הדמית Glioma ייזום Published: November 20, 2012 doi: 10.3791/4201

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Lifeng Zhang*¹, Andree Lapierre*¹, Brittany Roy¹, Maili Lim¹, Jennifer Zhu¹, Wei Wang¹, Stephen B. Sampson¹, Kyuson Yun¹, Bonnie Lyons¹, Yun Li¹, Da-Ting Lin¹

¹The Jackson Laboratory

* These authors contributed equally

Summary

על ידי שילוב של-גולגולת דקה מלוטשת ומחוזקת (יציאות) גולגולתי חלון והזרקת גליובלסטומה (GBM) תא, אנו יכולים לצפות בייזום וצמיחה מתאים מוזרקים GBM במוח של עכבר חי longitudinally גליומה.

Abstract

Glioma הוא אחת הצורות הקטלניות ביותר של הסרטן אנושי. הטיפול היעיל ביותר לגליומה מועד ניתוח ואחריו קרינת הטיפול מציע למטופלים רק יתרונות צנועים, כמו רוב החולים אינם שורד יותר מחמש שנים לאחר אבחון בשל ^1,2 ההישנות גליומה. הגילוי של תאי גזע סרטני בגידולים במוח אדם טומן בחובו הבטחה לבעל השפעה עצומה על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לגליומה ^3. תאי גזע סרטני מוגדרים על ידי היכולת שלהם הוא לעצמי לחדש ולבדל, ונחשבים לתאים היחידים בגידול שיש להם את היכולת ליזום גידולים חדשים ^4. ההקרנות הבאות glioma ההישנות היא חשבה שהוא נובע מהתנגדות של תאי גזע glioma (GSCs) לטיפול ^5-10. בחי, GSCs מוצגים להתגורר בנישת perivascular שהיא חשוב לשמירה על מאפייני גזעם תאים כמו ^11-14 . מרכז לאורגניאספקת מפעלי של נישת GSC הן תאי אנדותל כלי דם ^12. ראיות מצביעות על כך שקיימים GSCs והאינטראקציה שלהם עם תאי אנדותל כלי הדם חשובים להתפתחות גידולים, ולזהות GSCs והאינטראקציה שלהם עם תאי האנדותל כמטרות טיפוליות חשובות עבור גליומה. הנוכחות של GSCs נקבעה באופן ניסיוני על ידי היכולת שלהם ליזום גידולים חדשים על ¹⁵ השתלת orthotopic. זו מושגת בדרך כלל על ידי הזרקת מספר מסוים של תאי GBM שבודדו מגידולים אנושיים לתוך מוחם של עכברים קשות חיסוניים לקויים, או של תאי GBM עכבר למוחם של עכברים מארחים congenic. מבחנים לצמיחת גידול לאחר מכן, בוצעו לאחר זמן מספיק כדי לאפשר GSCs בין תאי GBM הזריקו להצמיח גידולים-בדרך כלל כמה שבועות או חודשים חדשים. לפיכך, מבחנים קיימים אינם מאפשרים בחינה של התהליך הפתולוגי החשוב של חניכת גידול מGSCs הבודד in vivo. כתוצאה מכך, החיוניnsights לתפקידים הספציפיים של GSCs והאינטראקציה שלהם עם תאי אנדותל כלי דם בשלבים המוקדמים של ייזום גידול חסר. תובנה אלה הן קריטיות לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לגליומה, ותהיינה לה השלכות רבות למניעת הישנות גליומה בחולים. כאן יש להתאים את יציאות הליך חלון גולגולתי ¹⁶ ו in vivo שני הפוטונים מיקרוסקופיה כדי לאפשר הדמיה של חניכה מתאי גידול GBM הזריקו במוח של עכבר חי. הטכניקה שלנו תסלול את הדרך למאמצים עתידיים על מנת להבהיר את מנגנוני האיתות העיקריים בין GSCs ותאי אנדותל כלי דם במהלך חניכת גליומה.

