Summary
כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.
Abstract
פתוגנים מסורתיים ומתפתחים כגון Escherichia coli Enterohemorrhagic (EHEC), pestis Yersinia, או הפריון מבוססי מחלות הם דאגה משמעותית עבור ממשלות, תעשיות ואנשי מקצוע רפואיים ברחבי העולם. לדוגמה, EHECs, בשילוב עם Shigella, אחראים למותם של כ 325,000 ילדים בכל שנה, והם נפוצים במיוחד בעולם המתפתח בו מעבדה מבוססי זיהוי, נפוץ בארצות הברית, אינו זמין 1. פיתוח והפצה של עלות נמוכה, בתחום מבוססות, הצבע של טיפול כלים כדי לסייע בזיהוי מהיר ו / או אבחון של פתוגנים או סמני המחלה יכולים לשנות באופן משמעותי את התקדמות המחלה ואת הפרוגנוזה לחולה. פיתחנו כלי לבודד חומצות גרעין וחלבונים ממדגם על ידי מיצוי מוצק שלב (SPE) ללא חשמל או הקשורים ציוד מעבדה 2. מקרומולקולות את מבודדות יכול לשמש diagnoSIS או במעבדה קדימה או באמצעות מבוססי בשדה נקודות של טיפול פלטפורמות. חשוב לציין כי שיטה זו מספקת לצורך השוואה ישירה של חומצות גרעין חלבון נתונים ממדגם בלתי מפוצלת, מציע ביטחון דרך אישורו של ניתוח גנטי ו proteomic.
כלי הבידוד שלנו מנצל את תקן התעשייה עבור בידוד מוצק בשלב חומצות גרעין, הטכנולוגיה בום, המבודד חומצות גרעין מפתרון מלח chaotropic, בדרך כלל isothiocyanate guanidine, באמצעות קשירה סיליקה מבוססי חלקיקים או מסננים 3. מוצק בשלב כימיה הקניינית של CUBRC החילוץ משמש לטיהור חלבונים מפתרונות מלח chaotropic, במקרה זה, מפסולת או זרימת-thru בעקבות בידוד חומצות גרעין 4.
לפי האריזה היטב מאופיין chemistries לפלטפורמה קטן, זול ופשוט, אנו יצרו מערכת ניידת של חומצות גרעין להפקת חלבון זה יכול להתבצע תחת variety של תנאים. חומצות גרעין מבודדים יציבים יכול להיות מועבר למצב שבו הכוח זמין עבור הגברה PCR בעוד תכולת החלבון יכול להיות מנותח באופן מיידי על ידי כף יד או אחרים של מערכת החיסון מבוסס מבחני. זיהוי מהיר של סמני המחלה בתחום יכול לשנות באופן משמעותי את התוצאה של המטופל על ידי הפניית כמובן נכון של הטיפול בשלב מוקדם יותר של התקדמות המחלה. כלי בשיטה המתוארת מתאימים לשימוש עם כל גורם כמעט זיהומיות ולהציע למשתמש יתירות של רב מקרומולקולה ניתוחים מסוג תוך צמצום הנטל הלוגיסטי שלהם.
Protocol
1. לדוגמא תמוגה
- דוגמאות צריך להיות במצב נוזלי. אם המדגם הוא מוצק, מזון למשל, או שרפרף, המדגם צריך להיות תלוי מדיה נוזל כמו מים או פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
- מערבבים 500 μL המדגם עם μL 500 של Thiocyanate Guanidine 6M (pH 6.5) בצינור 1.5 מ"ל.
- לדכא את הנורה של פיפטה חילוץ, לגרש את האוויר הסביבה.
- משוך את המדגם כל 1 מ"ל לתוך פיפטה חילוץ, על החומר הסופג, בכך שהוא מאפשר הנורה לאט להרחיב.
- להפוך את כלי החילוץ כך את החרוזים sorbent ומסננים מדגם לתוך הנורה.
