Summary
Bir aracı ve kimyalarına sırayla elektrik için gerek olmaksızın bir numuneden proteinler tarafından takip nükleik asitler izole etmek için tarif edilmiştir. Aracı izolasyon kimyaları katı-faz ekstraksiyon ilkelere dayalı iken bir transfer pipeti içinde düzenlenen bir sorbent oluşur. İzole makromoleküller immüno-bazlı ve PCR bazlı analizleri ile analiz edilebilir.
Abstract
Böyle Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis veya prion tabanlı hastalıklar gibi geleneksel ve gelişmekte olan patojenler hükümetler, sanayi ve dünya çapında tıbbi profesyoneller için önemli bir endişe vardır. Örneğin, Shigella ile birlikte EHECs, yaklaşık 325.000 çocuk her yıl ölümünden sorumlu olan ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yaygın laboratuar tabanlı kimlik, 1 kullanılamaz gelişmekte olan dünyada, özellikle yaygındır. Düşük maliyet geliştirme ve dağıtım, patojenler ya da hastalık belirteçleri hızlı bir şekilde tespit ve / veya tanısında yardımcı olması için alan bazlı, nokta-bakım araçlarıyla önemli ölçüde hastalığın ilerlemesine ve hastanın prognozunu değiştirebilir. Biz elektrik ya da ilgili laboratuar ekipmanları 2 olmadan katı-faz ekstraksiyon (SPE) tarafından örnek bir nükleik asitlerin ve proteinlerin izole etmek için bir araç geliştirdik. İzole makromoleküller tan için kullanılabilirileri laboratuar veya alan bazlı noktası bakım platformları kullanarak ya da sis. Önemli olarak, bu yöntem genomik ve proteomik analizi ile teyit güven sunan, nükleik asit ve bir un bölünmüş numuneden proteini verilerin doğrudan bir karşılaştırma için sağlamaktadır.
Bizim izolasyon aracı silika bazlı parçacıkları veya filtreler 3 bağlanarak yoluyla chaotropic tuz çözeltisi, genellikle guanidin izotiyosiyanat, nükleik asitlerin izole katı faz nükleik asit izolasyonu için endüstri standardı, BOOM teknolojisi kullanır. CUBRC tescilli katı-faz ekstraksiyon kimyası nükleik asit izolasyonu 4 takiben atık veya akış-thru gelen, bu durumda, chaotropic tuz çözeltileri protein arındırmak için kullanılır.
Ambalaj tarafından küçük, ucuz ve basit bir platform haline kimyaları iyi karakterize, biz var altında yapılabilir nükleik asit ve protein ekstraksiyonu için taşınabilir bir sistem yarattıkoşullar iety. İzole nükleik asitler stabildir ve protein içeriği hemen tutulan elle veya diğer immünolojik bazlı analizleri ile analiz edilebilir, güç PCR amplifikasyonu için mevcut olan bir pozisyona taşınabilmektedir. Alanda hastalık belirteçlerinin hızlı tespiti önemli hastalığın ilerlemesi daha erken bir aşamada tedavi uygun ders yönlendirerek hastanın sonucu değiştirebilir. Tarif aracı ve yöntemi hemen her enfeksiyöz ajan ile kullanım için uygundur ve aynı zamanda onların lojistik yükünü azaltırken, kullanıcı çoklu makromolekül tip analizlerin artıklık sunuyoruz.
Protocol
1. Örnek Lizis
- Örnekler sıvı formda olmalıdır. Örnek katı ise, örneğin gıda ve dışkı için, örnek salin (PBS) tamponlu su ya da fosfat gibi bir sıvı ortam içinde süspansiyona edilmelidir.
- 1.5 ml tüp 6M Guanidin Tiyosiyanat (pH 6.5) 500 uL ile örnek 500 uL karıştırın.
- Hava def, bir ayıklama pipet ampul bastırın.
- Ampul yavaş yavaş genişletmek için izin vererek, emici malzeme üzerinde, ekstraksiyon pipet içine tüm 1 mL örnek çekin.