Protocol

1. פרוטוקול

1. הרדם עכבר עם קטמין וxylazine במינון של קטמין מ"ג 0.1 ו 0.01 מ"ג של xylazine ל1 גרם של משקל גוף. Carprofen (0.005 מ"ג לכל 1 גרם של משקל גוף) משמש לשיכוך כאבים והוא מנוהל לפני ניתוח.
2. כל הכלים כירורגיים, כולל מקדח השיניים, הוא קיטור המעוקר ב חיטוי. אם ניתוחים יצוו הם שיש לבצע, את הטיפים של מכשירי ניתוח חייבים להיות מחדש מעוקרים עם חרוז זכוכית מעקר (מדע פיין כלי FST 250) לפני כל ניתוח שלאחר מכן.
3. ברגע שהעכבר הגיע מטוס כירורגית של הרדמה, שהוערך על ידי העדר תגובה לקמצוץ בוהן, היא ממוקמת על צמר גפן ואז הממוקם על משטח מחומם כדי לשמור על טמפרטורת גוף של ~ 37 ° C. עומק ההרדמה מנוטר לעתים קרובות במהלך הניתוח.
4. פרווה הוסרה מהראש הגבה באזור משולש כ ~ 3 מ"מ זנב לnares והארכת caudally לספירהrvical חוליות. משחה לרפואת עיניים מוחלת על עיניים כדי להגן עליהם מהתייבשות וגירוי.
5. העכבר ממוקם בrecumbancy גחון ולחטא את העור עם יוד ניתוחית, 70% אתנול, ומטליות סטריליות. דש 0.8 x 1.0 סנטימטר של עור המכסה את ההיבט הגבי של העצמות הקדמיות והקודקודית של הגולגולת מוסר באמצעות מספריים עדינים.
6. משכך כאבים מקומי, 0.5% לידוקאין, מיושם באופן מקומי לקרום העצם ואת הרקמות שנחשפו בשולי הפצע. קרום העצם הוסר על ידי גירוד את הגולגולת בעדינות עם להב סכין חיתוך; זה יעזור דבק cyanoacrylate לדבוק עצם.
7. אזור קליפת המוח של עניין מתואר בגולגולת עם טוש. השטח של עניין לא צריך להיות ממוקם מעל תפרים בגולגולת, כדי למנוע ניזק לכלי שיט גדולים שבבסיס.
8. שכבה דקה של דבק cyanoacrylate מוחלת על שולי הפצע, כדי למנוע החלחול של נוזלי serosanguinous, ולמעט בגולגולתהאזור של עניין.
9. מלט שיני אור פעיל משמש בפרוטוקול שלנו לאיטום הגולגולת. לפני היישום של בטון שיניים, כל הגולגולת החשופה למעט השטח המיועד לדילול מטופל עם פריימרים וכתוצאה מכך עם הסוכן המליט מערכת מלט שיני אור הופעל. ברגע שהחומר הקושר מיובש, מלט שיני אור המופעל מיושם על מנת לכסות את הגולגולת. כדי לייצב את הראש של העכבר לניתוח והדמיה שלאחר מכן, אגוז hex סטרילי # 00-90 מוטבע בבטון בשיניים במרחק מהאזור לדילול. השימוש במלט שיני אור פעיל מאפשר לנו להכין את הגולגולת ללא צורך למהר לסיים את כל ההליך. לאחר הכנת מלט השיניים בגולגולת הושלמה, מלט השיניים נרפא עם אור הנראה.
10. לאחר מלט השיניים הוא נרפא, בעל כיסוי ראש ממכשיר stereotactic הוא רכוב לאגוז hex על ראש העכבר באמצעות # 00-90 בורג.
11. Drאופ של בטמפרטורת חדר, 0.9% סליין סטרילי מוחל על אזור הגולגולת לדילול. בעזרת stereomicroscope, מייקרו-תרגיל במהירות גבוהה משמש כדי לדלל אזור עגול של הגולגולת (בדרך כלל 4-5 ~ מ"מ קוטר) מעל האזור של עניין. קידוחים והיישום של מי מלח לאזור הקדח מבוצעים לסירוגין במהלך הליך הדילול, כדי למנוע פגיעת תרמית ברקמת המוח הבסיסית. מלוח סופג חום וגם עוזר לרכך את העצם.
12. גולגולת העכבר מורכבת משתי שכבות דקות של עצם קומפקטי, רבדת שכבה עבה של עצם ספוגי. השכבה החיצונית של עצם הקומפקטי ביותר של העצם הספוגי יוסרה באמצעות המקדח.