- טוחנים את החרוזים sorbent עם מדגם של הנורה נזהרים שלא לגרש את המדגם מתוך פיפטה החילוץ.
2. חומצה הפקת גרעין (איור 1, לוח)
- הפוך פיפטה חילוץ (פתיחה כלפי מטה) ולגרש את המדגם לתוך הצינור המקורי 1.5 מ"ל. <li> משוך את המדגם כל 1 מ"ל לתוך פיפטה חילוץ, חולפת על פני sorbent, בשיעור מתון, נזהרת לשמור sorbent בצוואר של פיפטה החילוץ.
- לגרש את המדגם כולו לתוך צינור 1.5 מ"ל מדכא את הנורה.
- חזור על שלבים 2.2 ו -2.3, עובר את המדגם על פי ארבעה sorbent יותר עבור סכום כולל של 5 כרטיסים.
- לאחר המעבר על פני 5 sorbent, לגרש את המדגם כל 1 מ"ל לתוך 4mL מאגר חלבון החילוץ (בצינור מ"ל 15 חרוטית), לסגור את הצינור, ומניחים בצד לשימוש מאוחר יותר.
- לשטוף את חומצות גרעין מבודדים על ידי העברת 1 מ"ל של אתנול 95% במהלך שלוש פעמים sorbent, חוזר אתנול לצינור המקורי על המעבר הסופי.
- חזור על שלב 2.6 באמצעות מ"ל 2 1, לשטוף אתנול 95%.
- לחץ ושחרר את הנורה במשך 5 דקות, עובר באוויר הסביבה ברחבי פיפטה החילוץ לייבש את חומצות גרעין / מיטה sorbent. נגב אתנול שיורית מקצה פיפטה החילוץ uלשיר Kimwipe.
- לשחזר את חומצות גרעין על ידי העברת 250 μL של 10 mM Tris (pH 6.8) במהלך חמש פעמים sorbent. מאגר טריס יכול להיות מוחלף על ידי פתרון אחר כל מימית מתאים כגון PBS. הפתרון שהתקבל מכיל את חומצות גרעין שחולצו.
3. הפקת חלבון (תרשים 1, לוח ב ')
- מערבבים את המדגם והפקת חלבון צינור המאגר משלב 2.5 ידי היפוך ולהעביר כ 2-3 מ"ל של מדגם זה 5 מ"ל מעל sorbent של טפטפת החילוץ החדשה.
- לגרש את המדגם כולו לתוך הצינור אותו חרוטי 15 מ"ל נזהר לשמור sorbent בצוואר של פיפטה החילוץ.
- חזור על שלבים 3.1 ו -3.2, עובר את המדגם על פי 15 sorbent.
- לשטוף sorbent ואת החלבון מחויב להעביר 1 מ"ל של אתנול 95% מעל המיטה sorbent שלוש פעמים, אתנול ולהוציא לתוך הצינור המקורי.
- חזור על שלב 3.4 באמצעות מ"ל 2 1, לשטוף אתנול 95%.
- לחץ ושחרר את הנורה במשך 5 דקות, עובר באוויר הסביבה ברחבי פיפטה החילוץ לייבש את החלבון / המיטה sorbent. נגב אתנול שיורית מקצה פיפטה החילוץ באמצעות kimwipe.
- לשחזר את החלבון על ידי העברת 250 μL של PBS על פי חמישה sorbent. מאגר PBS יכול להיות מוחלף על ידי פתרון אחר כל מימית מתאים כגון 10 mM Tris (pH 6.8). הפתרון שהתקבל מכיל את תכולת החלבון של המדגם.
באיור 1.
איור 2.
איור 3.
באיור 4.
איור 5.
Representative Results
בידוד חומצות גרעין: חומצות גרעין הן מבודדות PCR amplifiable וללא זיהום חלבון.
