Summary
Ved å kombinere en polert og forsterket tynn-skull (porter) cranial vinduet og glioblastoma (GBM) celle injeksjon, kan vi observere glioma initiering og vekst fra injiserte GBM celler i hjernen til en levende mus i lengderetningen.
Abstract
Glioma er en av de mest dødelige former for menneskelig kreft. Den mest effektive glioma terapi til dato-kirurgi etterfulgt av strålebehandling-gir pasientene beskjedne fordeler, som de fleste pasienter ikke overleve mer enn fem år etter diagnose på grunn av glioma tilbakefall 1,2. Oppdagelsen av kreft stamceller i menneskelige hjernesvulster holder løftet for å ha en enorm innvirkning på utviklingen av nye terapeutiske strategier for glioma 3. Kreftstamceller defineres ved sin evne både til selv fornye og å skille, og er tenkt å være de eneste celler i en svulst som har kapasitet til å initiere nye svulster 4. Glioma tilbakefall etter strålebehandling antas å oppstå fra motstand av glioma stamceller (GSCS) til terapi 5-10. In vivo, er GSCS vist seg å ligge i en perivaskulær nisje som er viktig for å opprettholde sine stamcelle-lignende egenskaper 11-14 . Sentralt i den organisasjonensjon av GSC nisje er vaskulære endotelceller 12. Eksisterende bevis tyder på at GSCS og deres samspill med vaskulære endotelceller er viktig for tumor utvikling, og identifisere GSCS og deres samspill med endotelceller som viktige terapeutiske mål for glioma. Tilstedeværelsen av GSCS bestemmes eksperimentelt ved deres evne til å initiere nye svulster ved orthotopic transplantasjon 15. Dette er vanligvis oppnås ved å injisere et bestemt antall GBM celler isolert fra humane svulster i hjernen på alvorlig immun-mangelfull mus, eller av mus GBM celler i hjernen på congenic vert mus. Analyser for tumorvekst blir deretter utføres etter tilstrekkelig tid til å tillate GSCS blant injiserte GBM cellene til å gi opphav til nye svulster-typisk flere uker eller måneder. Derfor trenger eksisterende analysene ikke tillate undersøkelse av viktige patologisk prosess startfasen fra enkle GSCS in vivo. Derfor viktig insights i de spesifikke roller GSCS og deres samspill med vaskulære endotelceller i de tidlige stadier av startfasen mangler. Slike innsikter er avgjørende for å utvikle nye terapeutiske strategier for gliom, og vil ha store konsekvenser for å hindre glioma tilbakefall hos pasienter. Her vi har tilpasset Portene cranial vindu prosedyre 16 og in vivo to-foton mikroskopi å tillate visualisering av startfasen fra injisert GBM celler i hjernen av en levende mus. Vår teknikk vil bane vei for fremtidige arbeidet med å belyse de viktigste signaliserer mekanismer mellom GSCS og vaskulære endotelceller under glioma innvielse.
Protocol
1. Protokoll
- Anesthetize musen med ketamin og xylazin i en dose på 0,1 mg ketamin og 0,01 mg av xylazin per 1 g kroppsvekt. Karprofen (0.005 mg per 1 g kroppsvekt) benyttes til analgesi og administreres preoperativt.
- Alle kirurgiske verktøy, inkludert dental borkronen, er dampsteriliseres i en autoklav. Hvis batch operasjoner skal utføres, må spissene på kirurgiske instrumenter steriliseres med et glass bead sterilizer (Fine Science Verktøy FST 250) før hver påfølgende operasjon.
- Når musen har nådd en kirurgisk plan av anestesi, vurdert ved fravær av en respons på en tå klype, plasseres den på en bomullsdott som deretter plasseres på en oppvarmet pute å opprettholde en kroppstemperatur på ~ 37 ° C. Anestesidybden overvåkes ofte under operasjonen.
- Fur fjernes fra dorsal hodet i en omtrent trekantet område ~ 3 mm kaudal til svelget og strekker kaudalt til cervical ryggvirvler. Ophthalmic sårsalve brukes på øynene for å beskytte dem fra dehydrering og irritasjon.
- Musen plasseres i ventral recumbancy og huden desinfiseres med kirurgisk jod, 70% etanol, og sterile vattpinner. En 0,8 x 1,0 cm klaff av huden som dekker dorsal aspekt av frontal og parietal bein i skallen fjernes ved hjelp av fine saks.