13. אחרי שרוב העצם הספוגי מוסר, החללים שנותרו בתוך העצם הספוגי ניתן לראות תחת מיקרוסקופ לנתח, המציין כי קידוח מתקרב לשכבת העצם הקומפקטית הפנימית. בשלב זה, עובי גולגולת עדיין צריך להיות יותר מ 50 מיקרומטר. גולגולת צריך להיות דלילהמשיך בזהירות כדי לקבל דקה מאוד (~ 20 מיקרומטר) וחלק הכנה.
14. ברגע העובי הרצוי של גולגולת מושג (~ 20 מיקרומטר), שהגולגולת לוטשה ראשון באמצעות שוט סיליקון בהזמנה אישית עם יהלום דבק (6-15 מיקרומטר) לכ 10 דקות. ליטוש יהלומי הדבק משרת שתי מטרות. ראשית, זה עוד יותר מדלל את הגולגולת בלי הפעלת לחץ על הגולגולת הדקה יותר, ובכך למנוע ניזק מקרי לרקמת המוח הבסיסית. שנית, הוא משמש כצעד ראשוני לליטוש הגולגולת דללה לפני פח התחמוצת הפרטנית משמשת לליטוש גולגולת נוספת.
15. לאחר ליטוש יהלומי הדבק, הגולגולת הדקה יותר מלוטשת עם תחמוצת בדיל לכ 10 דקות. ברגע שהגולגולת היא מלוטשת, תחמוצת הבדיל הוא הסמיק משם עם מי מלח עד שהגולגולת דללה מופיעה נקיה.
16. בשלב זה, אם החלון גולגולתי הוא לשמש לאורך in vivo הדמיה, אזור הגולגולת הדקה ניקה הוא מיובש. טיפה קטנה של ברורדבק cyanoacrylate מוחל לאטום את החלון גולגולתי. השכבה של דבק cyanoacrylate בין הגולגולת הדקה יותר וcoverslip צריכה להיות דקה ככל האפשר.
17. אם הזרקה היא שיש לבצע לאחר יצירת חלון גולגולתי נמלים, בשלב זה, מחט מזרק 26-מד משמשת ליצירת פתח קטן בצד אחד של חלון, המצוחצח וגולגולת דקה. פתיחה זו משמשת להזרקת תאי GBM.
18. כוס טפטפה סטרילית עם קצה הפתיחה כ 50 מיקרומטר בקוטר הוא משך באמצעות חולץ פיפטה. פיפטה זה ישמש להזרקת תאי GBM, והוא הועמס על micromanipulator. פיפטה נטענת בזווית של 30 מעלות, כך שאתר הזרקת תאי GBM יהיה רחוק מאתר ההדמיה הסופי. קצה פיפטה יוסר תחת מיקרוסקופ נתיחה. השעית תא GBM היא החזית שנטענה לתוך פיפטה ידי שאיבה באמצעות משאבת מזרק.
19. לאחר הזרקת פיפטה טעונה עם תאי GBM, העכבר יועבר חזרה תחת המיקרוסקופ האלקטרוני. פיפטה ההזרקה יורדת לכיוון הפתח הקטן בחלון גולגולתי ולבסוף הוכנסה לתוך המוח דרך הפתח באמצעות micromanipulator. μl 1 מתוך השעית תא GBM מוזרק לתוך 100-200 מיקרומטר המוח ממשטח המוח (מהירות: 0.1 μl / דקות, משך: 10 דקות).
20. הגולגולת היא מיובשת, טיפה קטנה של דבק cyanoacrylate ברור מוחלת על הגולגולת המיובשת, וחתיכה בגודל 3-# 1 מ"מ coverslip היא דבקה אזור הגולגולת הדקה ומלוטש. הרווח בין coverslip ומלט שיניים סמוך הוא חתום עם דבק cyanoacrylate.
21. לאחר ניתוח, העכבר מוזרק מתחת לעור עם מי מלח חם סטרילי 1 מ"ל ומסופק עם חום משלים כדי לשמור על טמפרטורת גוף עד שהתאושש לגמרי מההרדמה.
22. עבור הדמיה, עכברים מורדמים עם קטמין וxylazine במינון של קטמין מ"ג 0.1 ו 0.01 מ"ג של xylazine ל1 גרם של משקל גוף. עכברים משותקים באמצעות מסגרת stereotactic מותאמת אישיתמתחת למיקרוסקופ. אם חוזר על עצמו בגוף חי הדמיה מתבצע על בסיס יומי, isofluorane יהיה אפשרות טובה יותר, כמו עכברים להראות סימנים של תלות בשימוש חוזר ונשנה של קטמין.

