Summary
Благодаря сочетанию полированных и железобетонных тонкий череп (порты) черепных окна и глиобластомы (GBM) инъекции клеток, мы можем наблюдать глиомы зарождения и роста вводят в клетки глиобластомы в мозгу живых мышей в продольном направлении.
Abstract
Глиомы является одной из самых смертельных форм рака у человека. Наиболее эффективным глиомы терапии для дата-операции с последующей лучевой лечение дает пациентам лишь скромные выгоды, так как большинство пациентов не выживают более пяти лет после диагноза в связи с рецидивом глиомы 1,2. Открытие раковые стволовые клетки в человеческом опухолей головного мозга перспективен для имеющих огромное влияние на развитие новых терапевтических стратегий для глиомы 3. Раковые стволовые клетки определяется их способностью как к самообновлению и дифференцировать, и, как считается, только клетки опухоли, которые имеют возможность инициировать новые опухоли 4. Глиомы рецидива следующие лучевая терапия, как полагают, связаны с сопротивлением стволовые клетки глиомы (GSCs) к терапии 5-10. В естественных условиях, GSCs показано на проживание в периваскулярных нишу, которая имеет важное значение для поддержания их стволовых клеток, как характеристика 11-14 . Центральное место в организацияхзации GSC ниши сосудистых эндотелиальных клеток 12. Существующие данные свидетельствуют о том, что GSCs и их взаимодействие с клетками эндотелия сосудов имеют важное значение для развития опухоли, а также определить GSCs и их взаимодействие с эндотелиальные клетки, как важна терапевтических мишеней для глиомы. Наличие GSCs определяется экспериментально по их способности инициировать новые опухоли на ортотопической трансплантации 15. Это обычно достигается путем введения определенного количества GBM клеток, выделенных из человеческих опухолей в мозге сильно иммуно-дефицитных мышей или мышей GBM клеток в мозге мышей конгенных хозяина. Анализы для роста опухоли, затем выполняется после достаточно времени, чтобы GSCs среди вводили клетки глиобластомы, чтобы дать начало новым опухолям, обычно несколько недель или месяцев. Таким образом, существующие тесты не позволяют рассмотрении важных патологического процесса опухолевого посвящение от одного GSCs в естественных условиях. Следовательно, существенно яnsights в конкретных ролей GSCs и их взаимодействие с клетками эндотелия сосудов на ранних стадиях опухолевого начала отсутствуют. Такие идеи имеют важное значение для разработки новых терапевтических стратегий для глиомы, и будет иметь большое значение для предотвращения глиомы рецидивов у пациентов. Здесь мы адаптировали портов черепно процедуру окна 16 и в естественных условиях двухфотонной микроскопии, чтобы визуализация опухоли посвящение от введенных клеток GBM в мозгу живых мышей. Наша техника проложит путь для будущих усилий по выяснению ключевые сигнальные механизмы между GSCs и сосудистых эндотелиальных клеток глиомы во время инициации.
Protocol
1. Протокол
- Anesthetize мыши с кетамином и ксилазина в дозе 0,1 мг кетамина и 0,01 мг ксилазина на 1 г веса тела. Carprofen (0,005 мг на 1 г веса тела) используется для обезболивания и вводят до операции.
- Все хирургические инструменты, в том числе стоматологические сверла, являются паровой стерилизации в автоклаве. Если партия операции должны быть выполнены, советы хирургические инструменты должны быть повторно стерилизованы стеклянная бусина стерилизатор (Fine науки Инструменты FST 250) перед каждой последующей операцией.
- Как только мышь достиг хирургического плоскости анестезии, оценивается отсутствие ответа на ноги крайнем случае, он будет помещен на ватный тампон, который затем помещается на площадку с подогревом для поддержания температуры тела ~ 37 ° C. Глубины анестезии контролируется часто во время операции.
- Мех удаляется из спинного голову в примерно треугольную площадь ~ 3 мм каудально ноздри и расширение каудально к сеrvical позвонков. Глазная мазь наносится на глаза, чтобы защитить их от обезвоживания и раздражения.
- Мышь находится в вентральной recumbancy и кожа обеззараживается с хирургической йода, 70% этанола, и стерильные тампоны. 0,8 х 1,0 см лоскут кожи охватывающий спинной части лобной и теменной костей черепа удаляется с помощью тонких ножниц.
