Summary
Durch die Kombination aus poliertem und verstärkte Dünnschicht-Schädel (Ports) cranial Fenster und Glioblastom (GBM) Zellinjektion können wir beobachten, Gliom Initiierung und Wachstum aus injiziert GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus Längsrichtung.
Abstract
Gliom ist das eine der tödlichsten Formen von Krebs beim Menschen. Die effektivste Gliom Therapie date-Operation durch Strahlung gefolgt Behandlungs-Patienten bietet nur bescheidene Vorteile, da die meisten Patienten nicht überleben länger als fünf Jahre nach der Diagnose aufgrund Gliom Rückfall 1,2. Die Entdeckung von Krebsstammzellen in menschlichen Hirntumoren hält Versprechen für einen enormen Einfluss auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für Gliome 3. Krebsstammzellen sind durch ihre Fähigkeit sowohl sich selbst zu erneuern und zu differenzieren definiert und sind gedacht, um die einzigen Zellen in einem Tumor, der die Fähigkeit zur Initiierung neuen Tumoren 4 verfügen. Gliom Rezidiv nach Strahlentherapie wird angenommen, dass aus dem Widerstand von Gliomen Stammzellen (GSCs) auf die Therapie ergeben 5-10. In vivo werden GSCs gezeigt, dass in einer perivaskulären Nische, die wichtig ist für den Erhalt ihrer Stammzell-ähnliche Eigenschaften 11-14 befinden . Zentral für die Organisationsierung der GSC Nische vaskulären Endothelzellen 12. Hinweise darauf, dass bestehende GSCs und deren Wechselwirkung mit den vaskulären endothelialen Zellen wichtig sind für die Tumorentwicklung und identifizieren GSCs und ihre Wechselwirkung mit Endothelzellen als wichtige therapeutische Ziele für Gliom. Die Anwesenheit von GSCs wird experimentell durch ihre Fähigkeit, neue Tumoren nach orthotopen Transplantation 15 einzuleiten bestimmt. Dies wird typischerweise durch Einspritzen einer bestimmten Anzahl von GBM Zellen aus menschlichen Tumoren in die Gehirne von stark immuno-defizienten Mäusen oder von Maus-GBM-Zellen in die Gehirne von Mäusen isoliert kongenen Host erreicht. Assays für das Tumorwachstum werden dann nach einer ausreichenden Zeit, damit GSCs unter den injiziert GBM Zellen zu neuen Tumoren-Regel mehrere Wochen oder Monate zu ergeben. Daher müssen bestehende Assays nicht zulassen Prüfung der wichtigsten pathologischen Prozess der Tumorinitiation von einzelnen GSCs in vivo. Folglich wesentliche insights in die spezifischen Aufgaben der GSCs und deren Interaktion mit den vaskulären Endothelzellen in den frühen Stadien der Tumorinitiation fehlen. Solche Einblicke sind entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Gliome und wird große Auswirkungen zu verhindern Gliom Rückfall in Patienten haben. Hier haben wir angepasst den Häfen kranialen Fenster-Prozedur 16 und in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Visualisierung des Tumors Einweihung von injizierten GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus ermöglichen. Unsere Technik wird den Weg ebnen für zukünftige Bemühungen um die wichtigsten Signal-Mechanismen zwischen GSCs und vaskuläre Endothelzellen während Gliom Einleitung aufzuklären.
Protocol
Ein. Protokoll
- Anästhesieren die Maus mit Ketamin und Xylazin in einer Dosis von 0,1 mg Ketamin und 0,01 mg Xylazin pro 1 g Körpergewicht. Carprofen (0,005 mg pro 1 g Körpergewicht) wird zur Analgesie verwendet und wird präoperativ verabreicht.
- Alle der chirurgischen Instrumente einschließlich des dentalen Bohrers, sind Dampf in einem Autoklaven sterilisiert. Wenn Batch Operationen durchgeführt werden sollen, müssen die Spitzen der chirurgischen Instrumente mit einer Glasperle Sterilisator (Fine Science Tools FST 250) werden vor jeder erneuten Operation erneut sterilisiert.