2. נציג תוצאות

ניתוח חלון גולגולתי מוצלח יציאות מאפשר החלון גולגולתי להישאר ברור במשך שבועות עד חודשים. איור 1 מציג את כלי הדם מתחת לחלון גולגולתי יציאות ראה בעיני רווחו באמצעות אור backscattered. תמונות vasculature אלו שמשו כאתרים לאיתור אזורי המוח הזהה להדמיה חוזרת ונשנית. כדי להמחיש את שני התאים אנדותל כלי הדם ותאי GBM, חצה את B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / י העכבר, שתוויות בתאי אנדותל כלי דם עם B6.Cg-GT (רוזה) 26Sor ^{tm9 (CAG-tdTomato ) Hze} / י עכבר, ועכברים שנוצרו עם תאי אנדותל כלי דם שכותרתו עם tdTomato החלבון פלואורסצנטי האדום. לאחר מכן בצענו את הליך craniotomy יציאות במייל אלהלסה"נ, והזריק GFP שכותרתו תאי GBM לתוך המוח שלהם דרך פתח קטן בצד של חלון גולגולתי. לאחר מכן בצענו in vivo הדמית שני פוטוני longitudinally על העכברים שהוזרקו. גל עירור הליזר נקבע על 910 ננומטר, אשר גרם לעירור של שני GFP וtdTomato. שני פוטוני ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ שהותקן שני פוטוני ליזר סריקה עם שני גלאים ליכולת האיתור סימולטני ירוקה / אדום פלואורסצנטי. איור 2 מראה בדוגמא vivo של ייזום גליומה מתאי GBM הזריקו ליד כלי הדם. יציאות החלון גולגולתי הוא גם בחירה מצוינת עבור זמן לשגות כרוני בתחום הדמית vivo. איור 3 מציג מכתים GFAP של חלקים בקליפת מוח מעכבר ללא ניתוח יציאות, עכבר 7 ימים לאחר ניתוח יציאות, ועכבר 7 ימים לאחר ניתוח ויציאות הזרקת תמיסת מלח. זה ברור מהתמונות שהעכבר ללא ניתוח והעכבר עם porניתוח TS אין לי דבק, ואילו לאחר הזרקה מי מלח, דבק נצפה ברקמת המוח של העכבר, בשל פיפטה חדירה וזריקה של תמיסת מלח במוח. תוצאה זו מדגימה דבקה שאינה מתרחשת מתחת לחלון גולגולתי היציאות, מתן אימות עצמאית שיציאות חלון גולגולתי שתואר כאן אינן מובילה לדבקות שמזוהה בדרך כלל עם "גולגולת פתוחה" חלון גולגולתי כרוני. איור 4 מראה ברזולוציה גבוהה הדמיה של קוצים הדנדריטים מאותה העכבר ביום של ניתוח (יום 0) ו 32 ימים לאחר יצירת חלון היציאות (יום 32), הוכחה כי חלון היציאות הוא גם בחירה מצוינת עבור רזולוציה גבוהה in vivo ההדמיה.

איור 1. יזואליזציה של כלי דם מתחת לחלון מלוטש ומחוזק דלל גולגולת גולגולת באמצעות אור backscattered. ימים לא מייצגים הוא מספר הימים לאחר ניתוח; תמונות צולם החל מיום הניתוח באופן מיידי לאחר השלים הזרקת תאי GBM. בר סולם:. 0.5 מ"מ לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2. ויזואליזציה של תאים מוזרקים GBM ומערכת כלי דם בגוף חי. עכברים שנשאו הן Tek-Cre וROSA26 CAG-tdTomato שמשו להזרקת תאי GBM. תאי אנדותל כלי דם תויגו עם tdTomato (אדום), ותאי GBM תויגו עם GFP (ירוק). תמונות נרכשו החל 24 שעות לאחר הזרקת תאי GBM. סכום כולל של 10-12 שדות סמוכים של נוף נלקחו ונאספו סמוך זה לזה, עם תאי GBM הזריקו זוהו במרכז השדה הכולל, כדי לייצר את התמונות הסופיות. ימים מייצגים את מספר הימים לאחר ניתוח. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. דבק אינו מתרחש לאחר ניתוח חלון יציאות גולגולת. פנלים עליונים: סעיף עטרת עכבר מוח בהגדלה נמוכה. פנל שמאלי: עכבר ללא כל ניתוח חלון גולגולתי; אין הפעלת GFAP נצפה ברקמת המוח. פנל תיכון: עכבר עם חלון גולגולתי יציאות שנוצרו בצד הימני של המוח, אף הפעלת GFAP נצפה ברקמת המוח. לוח ימני: עכבר עם חלון יציאות גולגולת והזרקה מי מלח מהצד של חלון היציאות. הפעלת GFAP הוא ציין בצד של חלון היציאות, אבל לא בצד של רקמת מוח השלמה. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. פנל תחתון: תמונות גבוה יותר כוח של רקמות מוח באזורים שהוזכרו בקופסה הלבנה של תמונות העליונות בלוח. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.

