Summary
Ao combinar um polido e reforçado crânio-fino (portas) craniana janela e injeção de células do glioblastoma (GBM), podemos observar glioma iniciação e crescimento de células GBM injetadas no cérebro de um rato vivo longitudinalmente.
Abstract
Glioma é a uma das formas mais mortais de cancro humano. A terapia mais eficaz para glioma a data da cirurgia, seguida de radioterapia oferece apenas pacientes benefícios modestos, como a maioria dos pacientes não sobrevivem mais de cinco anos após o diagnóstico, devido à glioma 1,2 recaída. A descoberta de células-tronco cancerosas em tumores cerebrais humanos tem a promessa de ter um enorme impacto sobre o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para glioma 3. As células-tronco cancerosas são definidas pela sua capacidade tanto de se auto-renovar e diferenciar, e acredita-se ser as únicas células em um tumor que têm a capacidade de iniciar novos tumores 4. Glioma recaída radioterapia seguinte é pensado para surgir a partir da resistência de células estaminais de glioma (GSCS) à terapia 5-10. In vivo, GSCS são mostrados a residir num nicho perivascular, que é importante para manter as suas células estaminais características semelhantes a 11-14 . Central para a organizaçãozação do nicho SGC são células endoteliais vasculares 12. Evidências sugerem que o GSCS e sua interação com as células endoteliais vasculares são importantes para o desenvolvimento do tumor e identificar GSCS e sua interação com células endoteliais como importantes alvos terapêuticos para glioma. A presença de GSCS é determinado experimentalmente pela sua capacidade de iniciar novos tumores após transplante ortotópico 15. Isto é normalmente conseguido através da injecção de um número específico de células de GBM isoladas a partir de tumores humanos no cérebro de severamente imunodeficientes ratos, ou de células de rato GBM em cérebros de ratinhos congénicos hospedeiras. Os ensaios para o crescimento do tumor são, em seguida, realizada de acordo com o tempo suficiente para permitir que GSCS entre as células injectadas GBM para dar origem a novos tumores, tipicamente várias semanas ou meses. Assim, os ensaios existentes não permitem a análise do processo patológico de iniciação do tumor de GSCS individuais in vivo. Conseqüentemente, essencial insights para as funções específicas de GSCS e sua interação com as células endoteliais vasculares nos primeiros estágios de iniciação do tumor estão faltando. Tais revelações são críticos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para glioma, e terá grandes implicações para a prevenção de recaídas em pacientes glioma. Aqui nós adaptamos as portas procedimento de janela craniana 16 e in vivo de dois fótons de microscopia para permitir a visualização de iniciação do tumor a partir de células de GBM injetadas no cérebro de um rato vivo. Nossa técnica irá pavimentar o caminho para futuros esforços para elucidar os principais mecanismos de sinalização entre GSCS e células endoteliais vasculares durante o início glioma.
Protocol
1. Protocolo
- Anestesiar o rato com cetamina e xilazina na dose de 0,1 mg de cetamina e 0,01 mg de xilazina por 1 g de peso corporal. Carprofeno (0,005 mg por 1 g de peso corporal) é utilizado para a analgesia e é administrado antes da cirurgia.
- Todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo a broca dental, são esterilizados a vapor em autoclave. Se cirurgias de lote devem ser realizados, as pontas dos instrumentos cirúrgicos devem ser re-esterilizado com uma esfera de vidro esterilizador (Fine Ciência Ferramentas FST 250) antes de cada cirurgia subsequente.
- Uma vez que o rato atingiu um plano cirúrgico de anestesia, avaliada pela ausência de uma resposta a uma pitada dedo do pé, que é colocado sobre uma almofada de algodão, que é então colocado sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo de ~ 37 ° C. A profundidade da anestesia é frequentemente monitorizado durante a cirurgia.
- Pele é removida da cabeça do dorso, em uma área de aproximadamente triangular ~ 3 milímetros caudal para as narinas e estendendo-se caudalmente para as cervical vértebras. Pomada oftálmica é aplicada para os olhos para protegê-los de desidratação e irritação.
- O rato é colocado na recumbancy ventral e a pele é desinfectada com iodo cirúrgico, etanol a 70%, e compressas estéreis. A 0,8 x 1,0 cm aba de pele que cobre a região dorsal dos ossos frontal e parietal do crânio é removida usando tesoura fina.