- Çıkarma aleti gibi ters çevirin ki sorbent boncuk ve ampul içine örnek drenaj.
- Ekstraksiyon pipet dışarı örnek çıkarmak için dikkatli olmak ampul örneği ile sorbent boncuklar Grind.
2. Nükleik asit ekstraksiyon (Şekil 1, panel A)
- Ekstraksiyon pipet (aşağı doğru açılması) ters çevirin ve orijinal 1.5 mL tüpüne örnek çıkarmak. <li> ekstraksiyon pipet boyun sorbent tutmak için dikkatli olmak, ılımlı bir hızda, sorbent üzerinden geçen, ekstraksiyon pipet içine tüm 1 mL örnek çekin.
- Ampul bastırarak 1.5 ml tüp içine tüm örneklem boşaltınız.
- 5 geçişten toplam sorbent dört kez daha fazla örnek geçen, adımları 2.2 ve 2.3 tekrarlayın.
- Sorbent üzerinde beşinci geçiş sonra, protein ekstraksiyon tamponu (15 ml konik tüp olarak) 4ml içine tüm 1 mL örnek çıkarmak, tüp kapatın ve daha sonra kullanmak üzere kenara koyun.
- Nihai geçit üzerine orijinal tüp etanol dönen, sorbent üç kez% 95 etanol 1 ml geçerek izole nükleik asitler yıkayın.
- Ikinci bir 1 ml,% 95 etanol yıkama kullanarak 2.6 adımı yineleyin.
- Basın ve nükleik asitler / sorbent yatak kurumaya ekstraksiyon pipet boyunca hava geçerken, 5 dakika ampul bırakın. Ekstraksiyon pipet u ucundan kalan etanol WipeBir Kimwipe şarkı.
- Sorbent beş defadan fazla 10 mM Tris (pH 6,8) 250 uL geçerek nükleik asitler kurtarın. Tris tampon gibi PBS gibi herhangi bir başka uygun bir sulu çözeltisi ile değiştirilebilir. Meydana gelen çözelti, ayıklanan nükleik asitleri içerir.
3. Protein Ekstraksiyonu (Şekil 1, B Paneli)
- Inversiyon adım 2.5 'dan örnek ve protein ekstraksiyon tamponu tüp karıştırın ve yeni bir çıkarma pipet sorbent üzerinden bu 5 ml numune yaklaşık iki ila üç mililitre geçmektedir.
- Ekstraksiyon pipet boyun sorbent tutmak için dikkatli olmak aynı 15 mL konik boru içine tüm örneklem boşaltınız.
- Sorbent 15 defadan fazla örnek geçen, adımları 3.1 ve 3.2 tekrarlayın.
- Sorbent yatağın üzerinde üç kez, bu kadar özgün tüpüne çıkarırken etanol% 95 etanol 1 ml geçerek sorbent ve bağlı protein yıkayın.
- Ikinci bir 1 ml,% 95 etanol yıkama kullanarak 3.4 adımı yineleyin.
- Basın ve protein / sorbent yatak kurumaya ekstraksiyon pipet boyunca hava geçerken, 5 dakika ampul bırakın. Bir kimwipe kullanılarak ekstraksiyon pipet ucundan kalan etanol silin.
- Sorbent beş kat fazla PBS 250 uL geçerek protein kurtarın. PBS tamponu gibi 10 mM Tris (pH 6.8) gibi herhangi bir başka uygun bir sulu çözeltisi ile değiştirilebilir. Meydana gelen çözelti, örneğin, protein içeriği içerir.
Şekil 1..
Şekil 2.
Şekil 3.
Şekil 4.
Şekil 5.
Representative Results
Nükleik Asit İzolasyon: İzole nükleik asitlerin PCR amplifiable ve protein kontaminasyon ücretsizdir.