- Sobald die Maus eine chirurgische Ebene der Anästhesie, durch Fehlen einer Antwort auf eine Zehe Pinch beurteilt erreicht hat, wird es auf einem Wattebausch, die dann auf einem Heizkissen gelegt, um eine Körpertemperatur von ~ 37 ° C zu halten platziert Die Tiefe der Anästhesie wird häufig während der Operation überwacht.
- Fell ist aus dem dorsalen Kopf in einer etwa dreieckigen Bereich ~ 3 mm kaudal der Nase entfernt und erstreckt kaudal des cervical Wirbel. Augensalbe wird die Augen aufgetragen, um sie vor dem Austrocknen und Irritationen zu schützen.
- Die Maus wird in ventralen recumbancy gelegt und die Haut wird mit chirurgischen Jod, 70% Ethanol, und sterile Tupfer desinfiziert. Ein 0,8 x 1,0 cm Hautlappen für den dorsalen Aspekt der frontalen und parietalen Knochen des Schädels entfernt mit einer feinen Schere.
- Topische analgetische, 0,5% Lidocain, lokal an der Knochenhaut und den freiliegenden Gewebe am Umfang der Wunde aufgebracht wird. Das Periost wird durch leichtes Kratzen der Schädel mit einem Skalpell entfernt, dies wird die Sekundenkleber an den Knochen haften helfen.
- Die kortikalen Bereich von Interesse auf dem Schädel mit einem Marker beschrieben. Das Gebiet von Interesse sollte nicht über Schädel Nahtlinien liegen, um Schäden an zugrunde liegenden großen Gefäße zu vermeiden.
- Eine dünne Schicht aus Cyanacrylat-Klebstoff wird auf die Wundränder aufgebracht, um das Einsickern von serosanguinous Fluids zu verhindern, und der Schädel ausgenommender Bereich von Interesse.
- Lichtaktivierten Dentalzement ist in unserem Protokoll zum Abdichten des Schädels eingesetzt. Vor dem Aufbringen der Dentalzement werden alle freiliegenden Schädels mit Ausnahme des Bereichs zum Verdünnen mit den Primern bestimmt und anschliessend mit dem Bindemittel aus der lichtaktivierten Dentalzement Kits behandelt. Sobald das Bindemittel getrocknet, das lichtaktivierte Dentalzement angelegt, um den Schädel bedecken. Um den Kopf der Maus für die nachfolgende Operation und Bildgebung zu stabilisieren, wird eine sterile # 00-90 Mutter in die Zahnzement in einem Abstand von dem Bereich verdünnt werden eingebettet. Der Einsatz von Licht-aktivierte Zahnzement ermöglicht es uns, den Schädel, ohne zu hetzen, um den gesamten Vorgang zu beenden vorzubereiten. Sobald die zahnärztliche Zement-Zubereitung am Schädel abgeschlossen ist, wird die zahnärztliche Zement mit sichtbarem Licht ausgehärtet werden.
- Nachdem die zahnärztliche Zement ausgehärtet ist, wird ein Halter aus dem Kopfstück stereotaktischen Gerät zum Sechskantmutter an der Maus Kopf unter Verwendung eines # 00-90 Schraube montiert.
- A drop Raumtemperaturlagerung, wird 0,9% steriler Kochsalzlösung zum Schädel Bereich verdünnbar aufgebracht. Mit Hilfe eines Stereomikroskops, wird eine Hochgeschwindigkeits-Mikro-Bohrer verwendet werden, um eine kreisförmige Fläche des Schädels (typischerweise ~ 4-5 mm Durchmesser) über den Bereich von Interesse zu verdünnen. Bohr und die Anwendung von Kochsalzlösung zu dem gebohrten Gebiet intermittierend während der Ausdünnung Verfahren durchgeführt, um thermische Schädigung der darunterliegenden cerebralen Gewebe zu vermeiden. Saline Wärme absorbiert und hilft auch erweichen die Knochen.
- Die Maus Schädel besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen, zwischen denen eine dicke Schicht von Spongiosa. Die äußere Schicht aus kompaktem Knochen und die meisten der Spongiosa entfernt werden mit dem Bohrer.
- Nachdem der größte Teil der Spongiosa entfernt wird, können die verbleibenden Hohlräume innerhalb des schwammigen Knochen unter einem Präpariermikroskop gesehen werden, was darauf hinweist, dass die Bohrungen nähert sich der interne kompakten Knochen Schicht. In diesem Stadium sollte Schädel Dicke noch mehr als 50 um betragen. Schädel Ausdünnung sollteweiterhin genau, um eine sehr dünne (~ 20 um) und glatte Zubereitung zu erhalten.