- Um analgésico tópico, lidocaína a 0,5%, é aplicado localmente ao periósteo e os tecidos expostos na periferia da ferida. O periósteo é removida por raspagem suave do crânio com uma lâmina de bisturi, o que irá ajudar a cola de cianoacrilato para aderir ao osso.
- A área cortical de interesse é delineada no crânio com um marcador. A área de interesse não deve ser localizado por cima das linhas de sutura do crânio, a fim de evitar danos para os grandes vasos subjacentes.
- Uma fina camada de adesivo de cianoacrilato é aplicado às margens da ferida, para impedir a infiltração de fluido serosanguinolento, e ao crânio, excepto ema área de interesse.
- Activado pela luz cimento dentário é utilizado no protocolo para a selagem do crânio. Antes da aplicação do cimento dental, tudo crânio exposta à excepção da área destinada ao desbaste é tratado com os iniciadores e subsequentemente com o agente de ligação do kit de cimento activado pela luz dental. Uma vez que o agente de ligação é seco, o cimento dental activado pela luz é aplicado para cobrir o crânio. Para estabilizar a cabeça do rato para cirurgia posterior e de imagem, uma porca hexagonal de estéril # 00-90 está incorporado no cimento dentário a uma distância da área a ser diluído. O uso da luz ativado cimento dental permite-nos preparar o crânio, sem ter que se apressar para terminar todo o procedimento. Uma vez que a preparação do cimento dental no crânio é completada, o cimento dentário é curado com luz visível.
- Após o cimento dentário é curado, um suporte do dispositivo de capacete estereotáxica é montada na porca hexagonal na cabeça do rato utilizando um parafuso # 00-90.
- A drop da temperatura ambiente, 0,9% de solução salina estéril é aplicada à área do crânio para ser diluído. Com o auxílio de um estereomicroscópio, uma broca de alta velocidade de micro-é utilizado para diluir uma área circular do crânio (tipicamente 4-5 mm ~ de diâmetro) através da região de interesse. Perfuração e a aplicação de uma solução salina para a área perfurada são realizados de forma intermitente durante o procedimento de desbaste para evitar lesão térmica do tecido cerebral subjacente. Salina absorve o calor e também ajuda a amaciar o osso.
- O crânio do rato compreende duas camadas finas de osso compacto, imprensando uma espessa camada de osso esponjoso. A camada externa de osso compacto e a maior parte do osso esponjoso são removidos com um berbequim.
- Depois de a maior parte do osso esponjoso é removida, as cavidades remanescentes dentro do osso esponjoso pode ser vista sob um microscópio de dissecação, o que indica que se aproxima a perfuração da camada interna do osso compacto. Nesta fase, a espessura crânio deve ainda ser mais do que 50 um. Crânio de desbaste deve sercontinuou com cuidado para se obter uma preparação muito fina (~ 20 mm) e liso.
- Uma vez que a espessura desejada do crânio é atingida (~ 20 mm), o crânio é primeiramente polida usando um chicote de silicone feito por medida com pasta de diamante (6-15 mm) para cerca de 10 min. O polimento de diamantes colar serve a dois propósitos. Primeiro, ele ainda dilui o crânio, sem a aplicação de pressão sobre o crânio diluído, evitando danos acidentais no tecido cerebral subjacente. Em segundo lugar, serve como um passo inicial para o polimento do crânio diluído antes do óxido de estanho de grão fino é utilizado para o polimento crânio adicional.
- Seguindo o polimento pasta de diamante, o crânio diluído é polido com óxido de estanho por aproximadamente 10 min. Uma vez que o crânio é polido, o óxido de estanho é lavada com solução salina fora do crânio até diluído aparece limpo.
- Neste passo, se a janela craniana é para ser utilizado para imagem in vivo longitudinal, a área limpa crânio fino é seco. Uma pequena gota de claracola de cianoacrilato é aplicado a vedar a janela craniana. A camada de cola de cianoacrilato entre o crânio e diluído a lamela deverá ser tão fino quanto possível.
- Se uma injecção está a ser realizado após a criação de uma janela craniana portos, neste passo, uma agulha de seringa de calibre 26 é usado para criar uma pequena abertura de um lado da janela do crânio fino polido. Esta abertura é utilizada para a injecção das células de GBM.