איור 4. הדמיה של קוצים הדנדריטים מ- 1 עכברי YFPH ברזולוציה גבוהה. תמונות נרכשו ביום ניתוח יציאות, ו32 ימים לאחר ניתוח יציאות. ניכר מהתמונות שרוב הקוצים מציגים ביום 0 הם 32 ימים לאחר ניתוח נראים בבירור יציאות. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר.

Discussion

המפתח לחלון גולגולתי מוצלח יציאות הוא דליל וליטוש. אמנם דליל הראשוני יכול להתבצע במהירות, יש להקפיד על מנת להבטיח הומוגנית הדילול של הגולגולת על פני שטח גדול. אנחנו בדרך כלל למרוח שכבה דקה של מלח לגולגולת, ולאחר מכן לעבור גולגולת דקה אחת בכל פעם, כך שתמיסת המלח מתאדה זמן קצר לאחר microdrill עברה מעל הגולגולת פעם אחת. זה מאפשר לנו לאט אבל homogenously נוסף דק הגולגולת. יד יציבה מתחת למיקרוסקופ היא גם מפתח. ברגע גולגולת דלילה-מתקרב העובי הרצוי, אנחנו בדרך כלל להשתמש ביהלומים להדביק כדי למרק את הגולגולת דללה במשך 10-15 דקות, עם ליטוש לאחר שימוש בתחמוצת בדיל. אנו מוצאים שליטוש הגולגולת דללה הראשונה עם יהלום משחת מניב תוצאה טובה יותר בליטוש כללי, וגם מאפשרים לנו לקדם דק שטח גדול של אזור גולגולת מבלי להחיל לחץ רב על אזור הגולגולת הדקה יותר.

אנחנו בחרנו את יציאות CRחלון anial במקום חלונות נפוצים אחרים גולגולת, כגון חלון "הפתוח גולגולת" וחלון "דלל גולגולת", מהסיבות הבאות: עם חלון הגולגולת הפתוחה, החלון גולגולתי בדרך כלל הופך מעונן זמן קצר לאחר ההקמה ולאחר מכן מנקה את בפני עצמו בתוך השבועות הראשונים, ולכן דורש תקופת מתנה של כשבועות לפני שניתן יהיו לבצע את כל ניסויי הדמיה. שבוע שתי זו תקופת מתנה ימנע הדמית חניכת גליומה בשבועות הראשונים לאחר הזרקת תאי GBM. חלון גולגולת הגולגולת דלל דורש חוזר דליל לפני כל פגישת הדמיה, ההופכת אותו לבלתי מתאים להזרקת תאי GBM ויזואליזציה של ייזום גליומה על בסיס יומי. לעומת זאת, בחלון היציאות מאפשר לנו לבצע הזרקת תאי GBM מהצד של החלון, אשר ממזער את הניזק לרקמת המוח, ומאפשר גם ביצוע הדמית היצירה מייד הבאה ברזולוציה הגבוהה של החלון. Information בגליומה ייזום ניתן לאסוף בשבועות הראשונים שלאחר הזרקת תאי GBM, שהוא יתרון מרכזי על טכניקת הגולגולת הפתוחה לסוג זה של מחקרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate	Thermo Sci Hyclone	SH3026101
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
GlutaMax-1 Supplement	Invitrogen	35050061
Penicillin-Streptomycin Solution	Thermo Sci Hyclone	SV30010
Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56
T25 flasks-vent cap green	Sarstedt Ltd	83.1810.502
70% alcohol	JAX LAHS
10% povidone-iodine topical solution	JAX LAHS
Ketamine HCl	Butler Animal Health Supply	NDC# 11695-0550-1
Xylazine	Akorn, Inc.	NADA# 139-236
Carprofen	JAX LAHS
Ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
0.5% Lidocaine HCl	REGENT, Inc.	NDC 0517-0625-25
Cyanoacrylate glue	Henkel Corp	46551
Sterile Swabs	Fisher Scientific	23-400-114
Diamond paste	Widget Supply	BBE60
Tin oxide	LORTONE, Inc.	591-038
Liner Bond 2V	KURARAY Medical Inc.	1921-KA
Clearfil AP-X	KURARAY Medical Inc.	1721-KA
Saline	JAX LAHS
Cover glass	Warner Instruments	64-0720
Hex Nut	Small Parts, Inc.	HNX-0090-C
Syringe Pump	Syringepump.com	NE-1000
Two-Photon imaging system	Custom built (Any commercial system would work)