Et værktøj og kemier er beskrevet til sekventielt isolere nukleinsyrer efterfulgt af proteiner fra en prøve uden behov for elektricitet. Værktøjet består af en sorbent holdes i en overførsel pipette, mens isolering kemiske er baseret på fastfase-ekstraktion principper. De isolerede makromolekyler kan analyseres ved immuno-baserede og PCR-baserede assays.
Traditionelle og nye patogener såsom enterohæmoragisk Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, eller prion-baserede sygdomme er af stor bekymring for regeringer, industrier og læger verden over. For eksempel er EHECs kombineret med Shigella og ansvarlig for dødsfald på omkring 325.000 børn hvert år, og er særligt udbredt i udviklingslandene, hvor laboratorie-baseret identifikation, udbredt i USA, er ikke tilgængelig 1. Den udvikling og distribution af lave omkostninger, kan felt-baserede, point-of-care værktøjer til at hjælpe med hurtig kortlægning og / eller diagnose af patogener eller sygdomme markører dramatisk ændre sygdomsprogression og patient prognose. Vi har udviklet et værktøj til at isolere nucleinsyrer og proteiner fra en prøve ved fastfase-ekstraktion (SPE) uden elektricitet eller tilhørende laboratorieudstyr 2. De isolerede makromolekyler kan anvendes til diagsis enten i fremadgående laboratorium eller ved hjælp af felt-baserede point-of-care platforme. Vigtigere er denne fremgangsmåde tilvejebringer direkte sammenligning af nukleinsyre og protein data fra en ikke-spaltet prøve giver en statistisk ved bekræftelse af genomiske og proteomik analyse.
Vores isoleret værktøj anvender standard for fastfase-nukleinsyre isoleret BOOM teknologi, som isolerer nukleinsyrer fra et chaotropt salt-opløsning, sædvanligvis guanidinisothiocyanat, ved binding til silica-baserede partikler eller filtre 3. CUBRC navnebeskyttede fastfase-ekstraktion kemi anvendes til at oprense proteinet fra chaotrope saltopløsninger, i dette tilfælde fra affald eller flow-igennem efter nukleinsyreisolering 4.
Ved emballering velkarakteriseret kemier i en lille, billig og enkel platform har vi skabt en bærbart system til nukleinsyre og protein ekstraktion, som kan udføres under en variety betingelser. De isolerede nukleinsyrer er stabile og kan transporteres til en stilling, hvor strømmen er til rådighed for PCR-amplifikation, medens proteinindholdet umiddelbart kan analyseres ved håndholdt eller andre immunologiske assays. Den hurtige identifikation af sygdom markører i området i væsentlig grad kan ændre patientens resultat ved at dirigere den rette løbet af behandlingen på et tidligere stadium af sygdomsprogression. Værktøjet og fremgangsmåden beskrevet er egnede til anvendelse med praktisk talt enhver infektiøse agens og giver brugeren redundans af multi-makromolekylet typen analyser og samtidig reducere deres logistiske belastning.
Værktøjet, kemier og protokollen beskrevet i denne rapport repræsenterer den første kendte eksempel på en el-fri, multi-makromolekyle ekstraktion, der kan anvendes i felten, point-of-care anvendelser. Begge makromolekyle typer kan anvendes til en række efterfølgende diagnostiske eller analytisk udstyr. For eksempel er de isolerede nukleinsyrer PCR kvalitet (fig. 2 og 3), medens proteinet komponent af prøven er immunoreaktive (figur 4). Udnyttelsen af dette udsugningssystem i barske eller ressource begrænsede områder i verden kunne drastisk reducere sygdomsbyrden for de befolkninger, der lever der. Dette udsugningssystemet kan også hjælpe med sygdomsovervågning programmer i hele verden ved at give en robust og hurtig og omkostningseffektiv metode til at prøve behandling i barske eller fjerntliggende steder.
Et vigtigt aspekt ved ekstraktion fremgangsmåde beskrevet ovenfor er, atDet kan modificeres af brugeren. For eksempel i tilfælde, hvor prøven er større eller mindre end de oprindelige 500 μLs (trin 1.2) kan brugeren justere mængden af reagenserne i overensstemmelse hermed. Dvs., det volumetriske forhold mellem reagenserne til prøvens størrelse bør forblive konstant, medens de absolutte mængder kan ændres. Desuden kan ændringer i antallet af passager over adsorbenten også gøres ved brugerens skøn. For eksempel, hvis en større prøvevolumen anvendes lede prøven gennem sorberende flere gange, end der er anført (trin 2.4 og 3.3) vil øge sandsynligheden for makromolekylet type (nucleinsyre eller protein) kontakt mellem sorbenten. Stigningen i passager bør øge fange effektiviteten indtil sorbent mætning er nået.
Vi har fundet, at udvinding værktøjet og tilhørende kemier har nogle begrænsninger, den vigtigste af dem er, at proteinekstraktion kemi er ineffektiv til udvinding af stærkt glykosyleretproteiner. I tilfælde af at den nedstrøms diagnostiske målretter et glycosyleret protein, kan dette system ikke er ideel til identifikation. Derudover er de øvre og nedre grænser for ekstraktions effektivitet for enten nukleinsyrer eller proteiner stadig bestemmes, og optimering er i gang for at maksimere genvinding effektivitetsgevinster. Videreudvikling af værktøjet vil overvinde disse eksisterende huller i vores viden.
The authors have nothing to disclose.
Støtte til udvikling af udvindingen pipette blev givet i en del af en intern forskning og udvikling tilskud til DRP.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
BSA | Sigma | A-4503 |