaskulaturen endotelceller og GBM celler, vi krydsede B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J mus, der mærker vaskulære endotelceller med B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) Hze / J mus, og der genereres mus med vaskulære endotelceller mærket med rødt fluorescerende protein tdTomato. Vi derefter udført havnene kraniotomi proceduren på disse mice, og injiceres GFP-mærkede GBM celler i deres hjerner gennem en lille åbning på siden af en kraniel vindue. Vi derefter udføres in vivo to-foton imaging længderetningen på de injicerede mus. Laseren Excitationsbølgelængden blev sat til 910 nm, hvilket resulterede i excitation af både GFP og tdTomato. To-foton billeddannelse blev udført på en specialbygget to-foton laser-scanning-mikroskop med to detektorer til samtidig grøn / rød fluorescens detektionsevne. Figur 2 viser en in vivo eksempel på glioma initiering fra injicerede GBM celler i nærheden af vaskulaturen. De havne kraniel vindue er også et fremragende valg for kronisk time-lapse in vivo billeddannelse. Figur 3 viser GFAP farvning af kortikale snit fra en mus uden porte kirurgi, en mus 7 dage efter havnene kirurgi, og en mus 7 dage efter HAVNE kirurgi og saltvand injektion. Det fremgår tydeligt af de billeder, som musen uden kirurgi og musen med PORTS kirurgi har ingen gliose, som følge saltvand injektion, gliose observeret i hjernevæv af musen, som følge af pipettere indtrængning og saltvand injektion i hjernen. Dette resultat viser, at gliosis ikke forekommer under havnene kranielle vindue, der giver uafhængig validering, at havnene kraniel vindue beskrives her ikke fører til den gliosis der typisk er forbundet med en "åben skull" kronisk kraniel vindue. Figur 4 viser i høj opløsning billeddannelse af dendritiske Torner fra samme mus på dagen for kirurgi (dag 0) og 32 dage efter havnene vinduet skabelse (dag 32), der påviser, at havnene vinduet er også et fremragende valg for høj opløsning in vivo billeddannelse.
Figur 1. Visualisering af vaskulatur under en poleret og forstærket tyndet kranium kraniel vindue ved hjælp af tilbagespredt lys. Dage repræsenterer t Han antal dage efter operationen, billeder blev taget fra den dag af kirurgi umiddelbart efter afslutningen af GBM celleinjektion. Scale bar:. 0,5 mm Klik her for at se større figur .
Figur 2. Visualisering af injicerede GBM celler og vaskulatur in vivo. Mus, der bærer både Tek-Cre og ROSA26 CAG-tdTomato blev anvendt til GBM celleinjektion. Vaskulære endotelceller blev mærket med tdTomato (rød), og GBM celler blev mærket med GFP (grønt). Billeder blev erhvervet startende 24 timer efter GBM celleinjektion. I alt 10 til 12 tilstødende synsfelter blev udtaget og blev samlet ved siden af hinanden, med de identificerede injicerede GBM cellerne i centrum af det samlede område, til fremstilling af de endelige billeder. Dage angiver antallet af dage efter operationen. Målestok: 100 um.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se større figur.
Figur 3. Gliose ikke forekommer følgende porte kraniel vindue kirurgi. Øvre paneler: musehjerne koronal afsnit under lavere forstørrelse. Venstre panel: en mus uden cranial window kirurgi, ingen GFAP aktivering observeres i hjernevævet. Midterste panel: en mus med et porte craniale vindue genereret på højre side af hjernen, ingen GFAP aktivering observeres i hjernevævet. Højre panel: en mus med en porte kranie vindue og saltvandsindsprøjtning fra siden af portene vinduet. GFAP aktivering observeres på siden af portene vinduet, men ikke på den side af intakt hjernevæv. Målestok: 1 mm. Nederste panel: høj effekt billeder af hjernevæv på områder som angivet i den hvide kasse med de øverste panel billeder. Målestok: 100 um. 
Figur 4. Høj opløsning billeddannelse af dendritiske Torner fra Thy-1 YFPH mus. Billeder blev købt på dagen for havnene kirurgi, og 32 dage efter HAVNE kirurgi. Det fremgår af de billeder, som de fleste spines præsenterer på dag 0 er klart synlige 32 dage følgende porte kirurgi. Målestok: 2 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøglen til en vellykket porte kraniel vindue er udtynding og polering. Det oprindelige udtynding kan udføres hurtigt, bør der udvises omhu for at sikre en ensartet udtynding af kraniet over et stort område. Vi typisk anvende et tyndt lag saltvand til kraniet, og derefter tynde kraniet en passage ad gangen, således at saltopløsningen fordamper kort efter microdrill har passeret over kraniet gang. Dette giver os mulighed for langsomt, men homogent yderligere tynd kraniet. En rolig hånd under mikroskopet er også nøglen. Når skull-udtynding nærmer den tilsigtede tykkelse, vi normalt bruger diamantpasta at polere tyndet kraniet i 10-15 minutter, med efterfølgende polering ved hjælp af tin oxid. Vi finder, at polere den fortyndede kraniet først med diamant pasta giver en bedre polering resultat i almindelighed, og tillader os også at fremme tynd et stort område af kraniet område uden at anvende meget pres på det tyndet kraniet området.
Vi valgte portene cranial vindue snarere end andre almindeligt anvendte kranie vinduer, såsom "open skull" vinduet og "tyndet skull" vinduet, af følgende grunde: Med det åbne kraniet vinduet kraniel vindue sædvanligvis bliver uklar kort tid efter oprettelsen og derefter rydder op på eget inden for de første to uger, kræver således en ventetid på cirka to uger før eventuelle billeddiagnostiske eksperimenter kan udføres. Denne to-ugers ventetid ville forhindre visualisering af glioma indledningen i de første to uger efter GBM celleinjektion. Den tyndet kranium kraniel vindue kræver gentagne udtynding før hver imaging session, hvilket gør det uegnet til GBM celleinjektion og visualisering af gliomer indledningen på en daglig basis. I modsætning hertil muliggør portene vinduet os at udføre GBM celleinjektion fra den side af vinduet, hvilket minimerer skade på hjernevæv, og tillader også udførelse af høj opløsning billeddannelse umiddelbart efter etablering af vinduet. Information på gliom initiering kan indsamles inden for de første par uger efter GBM celle injektion, hvilket er en afgørende fordel over den åbne kraniet teknik for denne type undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af The Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Grant og The Maine Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
- Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
- Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
- Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
- Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
- Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
- Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
- Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
- Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