- Uma pipeta de vidro esterilizada com uma ponta de abertura de cerca de 50 um de diâmetro, é puxada através de um extractor de pipeta. Esta pipeta será usado para a injecção de células de GBM, e é carregado em um micromanipulador. A pipeta é carregado com um ângulo de 30 graus de modo que o local da injecção das células será GBM para longe do local de imagem final. A ponta da pipeta é removida sob um microscópio de dissecação. A suspensão de células de GBM é concentrada na fase inicial para a pipeta por sucção através de uma bomba de seringa.
- Uma vez que a pipeta de injeção é carregado com células GBM, o mouse é movido para trás em pomicroscópio e. A pipeta de injecção é reduzida para a pequena abertura na janela craniana e, finalmente, inserido no cérebro através da abertura usando um micromanipulador. 1 ul de uma suspensão de células de GBM é injectado no cérebro 100-200 ^ M a partir da superfície do cérebro (velocidade: 0,1 ul / min, a duração: 10 min).
- O crânio é seco, uma pequena gota de cola de cianoacrilato claro é aplicado ao crânio seco, e uma peça de 3 mm de tamanho # 1 lamela é aderida à superfície do crânio fino e polido. O espaço entre as lamelas e cimento dental adjacente é selada com cola de cianoacrilato.
- Após a cirurgia, o rato é injectado subcutaneamente com 1 ml de solução salina estéril quente e provido de calor suplementar para manter a temperatura corporal até totalmente recuperado da anestesia.
- Para imagiologia, os ratos são anestesiados com cetamina e xilazina na dose de 0,1 mg de cetamina e 0,01 mg de xilazina por 1 g de peso corporal. Ratos são imobilizadas utilizando uma moldura estereotáxica personalizadosob o microscópio. Se repetitivo imagem in vivo é realizada em base diária, isofluorano vai ser uma opção melhor, como os ratos mostram sinais de dependência com o uso repetitivo da cetamina.
2. Resultados representativos
Um sucesso portos cirurgia craniana janela permite que a janela craniana permanecer claro durante semanas a meses. Figura 1 mostra a vasculatura debaixo de uma janela Portas craniana como visualizado utilizando luz retroespalhados. Estas imagens vasculatura foram usados como pontos de referência para localizar as mesmas áreas do cérebro para imagens repetitivo. Para visualizar tanto as células endoteliais e células vasculatura GBM, atravessamos a B6.Cg-Tg (Tek-CRE) 1Ywa / J mouse, que rotula células endoteliais vasculares com o B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato ) HZE / J rato e ratos gerados com células endoteliais vasculares relacionados com a tdTomato proteína fluorescente vermelha. Em seguida, realizou o procedimento de craniotomia portas nestes milhasce, e injectado GFP marcadas com células de GBM em seus cérebros através de uma pequena abertura no lado de uma janela craniana. Procedeu-se então in vivo de dois fotões imaging longitudinalmente sobre os ratos injectados. O comprimento de onda de excitação de laser foi de 910 nm, o que resultou na excitação de GFP e tdTomato ambos. Dois fótons de imagem foi realizada num construído sob encomenda de dois fotões microscópio de varredura a laser com dois detectores para a capacidade de detecção simultânea verde / vermelho de fluorescência. Figura 2 mostra um exemplo em vivo de iniciação a partir de células de glioma de GBM injetados perto da vasculatura. A janela Portas craniana também é uma excelente opção para crônica lapso de tempo em imagem in vivo. Figura 3 mostra coloração GFAP de seções corticais de um mouse sem cirurgia portas, um rato 7 dias após a cirurgia portos, e um rato 7 dias após a cirurgia portos e injecção de solução salina. É evidente a partir das imagens que o mouse sem cirurgia e do rato com PORTS cirurgia não tem gliose, enquanto que após a injecção de soro fisiológico, gliose é observada no tecido do cérebro do rato, devido ao pipetar penetração e injecção de soro fisiológico no cérebro. Este resultado demonstra que gliose não ocorre sob a janela Portas craniana, proporcionando validação independente de que as portas janela craniana descritos aqui não levar à gliose que é tipicamente associada com um "crânio aberto" janela crônica craniano. Figura 4 mostra de alta resolução imagem de espinhas dendríticas do mesmo mouse no dia da cirurgia (dia 0) e 32 dias após a criação da janela Portos (dia 32), demonstrando que a janela de portas também é uma excelente opção para alta resolução de imagem in vivo.