- Sobald die gewünschte Dicke des Schädels erreicht wird (~ 20 Mikrometer), wird der Schädel ersten poliert mit eine maßgeschneiderte Silikon-Peitsche mit Diamantpaste (6-15 um) für ca. 10 min. Der Diamant-Paste Polieren dient zwei Zwecken. Erstens ist es weiter verdünnt das Schädel ohne Ausüben von Druck auf den verdünnten Schädels, wodurch zufällige Beschädigung des darunter liegenden Hirngewebe. Zweitens dient sie als Anfangswert Polierschritt für die ausgedünnten Schädels bevor das feinkörnige Zinnoxid zur weiteren Schädel Polieren verwendet wird.
- Nach der Diamant-Paste Polieren wird die ausgedünnten Schädel mit Zinnoxid für etwa 10 min poliert. Nachdem der Schädel ist poliert, die Zinn-Oxid weg mit Kochsalzlösung gespült, bis die ausgedünnten Schädels scheint sauber.
- Bei diesem Schritt, wenn der craniale Fenster ist, um in Längsrichtung in vivo-Bildgebung verwendet werden, wird das gereinigte dünnen Schädelbereich getrocknet. Ein kleiner Tropfen klarerCyanoacrylat Kleber aufgebracht wird, um den kranialen Fenster abzudichten. Die Schicht aus Sekundenkleber zwischen dem Schädel und dem ausgedünnten Deckplättchens sollte so dünn wie möglich.
- Wenn eine Einspritzung nach Erstellung eines Ports kranialen Fensters ausgeführt werden, in diesem Schritt wird eine 26-Gauge-Nadel Spritze verwendet, um eine kleine Öffnung auf einer Seite des polierten dünnen Schädel-Fenster zu erzeugen. Diese Öffnung ist für GBM Zellinjektion verwendet.
- Ein steriler Glaspipette mit einer Bahnöffnung etwa 50 um im Durchmesser gezogen wird mit einer Pipette abziehen. Diese Pipette für GBM Zellinjektion verwendet werden, und wird auf eine Mikromanipulator geladen. Die Pipette wird in einem 30-Grad-Winkel, so dass die GBM Zellinjektion Website wird von der endgültigen Imaging Website geladen. Die Spitze der Pipette unter einem Dissektionsmikroskop entfernt. Der GBM Zellsuspension Front-loaded in die Pipette durch Ansaugen mit Hilfe einer Spritzenpumpe.
- Sobald die Injektionspipette mit GBM Zellen geladen wird, wird die Maus wieder unter th verschobene Mikroskop. Die Injektionspipette in Richtung der kleinen Öffnung in der kranialen Fenster abgesenkt und schließlich in das Gehirn durch die Öffnung mit einem Mikromanipulator eingesetzt. 1 ul einer GBM Zellsuspension wird in das Gehirn 100-200 um aus dem Gehirn Oberfläche (: 0,1 ul / min, Dauer: 10 min Geschwindigkeit) injiziert.
- Der Schädel getrocknet wird, wird ein kleiner Tropfen klare Sekundenkleber auf das getrocknete Schädels angelegt wird, und ein Stück von 3 mm Größe Nr. 1 Deckglas an dem dünnen und poliert Schädelbereich haftet. Der Raum zwischen dem Deckglas und benachbart Dentalzement ist mit Sekundenkleber abgedichtet.
- Nach der Operation wird die Maus subkutan mit 1 ml warmem sterilen Kochsalzlösung injiziert und mit zusätzlicher Hitze, um die Körpertemperatur zu halten, bis sie vollständig aus der Narkose zurückgewonnen.
- Zum Abbilden sind Mäuse mit Ketamin und Xylazin in einer Dosierung von 0,1 mg Ketamin und 0,01 mg Xylazin pro 1 g Körpergewicht. Mäuse immobilisiert sind mit einem benutzerdefinierten stereotaktischen Rahmenunter dem Mikroskop. Wenn wiederholte in-vivo-Bildgebung auf täglicher Basis durchgeführt wird, werden Isofluoran eine bessere Option sein, da Mäuse Anzeichen von Abhängigkeit mit dem serienmäßigen Einsatz von Ketamin zu zeigen.