- Актуальных обезболивающее, 0,5% лидокаина, применяется локально на надкостницы и подвергаются ткани на периферии раны. Надкостницы удаляется, мягко очищая череп с лезвие скальпеля, это поможет цианакрилатного клея присоединиться к кости.
- Области коры интереса, изложенные на череп с маркером. Область интересов, не должны быть расположены по линиям черепа шва, чтобы избежать повреждения основного крупных сосудов.
- Тонкий слой цианакрилатный клей наносится на края раны, чтобы предотвратить просачивание жидкости serosanguinous, и череп, за исключениеминтересующей области.
- Свет активированного стоматологического цемента используется в нашей протокол для герметизации черепа. Перед применением зубной цемент, все открытые черепа, за исключением области, предназначенной для разбавления обрабатывают грунтовкой, а затем с связующего от света активированного комплекта стоматологического цемента. После связующего сушат, светло-активированных стоматологического цемента применяется для покрытия черепа. Для стабилизации глава мышь для последующих операций и обработки изображений, стерильные # 00-90 шестигранная гайка встроена в стоматологического цемента на расстоянии от области, которая будет тоньше. Использование света активированного стоматологического цемента позволяет нам подготовить череп без необходимости спешить закончить всю процедуру. После стоматологического подготовки цемента на черепе завершена, зубным цементом лечат с помощью видимого света.
- После того, как зубной цемент затвердеет, головной убор держатель из стереотаксической устройство монтируется на шестигранные гайки на головку с помощью мыши # 00-90 винт.
- Д-рсоч при комнатной температуре, 0,9% стерильный физиологический раствор наносится на черепе области, чтобы разбавлять. С помощью стереомикроскопа, высокоскоростная микро-сверло используется для разжижения круговой области черепа (обычно ~ 4-5 мм в диаметре) по области интереса. Бурение и применение физиологического раствора, чтобы пробурить области осуществляется с перерывами в течение истончение процедуры, чтобы избежать термического повреждения основной мозговой ткани. Соленая поглощает тепло, а также помогает смягчить кости.
- Мыши череп состоит из двух тонких слоев компактную кость, сэндвич толстым слоем губчатой кости. Внешний слой компактной кости, и большинство из губчатой кости удаляются с помощью дрели.
- После того, как большинство из губчатой кости удаляются, оставшиеся пустоты в губчатой кости можно увидеть под микроскопом рассечение, указывая, что бурение приближается к внутренней компактного слоя кости. На данном этапе, толщина черепа все равно должны быть более 50 мкм. Череп прореживания должна бытьпродолжал внимательно получить очень тонкие (~ 20 мкм) и гладкий подготовки.
- Как только желаемая толщина черепа достигается (~ 20 мкм), череп сначала отполировать использованием заказных силиконовые кнут с алмазной пастой (6-15 мкм) в течение примерно 10 мин. Алмаз-полировальной пасты служит двум целям. Во-первых, это дальнейшее разжижает черепа без применения давления на разбавленной черепа, что позволяет избежать случайного повреждения основной ткани мозга. Во-вторых, он служит в качестве первого шага для полировки разбавленной черепа до мелкозернистого оксида олова используется для дальнейшей полировки черепа.
- После алмаза полировальной пасты, разбавленной череп полировали с оксидом олова в течение примерно 10 мин. Как только череп полированный, оксид олова не смывает с физиологическим раствором до разбавленной череп кажется чистой.
- На этом этапе, если черепно окна, которые будут использоваться для продольной в естественных изображений, очищенную тонкой области черепа сушат. Маленькая капля ясноцианакрилатного клей применяется для герметизации черепно окна. Слой клея между цианакрилатного разбавленной черепа и покровное должна быть как можно тоньше.
- Если инъекция должна быть выполнена после создания портов черепно окна, на этом этапе, 26-калибровочного иглы шприца используется, чтобы создать небольшое отверстие на одной стороне полированный тонкий череп окна. Это отверстие для инъекций ячейки GBM.