Figura 1. Visualização dos vasos sob uma janela crânio polido e reforçado diluído craniana usando luz retroespalhados. Dias representam t ele o número de dias após a cirurgia, e as imagens foram tiradas com início no dia da cirurgia, imediatamente após a conclusão do GBM injecção das células. Barra de escala:. 0,5 milímetros Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Visualização de células injectadas GBM e vasculatura in vivo. Camundongos portadores tanto Tek-Cre e Rosa26 CAG-tdTomato foram usados para injeção de células GBM. As células endoteliais vasculares foram marcadas com tdTomato (vermelho), e as células foram marcadas com GBM GFP (verde). As imagens foram adquiridas começando 24 horas após a injecção das células de GBM. Um total de 10-12 campos adjacentes de vista foram colhidas e foram montadas adjacentes uma à outra, com as células identificadas GBM injectadas no centro do campo total, para produzir as imagens finais. Dias representam o número de dias após a cirurgia. Barra de escala: 100 m.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 3. Gliose não ocorrer após a cirurgia portas janela craniano. Painéis superiores: seção Rato cérebro coronal em baixa ampliação. Painel esquerdo: um rato sem qualquer cirurgia janela craniana; nenhuma activação GFAP é observado no tecido cerebral. Painel do meio: um rato com uma janela craniana portos gerado no lado direito do cérebro, sem activação GFAP é observado no tecido cerebral. Painel da direita: um mouse com uma janela Portas craniano e injeção de solução salina do lado da janela Portas. Activação GFAP é observado do lado da janela portas, mas não sobre o lado do tecido do cérebro intacto. Barra de escala: 1 mm. Painel inferior: maior potência imagens dos tecidos cerebrais em áreas como indicado na caixa em branco das imagens superior do painel. Barra de escala: 100 m. 
Figura 4. Imagens de alta resolução de espinhos dendríticos de Thy-1 ratos YFPH. As imagens foram adquiridas no dia da cirurgia portos, e 32 dias após a cirurgia portas. É evidente a partir das imagens que a maioria dos espinhos apresentam no dia 0 são claramente visíveis 32 dias após a cirurgia portas. Barra de escala: 2 m.
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Discussion
A chave para uma janela portuária craniana é o desbaste e polimento. Enquanto o desbaste inicial pode ser realizada rapidamente, deve ser tomado cuidado para assegurar homogeneidade adelgaçamento do crânio sobre uma grande área. Nós tipicamente aplicar uma camada fina de solução salina ao crânio, e depois dilua o crânio uma passagem de cada vez, de tal modo que a solução salina se evapora logo após a microdrill passou sobre o crânio de uma só vez. Isto permite-nos lentamente, mas de forma homogênea mais fina do crânio. A mão firme sob o microscópio também é fundamental. Uma vez crânio-desbaste se aproxima a espessura pretendida, normalmente usamos pasta de diamante para polir o crânio diluído por 10-15 minutos, com polimento subsequente usando óxido de estanho. Nós descobrimos que o polimento do crânio diluída primeiro com pasta de diamante produz um resultado melhor polimento em geral, e também nos permite promover uma fina superfície de grande área do crânio, sem a aplicação de pressão sobre a área muito diluído crânio.
Nós escolhemos o cr portasanial janela em vez de outros vulgarmente utilizados janelas cranianas, tais como a "caveira aberta" janela e o "diluído crânio" janela, pelas seguintes razões: Com a janela de crânio aberta, a janela craniana geralmente torna-se turva logo após a criação e, em seguida, elimina-se por si própria dentro das primeiras duas semanas, o que requer um período de espera de cerca de duas semanas antes de todas as experiências de imagiologia pode ser realizado. Esta semana dois período de espera poderia impedir a visualização de iniciação glioma durante as primeiras duas semanas após a injeção de células GBM. A janela crânio diluído craniana repetitiva requer diluição antes de cada sessão de imagem, o que o torna inadequado para injecção de células de GBM e visualização de iniciação glioma, numa base diária. Em contraste, a janela de portos nos permite realizar a injecção das células de GBM a partir do lado da janela, o que minimiza os danos para o tecido cerebral, e também permite o desempenho de alta resolução de criação de imagem imediatamente a seguir da janela. Informação em glioma iniciação pode ser coletado dentro das primeiras semanas após a injeção de células GBM, o que é uma vantagem importante sobre a técnica de crânio aberto para este tipo de estudos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo Laboratório Jackson Câncer Piloto Centro Grant e The Maine Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
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