דוגמה 1: חומצות גרעין שנמצאו מתאימים לשימוש ב PCR יישומים מבוססי. לדוגמה, תרשים 2 מציג הגברה של גנים Shiga הרעלן הקשורים Enterohemorrhagic א ' coli O157: H7 המתח אדי-933 (ATCC # 35150) מההליך חומצה / חלבון גרעין החילוץ באמצעות פיפטה החילוץ. גנים את הרעלן Shiga stx 1 ו 2 stx נמצאים על bacteriophage למבדה כמו ממוזג ופגום bacteriophage זו ואחרות Enterohemorrhagic א ' קולי זנים הנתון לשליטתו של היזם P R 5 6 7 8. ההפעלה של התגובה SOS ב א coli גורם prophage ואינדוקציה / או ייצור הרעלן 9. שמנו מנוצל גירסה שונה של assay PCR מרובב על ידי פנג et al. 11 לזהות stx 1 ו - 2 גנים stx בתרבות והן דגימות שפכים חדים. מסלולים A ו-B באיור 2 מראים את התוצאות של הגברה PCR מדגם תרבות מעובד (מסלול) ו מדגם תרבות מעובד (מסלול ב '). תוצאות אלו משמעות זהה כמעט אין אובדן הנאמנות של חומצות גרעין מעובדים או מבודד. אנו מוגבר הבא ביוב גולמי המחודד (נתיב ד ') או חומצות גרעין מבודדים מן הביוב המחודד (נתיבי E & F). נתונים אלו מעידים כי חומצות גרעין בודדים הביא הגברה גדולה יותר לעומת הלא מבודדים חומצות גרעין מ דגימות שפכים חדים. לפיכך, אנו מסיקים כי בין אם מעכבי ה-PCR נמצא באופן טבעי הביוב הוסרו על בידוד או חומצות גרעין רוכזו על הבידוד. השילוב של שני אלה השערות הוא גם אפשרי.
ספקטרוסקופיה אולטרה סגול שימש הבא כדי להראות את חומצות גרעין בודדים היו חופשיים יחסית Oחלבון ו מזהם. איור 3 מציג את ספקטרום UV של 2 א ' coli O157: H7 גרעין חומצה עקירות, בידוד שכותרתו א 'וב' בידוד, לעומת הספקטרום מנורמל של התרבות חיידקים, שכותרתו בידוד מראש. ספקטרום UV של חומצות גרעין מבודדים דומה את הספקטרום של חומצות גרעין טהור, בעל היחס מחושב של ספיגת בין 260 ננומטר ו -280 ננומטר המתקרבים 1.8 10. נתונים אלו מראים כי יש מעט מאוד חלבון זיהום בשבריר חומצות גרעין התאושש תוך שימוש בטכניקה המתוארת.
בידוד חלבון: חלבון התאושש הניסוי חומצה / חלבון גרעין הבידוד הוא immunoreactive וזהה electrophoretically לחלבון טהור.
דוגמא 2: חלק החלבון המבודד היה מוחל על ה RapidChek קולי O157 לרוחב תזרים assay רצועות (SDIX, Inc). בקרת להראות הזדהות חיובית בכל דגימות מחסה א ' coli O157, עם או בלי אינדוקציה STX (איור 4, נתיבי B ו-C, בהתאמה). הנתונים גם מראים איור 4 תוצאות חיוביות עבור אותם דגימות מחסה א ' coli O157 שעובדו על חומצות גרעין ולאחר מכן חלבון בעזרת פיפטה החילוץ. נתונים אלו מראים כי חלבון מבודד מכל מדגם הוא immunoreactive ובכך מפעילה תגובה חיובית.
הגברה PCR (כמתואר דוגמה 1) בוצע על דגימות חלבון להראות כי חלק החלבון המבודד היה נטול זיהום חומצות גרעין. את התוצאות של ניסויים אלה היו שליליות על ידי ג'ל אלקטרופורזה. לכן, אנו מגיעים למסקנה כי תכולת החלבון המדגם הופרד זיהום חומצות גרעין. תוצאות אלו, נלקח עם כל אלה תיאר את המופע צעד בידוד גרעין חומצה כי חומצות גרעין ותוכן חלבון מבודדים צעדים שהכינו.
t "> דוגמה 3:. חלבון מבודד מתאים אלקטרופורזה 10 איור 5 מתאר coomassie מוכתם ג'ל acrylamide 8% עמוסה BSA (איור 5, נתיבי & C) BSA מבודד isothiocyanate guanidine 6M באמצעות מיצוי פיפטה הקשורים פרוטוקול. ניידות electrophoretic של חלבון מבודד זהה לזה של דגימות בקרה. כך אנו מסיקים כי תהליך החילוץ אינו משנה את מבנה קוולנטי של חלבון מבודד.