- Стерильной пипеткой стекла с наконечником открытие около 50 мкм в диаметре вытягивается при помощи экстрактора пипетки. Это пипетки будет использован для инъекции ячейки GBM, и загружается на микроманипулятора. Пипетки загружен на 30-градусный угол так, что GBM месте инъекции клетки будут находиться вдали от окончательного сайте изображений. Кончика пипетки удаляют при рассечение микроскопом. GBM суспензии клеток является на начальном этапе в пипетку путем всасывания с помощью шприца насос.
- После введения пипетки загружается с GBM клетки, мыши перемещается обратно в гоэлектронной микроскопии. Инъекций пипетки опускают на небольшое отверстие в черепной окну и, наконец, вставляется в мозг через отверстие с помощью микроманипулятора. 1 мкл GBM клеточной суспензии вводят в мозг 100-200 мкм от поверхности мозга (скорость: 0,1 мкл / мин, продолжительность: 10 минут).
- Череп сушат, маленькая капля ясно цианакрилатного клей наносят на высушенные черепа, и часть 3-мм размер № 1 покровное привязана к тонким и полированный череп области. Пространство между покровным и прилегающих стоматологического цемента уплотняется цианакрилатного клея.
- После операции мыши вводят подкожно 1 мл теплого стерильного физиологического раствора и снабжены дополнительными тепла для поддержания температуры тела до тех пор пока полностью не оправилась от наркоза.
- Для обработки изображений, мышей анестезировали кетамином и ксилазина в дозе 0,1 мг кетамина и 0,01 мг ксилазина на 1 г веса тела. Мыши иммобилизованных с помощью пользовательских кадров стереотаксическойпод микроскопом. Если повторяющийся в естественных изображений осуществляется на ежедневной основе, isofluorane будет лучшим вариантом, так как мышей проявляют признаки зависимости с повторным использованием кетамина.
2. Представитель Результаты
Успешный порта черепной хирургии окно позволяет черепно окна остаются чистыми в течение недель и месяцев. Рисунке 1 показана сосудистую под портов черепно окно, как визуализированы с помощью отраженного света. Эти сосудистой изображения были использованы в качестве ориентиров для размещения тех же областях мозга для повторяющихся изображений. Для визуализации и сосудистой эндотелиальных клеток и клеток GBM, мы пересекли B6.Cg-Tg (Tek-CRE) 1Ywa / J мышь, которая называет сосудистых эндотелиальных клеток с B6.Cg-GT (РОСА) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato ) HZE / J мыши и мыши с генерируются сосудистых эндотелиальных клеток помечены красным флуоресцентным белком tdTomato. Затем выполняется процедура портов трепанация черепа на эти милисе, и вводят GFP-меченых GBM клеток в мозг через небольшое отверстие на стороне черепной окна. Затем проводится в естественных условиях двухфотонного изображения в продольном направлении вводили мышам. Длина волны лазерного возбуждения была установлена на уровне 910 нм, в результате чего возбуждение как GFP и tdTomato. Двухфотонные изображений была выполнена на заказ двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа с двух детекторов для одновременной зеленая / красная флуоресценция способность обнаружения. Рисунке 2 показаны в естественных условиях примере глиомы посвящение от GBM вводили клетки вблизи сосудов. Порты черепно окна также является отличным выбором для хронических покадровой обработки изображений естественных условиях. Рисунке 3 показана GFAP окрашивания корковых разделов от мыши без хирургического вмешательства порты, мыши 7 дней после операции порты и мыши 7 дней после операции портов и физиологического раствора. Как видно из фотографий, что мыши без хирургического вмешательства и мыши с ПРTS операции не имеют глиоза, тогда как после введения физиологического раствора, глиоза наблюдаются в ткани мозга мыши, в связи с пипеткой проникновения и введения физиологического раствора в мозг. Этот результат показывает, что глиоза не происходит при портов черепно окна, обеспечивая независимое подтверждение того, что порты черепно окна, описанные здесь, не приводит к глиоза, что обычно связано с «открытым черепом" хронической черепно окно. Рисунок 4 показывает высокое разрешение визуализации дендритных шипиков из той же мыши на день операции (день 0) и 32 дней после создания окна порты (День 32), демонстрируя, что порты окна также является отличным выбором для высокого разрешения в естественных изображений.