Örnek 1: kurtarılmış nükleik asitler PCR bazlı uygulamalarda kullanım için uygundurlar. Örneğin, Şekil 2 ile ilişkili Enterohemorrhagic E. shiga toksini genlerinin büyütülmesi gösterir coli O157: ekstraksiyon pipet kullanarak bir nükleik asit / protein ekstraksiyon usul H7 suşu EDL-933 (ATCC # 35150). Shiga toksin genleri stx 1 ve 2 stx Bu ve diğer Enterohemorrhagic E. ılıman lambda benzeri bakteriyofaj ve kusurlu bakteriyofaj bulunur P R organizatörü 5 6 7 8 kontrolü altında coli. E. SOS tepkisinin aktivasyonu coli indüksiyonu ve / ya da toksin üretimi 9 profaj yol açar. Biz Feng ve arkadaşları tarafından çoğaltılmış PCR değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmıştır ettik. 11 kültür ve çivili kanalizasyon örneklerinde hem stx stx 1 ve 2 genleri tanımlamak için. Şeritlerinin Şekil 2'de A ve B, bir işlenmemiş kültürü örneği (şeritli A) bir PCR büyütmesi ve işlenmiş bir kültür örneği (şerit B) sonuçlarını göstermektedir. Bu sonuçlar hemen hemen aynı anlamı olan işlenmiş veya izole nükleik asitlerin aslına kaybı yoktur. Önümüzdeki çivili ham kanalizasyon (şerit D) ya da kirpi kanalizasyon izole edilen nükleik asitler (şerit E & F) çoğaltıldı. Bu veriler, izole nükleik asitler kirpi lağım örnekleri non-izole nükleik asitler karşı daha büyük bir amplifikasyon yol açtığını göstermektedir. Bu nedenle doğal kanalizasyon bulunan PCR inhibitörleri ya izolasyonu üzerine kaldırılmış olduğunu veya nükleik asitlerin izolasyonu üzerine yoğunlaşmıştır sonucuna vardık. Bu iki hipotez bir kombinasyonu da mümkündür.
Ultraviyole spektroskopisi sonraki izole nükleik asitler görece özgür olduğumuzu göstermek için kullanılan of kontamine protein. Şekil 3 İki E. UV spektrumları gösterir coli O157: H7 nükleik asit ekstraksiyon, etiketli bir izolasyon ve yalıtım, b öncesi izolasyon etiketli bakteriyel kültür normalize spektrum göre. İzole nükleik asitlerin UV spektrumu 260 nm ve 1,8 10 yaklaşırken 280 nm arasındaki bir absorbans hesaplanan oranına sahip olan saf bir nükleik asitlerin spektrumları benzemektedir. Bu veriler, açıklanan yöntem kullanılarak elde edilen nükleik asitin fraksiyonu içinde çok az protein kirletici olduğunu göstermektedir.
Protein İzolasyon: nükleik asit / protein izolasyonu deney Kurtarıldı protein immunoreaktif ve saf protein elektroforetik aynıdır.
Örnek 2: izole protein parçası RapidChek E. uygulanmıştır coli O157 yanal akış testi şeritler (SDIX, Inc.) Kontroller E. barındıran tüm örneklerde pozitif bir kimlik göstermek coli Veya STX indüksiyon (Şekil 4, sırasıyla, şerit B ve C), olmadan O157,. Şekil 4'te veriler de E. barındıran bu numuneler için olumlu sonuçlar ekstraksiyon pipet kullanılarak nükleik asitlerin ve daha sonra protein için işlendi coli O157. Bu veriler, her numuneden izole proteini ve böylece bir pozitif tepki tetikleme immünoreaktif olduğunu göstermektedir.
PCR amplifikasyonu (Örnek 1 'de açıklandığı gibi) izole edilmiş protein fraksiyonu nükleik asitler kirletici yoksun olduğunu göstermek için protein numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler için sonuçlar jel elektroforezi bütün negatifti. Böylece, örnek protein içeriği nükleik asitler karışmasını ayrıldı sonucuna vardık. Bu sonuçlar, nükleik asitlerin ve protein içeriği ayrı bir fraksiyonlara ayırma aşamada izole edilmektedir ki nükleik asit tecrit adım göstermek için tarif edilenler ile bütün olarak alınmıştır.
t "> Örnek 3:. izole protein elektroforezi 10 için uygun olan Şekil 5, bir Coomassie ekstraksiyon pipet kullanılarak ve ilişkili 6M guanidin izotiyosiyanat izole BSA (Şekil 5, şerit A ve C) ve BSA ile yüklenir 8% akrilamid jel boyanmış tasvir protokolü. izole protein elektroforetik mobilite kontrol örnekleri ile aynıdır. Biz böylece çıkarma işlemi izole protein kovalent yapısını değiştirmez sonucuna vardık.