2. Repräsentative Ergebnisse
Eine erfolgreiche Ports kranialen Fensters Chirurgie erlaubt die kraniale Fenster frei bleiben für Wochen bis Monate. Abbildung 1 zeigt das Gefäßsystem unter einer Ports kranialen Fenster visualisiert rückgestreuten Lichts. Diese Gefäße Bilder wurden als Landmarken für die Lokalisierung der gleichen Hirnareale für sich wiederholende Bildgebung verwendet. Um sowohl die Blutgefäße Endothelzellen und GBM-Zellen visualisieren, überquerten wir die B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J-Maus, die vaskulären Endothelzellen mit Etiketten versieht, B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) HZE / J-Maus und erzeugten Mäuse mit vaskulären Endothelzellen mit dem roten fluoreszierenden Protein tdTomato beschriftet. Wir haben dann durchgeführt den Häfen Kraniotomie Verfahren auf diese mice und GFP-markierten GBM Zellen ins Gehirn injiziert durch eine kleine Öffnung auf der Seite eines Schädel-Fenster. Wir haben dann in vivo durchgeführt Zwei-Photonen-Imaging in Längsrichtung auf den injizierten Mäusen. Der Laser wurde Anregungswellenlänge bei 910 nm, die bei der Erregung von sowohl GFP und tdTomato Folge eingestellt. Zwei-Photonen-Imaging wurde auf einem custom-built Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop mit zwei Detektoren für die gleichzeitige grün / rot Fluoreszenzdetektion Fähigkeit durchgeführt. Abbildung 2 zeigt eine in vivo Beispiel Gliom Einweihung von injiziert GBM-Zellen in der Nähe des Gefäßsystems. Die Ports kranialen Fenster ist auch eine ausgezeichnete Wahl für chronische Zeitraffer in vivo-Bildgebung. Abbildung 3 zeigt GFAP Färbung der kortikalen Bereiche von einer Maus ohne Anschlüsse Chirurgie, eine Maus 7 Tage folgende Ports Chirurgie, und eine Maus 7 Tage folgende Ports Chirurgie und Injektion von Kochsalzlösung. Es ist aus den Bildern, dass die Maus ohne Operation und der Maus mit PoR evidentTS Operation nicht Gliose, wohingegen nach Kochsalzinjektion Gliose im Hirngewebe der Maus beobachtet wird, durch Eindringen und Kochsalzinjektion im Gehirn pipettieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass Gliose nicht unter den Häfen kranialen Fensters auftreten, unabhängige Bestätigung dafür, dass die Ports kranialen Fensters hier beschriebenen nicht der Gliose, die typischerweise mit einer "offenen Schädel" chronische kranialen Fensters verbunden führen. Abbildung 4 zeigt hochauflösende Bildgebung von dendritischen Dornen aus der gleichen Maus auf den Tag der Operation (Tag 0) und 32 Tage nach der Ports Fenster Schöpfung (Tag 32), die zeigen, dass die Ports-Fenster ist auch eine ausgezeichnete Wahl für hochauflösende in vivo-Bildgebung.