Рисунок 1. Визуализация сосудистой под полированный и железобетонных разбавленной череп черепа окно с помощью отраженного света. Дни представляют т Он количества дней после операции, снимки были сделаны начиная со дня операции сразу после завершения инъекции ячейки GBM. Шкала бар. 0,5 мм Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Визуализация вводят GBM клетки и сосудистая в естественных условиях. Мышей, несущих как Tek-Cre и ROSA26 CAG-tdTomato были использованы для GBM инъекции клеток. Сосудистых эндотелиальных клеток были помечены tdTomato (красный), и GBM клетки были помечены GFP (зеленый). Изображения были получены, начиная с 24 часов после инъекции ячейки GBM. В общей сложности 10-12 соседние поля зрения были приняты и были собраны рядом друг с другом, с выявленными вводят GBM клетки в центре общего поля, для получения окончательного изображения. Дни представляют количество дней после операции. Шкала бар: 100 мкм.HREF = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" целевых = "_blank"> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.
Рисунок 3. Глиоза не происходит следующим портам черепной хирургии окна. Верхняя панель: мозг мыши корональных раздел по более низким увеличением. Слева: мышь без черепной хирургии окна, никакой активации GFAP наблюдается в тканях головного мозга. Средняя панель: мышь с портами черепно окна, созданные на правой стороне мозга; не GFAP активации наблюдается в тканях головного мозга. Справа: мышь с портами черепно окна и введения физиологического раствора со стороны окна порты. GFAP активации наблюдается на стороне окна порты, но не на стороне неповрежденной ткани головного мозга. Шкала бар: 1 мм. Нижняя панель: повышенной мощности изображений тканей мозга в областях, указанных в белом поле верхней панели изображений. Шкала бар: 100 мкм. 
Рисунок 4. Высокое разрешение изображения дендритных шипиков от Thy-1 мышей YFPH. Изображения были получены на день операции портов, и 32 дней после операции порты. Как видно из фотографий, что большинство шипов на 0 день отчетливо видны 32 дней после операции порты. Шкала бар: 2 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ключ к успешному портов черепно окно рубки ухода и полировки. Хотя первоначальный прореживания могут быть выполнены быстро, уход должны быть приняты для обеспечения однородного прореживания черепа на большой площади. Как правило, мы нанесите тонкий слой соленых к черепу, а затем тонкий череп один проход одновременно, таким образом, что солевой раствор испаряется сразу после microdrill прошла по черепу раз. Это позволяет нам медленно, но однородную тонкую дальнейшего черепа. Твердая рука под микроскопом также является ключевым. Как только череп истончение приближается к предполагаемой толщины, мы обычно используем алмазной пастой для полировки черепа разбавленной на 10-15 мин, с последующей полировкой использованием оксида олова. Мы считаем, что полировка разбавленной череп сначала с алмазной пастой дает лучший результат полировки в целом, а также позволяет нам еще больше тонких большой площади череп области без применения большого давления на череп разбавленной области.
Мы выбрали порты крanial окна, а не другие часто используемые черепно окна, такие как "открытые черепа" окно и "разбавленной черепа" окна, по следующим причинам: с открытым окном черепа, черепно окна обычно становится мутным вскоре после создания, а затем проясняется самостоятельно в течение первых двух недель, что требует периода ожидания примерно за две недели до любых изображений эксперименты могут быть выполнены. Этот двухнедельный период ожидания будет препятствовать визуализации начало глиомы в течение первых двух недель после инъекции ячейки GBM. Разбавленной череп черепа окно требует повторных истончение перед каждой сессии изображений, что делает его непригодным для GBM инъекции клеток и визуализация начала глиомы на ежедневной основе. В отличие от портов окно позволяет нам выполнять GBM инъекции клеток из части окна, которая сводит к минимуму повреждение тканей мозга, а также позволяет для выполнения изображений с высоким разрешением сразу после создания окна. InfРеформации на глиомы инициирования могут быть собраны в течение первых нескольких недель после GBM инъекции клеток, что является ключевым преимуществом по сравнению с открытым способом черепа для этого типа исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Грант и Мэн Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | Sarstedt Ltd | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
References
- Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
- Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
- Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
- Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
- Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
- Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
- Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
- Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