איור 1, פאנל: תיאור של הליך מיצוי טיפוסי גרעין חומצה המדגם הוא מעורבב עם thiocyanate guanidine 6M בצינור המדגם עברו במהלך חמש פעמים sorbent.. לאחר המעבר האחרון, מדגם מתווסף למאגר מיצוי חלבון. חומצות גרעין sorbent ואת כפות נשטפים פעמיים עם אתנול. המדגם הוא אז באוויר DRied ו eluted מ sorbent.
תרשים 1, לוח ב ': תיאור של הליך חלבון אופייני החילוץ מדגם מעורבב עם מאגר חלבון במנותק שלב 1, איור 1, פאנל הוא חלף על פני sorbent של טפטפת ממוצא 2 15 פעמים.. המשך התהליך זהה לזה של פרוטוקול חומצות גרעין החילוץ.
איור 2:. תמונה שלילית של ברומיד צבעונית ethidium agarose ג'ל מרובב Shiga רעלן 1 ו 2 הגברה ניסוי גנטי בוצע באמצעות דגימות תרבות נתיבים (A ו-B) או דוגמאות שפכים גולמיים מעוטרות א ' coli O157: H7 (נתיבי D, E ו-F). הדגימות היו או להוסיף ישירות לצינור התגובה PCR (נתיבי A ו-D) או את הדוגמאות עובדו באמצעות proces בידודs ואת חומצות גרעין שחולצו נוספו צינור התגובה PCR (דוגמאות B, E ו-F). פרוטוקול ה-PCR היא שינוי של 1 תיאר פנג ואח' 11. שינוי שלנו ממוקד רק אלה מוגבר על ידי stx 1 (הלהקה התחתון) ו stx 2 (הלהקה העליון) זוגות פריימר, שומטת את כל זוגות פריימר אחרים. ליין C הוא סולם מ 1KB BioRad.
איור 3: תוצאות ספקטרוסקופיה UV של א ' coli O157: H7 חומצות גרעין בודד באמצעות פיפטה החילוץ דיווחו על חומצות גרעין בודדים מסומנים בידוד A ו-B בידוד.. ספקטרום UV של המדגם נבדק גם לפני מיצוי חומצות גרעין מתויג מראש בידוד. ספקטרום התקבלו באמצעות U3010 Hitachi ספקטרופוטומטר חבילת הקשורים תוכנה.
איור 4:. צילום צבע של רצועות הבדיקה RapidChek תוכן החלבון של דגימות בשימוש בתרשים 2 היה מבודד באמצעות פיפטה החילוץ ונבדקו על תגובתיות-חיסונית על ידי assay הזרימה לרוחב. נתיבי AC הם פקדים לא מעובדים, כלומר, תרבית תאים זה התווסף פס הבדיקה ללא חומצות גרעין או מיצוי חלבון. ליין הוא ה קולי BL21 DE3 pLysS כביקורת שלילית, Lanes B ו-C הצג E. coli O157: H7, כי היה מטופל (ב), או שטופלו mitomycin C למשך 4 שעות (C). מסלולים ד עד h להראות את התוצאות של הוספת חלבון המופק על מקלוני הבדיקה לרוחב הזרימה. נתיבי D ו-E נבדקו באמצעות תמצית חלבון מן ה coli BL21 DE3 pLysS או בלי (ד ') או עם mitomycin C טיפול (ה) לצורך ביקורת שלילית. נתיבי FH להציג את התוצאות כאשר חלבון המופק מן ה coli O157: H7 היה בשימוש. חלבון היה שחולצו מן מטופל (F), או משעה 2 (ג) או 4 שעות (H) mitomycin תרבויות ג שטופלו.תוצאות חיוביות לייצר קו אדום כפול.