Şekil 1, Panel A: Tipik bir nükleik asit ekstraksiyon prosedürü tasviri örnek örnek tüp içinde 6M guanidin tiyosiyanat ile karıştırılır ve sorbent beş kat üzerinden geçirilir.. Son bir geçişten sonra, numune proteini ekstraksiyon tamponu ilave edilir. Sorbent bağımlı ve nükleik asitlere etanol ile iki kez yıkanır. Örnek sonra hava dısrarcıyız ve emici gelen elüt.
Şekil 1, Panel B: tipik bir protein ekstraksiyon prosedür Tasvir adım 1, Şekil 1, bir ikinci bir ekstraksiyon pipetle 15 kat emici üzerinden geçer panelinden proteinin izole tamponu ile karıştırılır Örnek.. Prosedürün kalanı nükleik asit ekstraksiyon protokolü ile aynıdır.
Şekil 2:. Bir etidyum bromür ile boyanan agaroz jel Negatif resmi bir çoğaltılmış shiga toksin 1 ve 2 gen amplifikasyonu deney E. ile çivili kültür örnekleri (şerit A ve B) veya ham kanalizasyon örnekleri kullanılarak yapıldı coli O157: H7 (şerit D, E ve F). Örnekleri, ya doğrudan bir PCR reaksiyonu tüp (şeritlerinin A ve B) veya örnekleri ilave edildi izolasyonu süreç ile işlendis ve ekstre nükleik asitler PCR reaksiyonu tüp (Örnekler B, E ve F) ilave edildi. PCR protokolü Feng ve ark 11 tarafından tarif birinin bir modifikasyonudur. Bizim modifikasyon diğer tüm primer çiftleri bırakıp sadece stx 1 (alt bant) ve stx 2 (üst bant) primer çiftleri ile çoğaltıldı bu hedef. Lane C BioRad gelen 1 kB'lık merdiven.
Şekil 3: E. UV spektroskopi sonuçları coli O157: H7 nükleik asitler bildirilen ekstraksiyon pipet kullanılarak izole izole nükleik asitlerin izolasyonu ve izolasyon b etiketlenir.. Numunenin UV spektrumu da önceden nükleik asit çıkarımı ile test edildi ve pre-izolasyonu etiketlenmiştir. Spektrası, bir Hitachi U3010 spektrofotometre ile ilgili yazılım paketi kullanılarak elde edilmiştir.
Şekil 4:. RapidChek test şeritleri Renkli fotoğraf Şekil 2'de kullanılan örneklerinin protein içeriği ekstraksiyon pipet kullanılarak izole ve yanal akış testi ile immün reaktivite açısından test edilmiştir. Lanes AC, hücre kültürü nükleik asit ve protein çıkarma olmadan test şeridi eklendi edilir işlenmemiş kontrolleri vardır. Lane A E. olduğu negatif kontrol olarak E.coli BL21 de3 pLysS, Lanes B ve C gösterisi E. coli O157: (B) veya 4 saat boyunca mitomisin C (C) ile muamele edilmeyen idi H7. H ile Lanes D yanal akış test bantları için çıkarılan protein ilave sonuçlarını göstermektedir. Lanes D ve E E. protein ekstraktı kullanılarak probed edildi ya (D) olmadan veya negatif kontrol olarak mitomisin C tedavisi (E) ile coli BL21 de3 pLysS. E. protein ayıklandığında FH sonuçlarını göstermek Lanes coli O157: H7 kullanılmıştır. Proteini (F) arıtılmamış, ya da 2 saat (G) veya 4 saat (H) mitomisin C tedavi edilen kültürden ekstrakte edildi.Pozitif sonuçlar bir çift kırmızı çizgi üretirler.