- En topikal analgetikum, 0,5% lidokain, påføres lokalt til periosteum og de eksponerte vev ved periferien av såret. Periosteum fjernes ved forsiktig skraping skallen med en skalpell blad, og dette vil hjelpe cyanoakrylater lim til å følge bein.
- Kortikale område av interesse er skissert på skallen med en markør. Området av interesse bør ikke ligger over skull sutur linjer, for å unngå skade på underliggende store fartøy.
- Et tynt lag av cyanoakrylater klebemiddel påføres sårkantene, for å hindre utsiving av serosanguinous fluidum, og til skallen unntatt iområdet av interesse.
- Lysaktivert dental sement brukes i protokoll vårt for tetting skallen. Før påføring av dental sement, alt eksponert skallen bortsett fra området beregnet for tynning behandlet med primere og senere med bindemiddel fra lysaktivert tannsement kit. Når bindemiddel tørkes, blir lysaktivert tannsement dekke opp skallen. Å stabilisere hodet av musen for etterfølgende kirurgi og avbilding, er en steril # 00-90 sekskantmutteren innebygd i dental sement i en avstand fra det område som skal tynnes. Bruken av lys-aktivert dental sement tillater oss å forberede skallen uten å jag for å fullføre hele prosedyren. Når tannsement forberedelse på skallen er fullført, blir den tannsement herdet med synlig lys.
- Etter dental sement er herdet, blir en headpiece holderen fra stereotaktisk enheten montert på sekskantmutteren på musen hodet ved hjelp av en # 00-90 skrue.
- En drop av rom-temperatur, er 0,9% sterilt saltvann påføres skallen området som skal tynnes. Ved hjelp av en stereomikroskop, er en høy-hastighet mikro-drill brukes til å fortynne et sirkulært område av skallen (typisk ~ 4-5 mm i diameter) over regionen av interesse. Boring og anvendelsen av saltoppløsning til det borede området utføres intermittent under tynning prosedyren for å unngå termisk skade på underliggende hjernevev. Saline absorberer varme og hjelper også myke bein.
- Musen skallen består av to tynne lag med kompakt bein, sandwiching et tykt lag av svampaktig bein. Ytre laget av kompakt ben og det meste av svampaktig bein blir fjernet ved hjelp av boret.
- Etter at mesteparten av svampaktig bein er fjernet, kan de resterende hulrom i svampaktig bein sees under et disseksjonsmikroskop, indikerer at boringen nærmer den interne kompakt bein lag. På dette stadiet, bør skallen tykkelse fortsatt være mer enn 50 mikrometer. Skull tynning bør værefortsatte nøye for å oppnå en meget tynn (~ 20 pM) og glatt forberedelse.
- Når ønsket tykkelse av skallen er oppnådd (~ 20 mikrometer), er skallen første polert ved hjelp av en skreddersydd silikon pisk med diamant pasta (6-15 mikrometer) ca 10 min. Diamant-paste polering tjener to formål. Først, tynner det ytterligere skallen uten trykk på tynnet skallen, og dermed unngå utilsiktet skade på underliggende hjernevev. Sekund, det tjener som en første polering skritt for tynnet hodeskallen før finkornet tinnoksyd brukes for videre skull polering.
- Etter diamant-lim polering, er tynnet skallen polert med tinn oksid for ca 10 min. Når skallen er polert, er tinn oksid skylles vekk med saltvann til tynnet skallen vises ren.
- På dette trinn, hvis den kraniale vinduet skal brukes for langsgående in vivo avbildning, blir det rengjorte tynne skallen område tørket. En liten dråpe klarcyanoakrylater lim påføres for å forsegle den kraniale vinduet. Laget av cyanoakrylater Limingen mellom tynnet skallen og dekkglasset bør være så tynn som mulig.
- Hvis en injeksjon skal utføres etter etableringen av en PORTS kraniale vindu, på dette trinn, er en 26-gauge sprøytenål brukes til å opprette en liten åpning på den ene side av polert tynn-skull vinduet. Denne åpning blir brukt for GBM celle injeksjon.