איור 5:. צילום צבעונית Coomassie SDS-PAGE BSA היה מבודד מן הפתרון באמצעות פיפטה החילוץ ופרוטוקולים המתוארים. מסלולים A ו-C הם נתיבים שליטה של 250 מיקרוגרם / מ"ל ו - 500 מיקרוגרם / מ"ל בהתאמה. נתיבי B ו-D מתארים BSA התאושש פתרונות המכילים ריכוז זהה בקרות בהתאמה.
Discussion
, הכלי chemistries והפרוטוקול המתוארים בדוח זה מייצגים את הדוגמה הידועה הראשונה של מערכת החשמל ללא רב מקרומולקולה, חילוץ, כי יכול להיות מנוצל בתחום מבוססות, הצבע של טיפול יישומים. שני הסוגים מקרומולקולה ניתן ליישם במספר מכשירי אבחון אנליטי או במורד הזרם. כך, למשל, חומצות גרעין בודדים הם בעלי איכות PCR (תרשים 2 ו - 3) ואילו מרכיב החלבון של המדגם הוא immunoreactive (איור 4). ניצול של מערכת זו החילוץ באזורים מוגבלים צנועים או משאב של העולם יכול להפחית באופן דרסטי את נטל המחלה על אוכלוסיות המתגוררות שם. מערכת השאיבה יכולה גם לסייע מעקב תוכניות מחלות ברחבי העולם על ידי מתן השיטה היעילה חזקים עדיין מהיר עלות עיבוד המדגם במקומות צנועים או מרוחק.
היבט אחד חשוב שיטת החילוץ שתואר לעיל הוא כיזה יכול להיות שונה על ידי המשתמש. לדוגמה, במקרים שבהם גודל מדגם גדול יותר או פחות מ -500 μLs הראשונים (שלב 1.2), המשתמש יכול להתאים את כמויות של חומרים כימיים בהתאם. כלומר, היחס בין נפח של ריאגנטים את גודל המדגם צריך להישאר קבוע, בעוד כמויות מוחלטות ניתן לשנות. כמו כן, התאמות במספר קטעים מ sorbent יכול להיות גם על פי שיקול דעתו של המשתמש. לדוגמה, אם נפח דגימה גדול יותר משמש, להעביר את המדגם על פני יותר פעמים מאשר sorbent הרשומים (שלבים 2.4 & 3.3) יגדיל את הסיכוי של סוג מקרומולקולה (חומצת גרעין או חלבון) קשר sorbent. הגידול קטעים צריך להגדיל את יעילות ללכוד עד רוויה sorbent הוא הגיע.
מצאנו כי הכלי כריה chemistries הקשורים יש מספר מגבלות, המשמעותי ביותר מהם הוא כי כימיה מיצוי החלבון אינה יעילה להחלמה של glycosylated ביותרחלבונים. במקרה של אבחון במורד מטרות חלבון glycosylated, מערכת זו לא יכול להיות אידיאלי עבור זיהוי. בנוסף, הגבולות העליונים והתחתונים של יעילות מיצוי לאף חומצות גרעין או חלבונים עדיין נקבע, ואופטימיזציה מתנהלת על מנת למקסם את יעילות השיקום. פיתוח נוסף של הכלי יהיה להתגבר על פערי ידע הנוכחיים.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
מימון לפיתוח פיפטה החילוץ נמסר בחלקו על ידי מחקר פנימי מענק פיתוח הוענק DRP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
- Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).
- Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. Method and Device for Isolating a Protein Sample. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).
- O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science. 226, 694-696 (1984).
- Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain. Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).
- Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages. DNA Research. 6, 141-143 (1999).
- Ptashne, M. A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Feng, P., Monday, S. R. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).