Şekil 5:. Bir Coomassie lekeli Fotoğraf SDS-PAGE BSA çıkarma pipet ve açıklanan protokolleri kullanarak çözüm izole edildi. Şeritlerinin A ve C, sırasıyla 250 ug / ml ve 500 ug / mL 'lik kontrolü şeritleri vardır. Şerit B, D, ilgili kontrol olarak aynı konsantrasyonlarını ihtiva eden çözeltiler elde BSA tasvir etmektedir.
Discussion
Bu raporda açıklanan aracı, kimyaları ve protokol alanına tabanlı, nokta-bakım uygulamalarında kullanılabilir bir elektrik-ücretsiz, çok makromolekül ekstraksiyon sistemi bilinen ilk örneği temsil eder. Her ikisi de alt türleri makromolekülün teşhis veya analitik bir çok cihaz için de uygulanabilir. Numunenin proteini bileşen (Şekil 4) immünoreaktif iken, örneğin izole edilmiş nükleik asitler PCR kalitesi (Şekil 2 ve 3) bulunmaktadır. Dünyanın yalın veya kaynak sınırlı alanlarda bu ekstraksiyon sisteminin kullanımı büyük ölçüde orada yaşayan halklar üzerinde hastalık yükünü azaltabilir. Bu ekstraksiyon sistemi de sade veya uzak yerlerde numune için sağlam henüz hızlı ve maliyet etkin bir yöntem sağlayarak dünya çapında hastalık tarama programlarına yardımcı olabilir.
Yukarıda belirtildiği ekstraksiyon yöntemi için bir önemli yönü olduğukullanıcı tarafından değiştirilebilir. Örneğin, numune boyutu ilk 500 μLs (adım 1.2) den büyük veya daha az olduğu durumlarda, kullanıcıya uygun reaktifler hacimleri ayarlayabilir. Yani mutlak hacimleri değiştirilebilir ise örneklem büyüklüğü için reaktiflerin hacimsel oranı sabit kalması gerekir vardır. Aynı zamanda, emici içinde kısımların sayısını düzenlemeler de kullanıcının takdirine bağlı olarak yapılabilir. Daha büyük bir örnek hacmi kullanılır Örneğin, listede daha sorbent kez daha (adım 2.4 ve 3.3) üzerinden örnek geçen sorbent iletişime makromolekül türü (nükleik asit ve protein) olasılığını artıracaktır. Sorbent doygunluk ulaşılana kadar geçişlerde artış artırmak verimliliği yakalamak gerekir.
Biz çıkarma aracı ve ilişkili kimyaları protein ekstraksiyon kimyası çok glikozillenmiş kurtarma için verimsiz olması en önemli olan bazı sınırlamaları olduğunu bulmuşlarproteinler. Aşağı diyagnostik bir glikosilatlı protein hedefler olması durumunda, bu sistem tanımlanması için ideal olmayabilir. Ayrıca, nükleik asitler ya proteinlerin biri için ekstraksiyon verimleri üst ve alt sınırları hala tespit ve optimizasyonu kurtarma verimliliği maksimize sürüyor edilmektedir. Aracın daha da geliştirilmesi, bu mevcut bilgi boşluklar giderilecek.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Ekstraksiyon pipet geliştirilmesi için fon DRP layık bir İç Araştırma ve Geliştirme Hibe kısmen sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine Thiocyanate | TEKnova, Inc. | G4000 | |
| ethanol | Pharmco-AAPER | 11ACS200 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A-4503 |
References
- Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005. Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).
- Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. Method and Device for Isolating a Protein Sample. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).
- Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).
- O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science. 226, 694-696 (1984).
- Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain. Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).
- Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages. DNA Research. 6, 141-143 (1999).
- Ptashne, M. A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
- Feng, P., Monday, S. R. Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes. Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).