- En steril glass-pipette med en spiss åpning ca 50 um i diameter er trukket ved hjelp av en pipette avtrekker. Dette pipette vil bli brukt til GBM celle injeksjon, og er lastet opp på en micromanipulator. Pipetten er lastet i en 30-graders vinkel slik at GBM cellen injeksjonsstedet vil være borte fra det endelige bildebehandling området. Den pipettetuppen fjernes under en disseksjon mikroskop. Den GBM cellesuspensjon er frontmatet inn i pipetten ved suging med en sprøyte pumpe.
- Når injeksjon pipette er lastet med GBM celler, er musen beveges tilbake under the mikroskop. Injeksjonen pipette senkes mot den lille åpningen i kraniale vinduet og endelig satt inn i hjernen gjennom åpningen ved hjelp av en mikromanipulator. 1 pl av en GBM cellesuspensjon er injisert i hjernen 100-200 mikrometer fra hjernen overflaten (hastighet: 0,1 pl / min, varighet: 10 min).
- Skallen er tørket, er en liten dråpe klar cyanoakrylat lim påføres tørket skallen, og et stykke av 3-mm størrelse # 1 dekkglass er festet til tynn og polert skallen området. Mellomrommet mellom dekkglasset og tilstøtende tannsement er forseglet med cyanoakrylat lim.
- Etter kirurgi, musen injisert subkutant med 1 ml varm sterilt saltvann og gitt med ekstra varme for å opprettholde kroppens temperatur inntil fullt utvinnes fra anestesi.
- For bildebehandling, mus er bedøvet med ketamin og xylazin i en dose på 0,1 mg ketamin og 0,01 mg av xylazin per 1 g kroppsvekt. Mus er immobilisert med en tilpasset stereotactic rammeunder mikroskopet. Hvis repeterende in vivo avbildning utføres på daglig basis, vil isofluorane være et bedre alternativ, som mus vil vise tegn til avhengighet med repeterende bruk av ketamin.
2. Representant Resultater
En vellykket PORTS cranial vindu kirurgi lar cranial vinduet for å forbli klart for uker til måneder. Figur 1 viser blodkar under en porter cranial vindu som visualiseres ved tilbakespredt lys. Disse vaskulaturen bildene ble brukt som landemerker for finne de samme hjerneområder for repeterende avbildning. For å visualisere både blodkar endotelceller og GBM celler, krysset vi B6.Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa / J mus, som betegner vaskulære endotelceller med B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato ) Hze / J mus, og genererte mus med vaskulære endotelceller merket med den røde fluorescerende protein tdTomato. Vi utførte porter kraniotomi prosedyren på disse miCE, og injisert GFP-merkede GBM celler til deres hjerner gjennom en liten åpning på siden av et kraniale vindu. Vi deretter utført in vivo to-foton bildebehandling lengderetningen på den injiserte mus. Laseren eksitasjonsbølgelengde ble satt til 910 nm, noe som resulterte i eksitasjon av både GFP og tdTomato. To-foton bildebehandling ble utført på en spesialbygd to-foton laser-scanning mikroskop med to detektorer for samtidig grønn / rød fluorescens gjenkjenningsmuligheter. Figur 2 viser en in vivo eksempel gliomer initiering fra injiserte GBM celler nær vaskulatur. Portene cranial vinduet er også et utmerket valg for kronisk time-lapse in vivo imaging. Figur 3 viser GFAP farging av kortikale seksjoner fra en mus uten porter kirurgi, en mus 7 dager etter porter kirurgi, og en mus 7 dager følgende porter kirurgi og saltvann injeksjon. Det er tydelig fra bildene at musen uten kirurgi og musen med PORTS kirurgi har gliosis, mens etter saltvann injeksjon gliosis observert i hjernevev av musen, grunnet pipettere penetrasjon og saltvann injeksjon i hjernen. Dette resultatet viser at gliosis ikke skjer under porter cranial vinduet, som gir uavhengig bekreftelse på at portene cranial vindu beskrevet her ikke fører til gliosis som vanligvis forbindes med en "åpen skull" kronisk cranial vinduet. Figur 4 viser høy oppløsning avbildning av dendrittiske spines fra samme musen på samme dag som inngrepet (Dag 0) og 32 dager etter porter vinduet etableringen (Dag 32), som viser at portene vinduet er også et utmerket valg for høy oppløsning in vivo imaging.