Abbildung 1. Visualisierung von Gefäßen unter einem polierten und verstärkte ausgedünnt Schädel Schädel Fenster mit rückgestreuten Lichts. Tage stellen t Er Anzahl von Tagen nach der Operation; Aufnahmen wurden beginnend mit dem Tag der Operation unmittelbar nach Abschluss der GBM Zellinjektion. Maßstab:. 0,5 mm Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Visualisierung injiziert GBM Zellen und Gefäße in vivo. Mäuse, die sowohl Tek-Cre und ROSA26 CAG-tdTomato wurden für GBM Zellinjektion verwendet. Vaskulären Endothelzellen wurden mit tdTomato (rot) markiert, und GBM-Zellen wurden mit GFP (grün) bezeichnet. Die Bilder wurden beginnend 24 Stunden nach GBM Zellinjektion. Eine Gesamtzahl von 10 bis 12 benachbarten Sichtfelder wurden entnommen und benachbart zusammengebaut, um einander mit den identifizierten injiziert GBM Zellen in der Mitte des gesamten Feldes, um die endgültigen Bilder zu erzeugen. Tage stehen für die Anzahl der Tage nach der Operation. Maßstab: 100 um.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Gliose nicht folgende Ports kranialen Fensters Operation auftreten. Obere Platten: Mouse Gehirn koronalen Abschnitt unter geringer Vergrößerung. Linkes Feld: eine Maus ohne kranialen Fensters Operation, keine GFAP Aktivierung im Hirngewebe beobachtet. Mitte: eine Maus mit einem Anschlüsse kranialen Fenster auf der rechten Seite des Gehirns erzeugt werden, keine GFAP Aktivierung im Hirngewebe beobachtet. Rechts: eine Maus mit einem Anschlüsse kranialen Fenster und Injektion von Kochsalzlösung aus der Seite der Anschlüsse Fenster. GFAP-Aktivierung auf der Seite des Ports Fenster beobachtet, aber nicht auf der Seite des intakten Hirngewebe. Maßstab: 1 mm. Unten: höherer Leistung Bilder von Hirngewebe in Bereichen wie in das weiße Feld der oberen Panel-Bilder angezeigt. Maßstab: 100 um. 
Abbildung 4. High-resolution imaging von dendritischen Dornen von Thy-1 YFPH Mäusen. Bilder wurden am Tag der Operation Ports erworben, und 32 Tage nach der Operation Ports. Es ist offensichtlich, von den Bildern, dass die meisten Stacheln präsentieren am Tag 0 deutlich sichtbar 32 Tage folgende Ports Operation sind. Maßstab: 2 um.
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Discussion
Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Ports kranialen Fensters ist die Ausdünnung und Polieren. Während der anfänglichen Verdünnung schnell durchgeführt werden kann, sollte darauf geachtet werden, homogene Ausdünnung des Schädels großflächig werden. Wir typischerweise eine dünne Schicht von Kochsalzlösung am Schädel und dann dünn der Schädel einem Durchlauf zu einem Zeitpunkt, so daß die Salzlösung verdampft kurz nachdem der Mikrobohrers hat über dem Schädel einmal durchlaufen. Dies ermöglicht uns, langsam aber homogen weiteren dünnen Schädel. Eine ruhige Hand unter dem Mikroskop ist auch der Schlüssel. Sobald Schädel-Ausdünnung nähert sich dem beabsichtigten Dicke, die wir normalerweise benutzen Diamantpaste die ausgedünnt Schädel für 10-15 min zu polieren, mit anschließender Politur mit Zinnoxid. Wir finden, dass das Polieren des ausgedünnten Schädel zuerst mit Diamantpaste ergibt eine bessere Polierergebnis im allgemeinen und erlaubt uns auch dünne einen großen Bereich des Schädels Raum ohne Aufbringen viel Druck auf den verdünnten Schädelbereich fördern.
Wir wählten den Häfen cranial Fenster anstatt anderen häufig verwendeten kranialen Fenster, wie der "offenen Schädel"-Fenster und der "ausgedünnt skull"-Fenster, aus den folgenden Gründen: Mit dem offenen Schädel-Fenster, das kraniale Fenster in der Regel wird kurz nach dem Erzeugen bewölkt und löscht dann bis auf eigene innerhalb der ersten zwei Wochen, damit die eine Wartezeit von etwa zwei Wochen, bevor irgendwelche Imaging-Experimente durchgeführt werden können. Diese zweiwöchige Wartezeit würde Visualisierung von Gliom Zündung während der ersten zwei Wochen nach der GBM Zellinjektion verhindern. Der verdünnte Schädels kranialen Fenster erfordert wiederholende Ausdünnung vor jedem Bildgebungssitzung, die es ungeeignet für GBM Zellinjektion und Visualisierung von Gliom Initiierung täglich rendert. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Ports window uns GBM Zellinjektion von der Seite des Fensters, die Schäden minimiert, um das Gehirngewebe, und ermöglicht auch die Leistung der hochauflösenden Bildgebung unmittelbar nach Erstellung der Fenster ausführen. Informationen auf Gliom Initiierung kann innerhalb der ersten Wochen nach der GBM Zellinjektion, die einen wesentlichen Vorteil gegenüber dem offenen Schädel-Technik für diese Art von Untersuchungen ist gesammelt werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von The Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Grant und The Maine Cancer Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
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