Figur 1. Visualisering av blodkar under en polert og forsterket tynnet skull cranial vinduet ved hjelp tilbakespredt lys. Dager representerer t Han antall dager etter operasjonen, bildene ble tatt fra den dagen av kirurgi umiddelbart etter ferdigstillelse av GBM celle injeksjon. Målestokk:. 0,5 mm Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Visualisering av injisert GBM celler og vaskulaturen in vivo. Mus bærer både Tek-Cre og ROSA26 CAG-tdTomato ble brukt for GBM celle injeksjon. Vaskulære endotelceller ble merket med tdTomato (rød), og GBM celler ble merket med GFP (grønt). Bilder ble kjøpt fra 24. time etter GBM celle injeksjon. Totalt 10-12 tilstøtende synsfelt ble tatt og ble montert ved siden av hverandre, med de identifiserte injisert GBM celler i midten av den totale felt, for å produsere de endelige bilder. Dager representerer antall dager etter operasjonen. Målestokk: 100 mikrometer.href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se større figur.
Figur 3. Gliosis ikke oppstår følgende porter cranial vindu kirurgi. Øvre panel: Mouse hjernen koronale delen under lavere forstørrelse. Venstre panel: en mus uten kraniale vindu kirurgi, ingen GFAP aktivisering er observert i hjernevev. Midtre panelet: en mus med en PORTS cranial vindu genereres på høyre side av hjernen, ingen GFAP aktivering er observert i hjernevev. Høyre panel: en mus med en PORTS kranial vindu og saltholdig injeksjon fra siden av portene vinduet. GFAP aktivering er observert på siden av portene vinduet, men ikke på siden av intakt hjernevev. Målestokk: 1 mm. Nedre panel: høyere effekt bilder av hjernen vev i områder som er angitt i den hvite boksen av de øverste panel bilder. Målestokk: 100 mikrometer. 
Figur 4. Høyoppløselig avbildning av dendrittiske spines fra Thy-1 YFPH mus. Bildene ble kjøpt samme dag havner kirurgi, og 32 dager etter porter kirurgi. Det er tydelig fra bildene at de fleste spines presenterer på dag 0 er tydelig synlige 32 dager følgende porter kirurgi. Målestokk: 2 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøkkelen til en vellykket porter cranial vindu er tynning og polering. Mens den første tynning kan utføres raskt, bør man sørge for å sikre homogen tynning av skallen over et stort område. Vi vanligvis bruke et tynt lag av saltvann til skallen, og deretter tynn skallen ett pass gangen, slik at saltoppløsningen fordamper kort etter microdrill har passert over skallen gang. Dette gir oss muligheten til å sakte men homogent ytterligere tynn skallen. En stødig hånd under mikroskopet er også viktig. Når skull-tynning nærmer den tiltenkte tykkelse, vi vanligvis bruker diamant lim til å polere tynnet skallen for 10-15 min, med påfølgende polering med tinn oksid. Vi finner at polering tynnet skallen først med diamant lim gir en bedre polering resultat generelt, og også tillater oss å gå videre tynn et stort område av skallen området uten å bruke mye press på tynnet skallen området.
Vi valgte porter cranial vindu fremfor andre brukte kraniale vinduer, for eksempel "åpen skull" vinduet og "tynnet skull" vinduet, av følgende grunner: Med åpen skallen vinduet, blir cranial vinduet vanligvis skyet kort tid etter etableringen, og deretter klarner opp på egen hånd i løpet av de første to ukene, og dermed krever en ventetid på ca to uker før noen bildebehandling eksperimenter kan utføres. Denne to-ukers ventetid ville hindre visualisering av glioma innvielse i løpet av de første to ukene etter GBM celle injeksjon. Tynnet skull cranial vindu krever repeterende tynning før hver tenkelig sesjon, som gjengir den uegnet for GBM celle injeksjon og visualisering av gliomer initiering på daglig basis. I kontrast, tillater portene vinduet oss å utføre GBM celle injeksjon fra siden av vinduet, som minimerer skade på hjernevev, og tillater også ytelse av høy oppløsning umiddelbart etter etableringen av vinduet. Informasjon på gliomer initiering kan samles i løpet av de første få ukene etter GBM celle injeksjon, som er en viktig fordel over den åpne skull teknikken for denne type studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Grant og The Maine Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
- Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
- Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
- Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
- Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
- Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
- Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
- Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
- Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
