Summary
Hier beschreiben wir einen neuen High-Content-chemisch induzierte Entzündung Assay mit dem Ziel der Identifizierung von immunmodulatorischen Proteine tätig. Wir haben erfolgreich automatisierte Mikroskopie mit selbst entwickelten Software-Scripte für die automatisierte Quantifizierung der Entzündungsreaktion sowie weitere Datenverarbeitung, Analyse-, Bergbau-und Storage kombiniert.
Abstract
Zebrafisch-Larven sind besonders zuträglich ganze Tier kleines Molekül Bildschirmen 1,2 aufgrund ihrer geringen Größe und der relativen Leichtigkeit der Manipulation und Überwachung sowie der Tatsache, dass Verbindungen einfach dem Badewasser hinzugefügt werden und sind leicht absorbiert werden, wenn in einem verabreicht <1% DMSO-Lösung. Durch die optische Klarheit der Zebrafisch-Larven und der Verfügbarkeit von transgenen Linien exprimiert fluoreszierenden Proteinen in Leukozyten bieten Zebrafisch den einzigartigen Vorteil, Überwachen eines akuten Entzündungsreaktion in vivo. Folglich wurde unter Verwendung der Zebrafisch für High-Content-Bildschirme kleines Molekül mit dem Ziel der Identifizierung von immunmodulatorischen Verbindungen mit hohem Durchsatz 3-6 vorgeschlagen worden, was darauf hindeutet Entzündung Induktion Szenarien zB lokalisierte Nicks in fin Gewebe-, Laser-Schäden gerichtet an die Oberfläche des Dotters Embryonen 7 oder Heckflosse Amputation 3,5,6. Der größte Nachteil dieser Methoden war jedochdas Erfordernis einer manuellen Manipulation Larven zu induzieren Verwundung und verhindert so das Hochdurchsatz-Screening. Die Einführung der chemisch induzierte Entzündung (Chin)-Assay 8 beseitigt diese Hemmnisse. Seit Verwundung zugefügt wird chemisch die Zahl der Embryonen, die gleichzeitig behandelt werden können, ist praktisch unbegrenzt. Temporäre Behandlung von Zebrafisch-Larven mit Kupfersulfat selektiv induziert Zelltod in Haarzellen des seitliche Linie System und führt zu einer schnellen Rekrutierung von Granulozyten verletzten Neuromasten. Die entzündliche Reaktion kann in Echtzeit durch Verwendung transgener Verbindung cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 Zebrafischlarven, die ein grün fluoreszierendes Protein in Neuromasten Zellen, sowie ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren Granulozyten Kennzeichnung eingehalten werden.
Um ein Screening-Strategie, die sowohl High-Content-und Hochdurchsatz-Analysen erlauben würde, erarbeiten wir eingeführt Liquid-Handling-Roboter-und kombinierter automatisierte MICRoscopy mit einem benutzerdefinierten Skript entwickelte Software. Dieses Skript ermöglicht die automatisierte Quantifizierung der Entzündungsreaktion indem man die Prozent-Bereich von rot fluoreszierenden Leukozyten innerhalb einer empirisch definierten Umgebung verletzten grün fluoreszierenden Neuromasten besetzt. Darüber hinaus haben wir automatisierte Datenverarbeitung, Handhabung, Visualisierung und Speicherung aller auf speziell entwickelte MATLAB-und Python-Skripte basieren.
In Kürze stellen wir eine automatisierte HC / HT Bildschirm, der Prüfung von chemischen Verbindungen ermöglicht ihre Wirkung auf Initiation, Progression oder Auflösung eines granulozytäre Entzündungsreaktion. Dieses Protokoll dient einem guten Ausgangspunkt für tiefer gehende Analysen der Droge Mechanismen und Stoffwechselwege in der Orchestrierung von einem angeborenen Immunantwort beteiligt. In Zukunft kann es helfen, zu identifizieren unerträglich giftige oder Off-Target-Effekte bei früheren Phasen der Wirkstoffforschung und reduzieren dadurch prozedurale Risiken und Kosten für die Arzneimittelentwicklung.
Protocol
1. Behandlung der Tiere
Für das Kinn Assay Verwendung 3 dpf Larven, die sich aus Gruppe Paarungen zwischen homozygoten doppelt transgenen cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 und AB (Wildtyp-) Fisch. Sammle Embryonen, die durch natürliche Laichen und heben Sie sie bei 29 ° C in E3 Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4 und 0,1% Methylenblau, äquilibriert, um pH 7,0) in Petrischalen. Es ist wichtig, um eine Dichte von Embryonen, die nicht mehr als 50-70 Platte zu halten.
2. Larva Sortierung
Überprüfen Sie alle Larven unter einem Fluoreszenz-Stereoskop für fluoreszierenden Reporter Ausdruck, spontane Entzündung und entsprechende altersabhängige Entwicklung.
3. Siebmediums Vorbereitung (immer frisch ansetzen)
Planen E3-Medium ohne Methylenblau mit DMSO (1% Endkonzentration) und MS222 (0,05 g / l) ergänzt.
4. CuSO4Vorbereitung (immer frisch ansetzen)
Erste abwiegen CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) und bereiten eine 20 mM Stammlösung in dH 2 O. Bereiten 120 uM CuSO 4-Arbeitslösung (von 20 mM Stammlösung) in E3/DMSO (1%) / MS-222. Schützen Sie CuSO 4-Lösung von Licht.
5. 384-Well-Platte Vorbereitung (Greiner 384 Well Mikrotiterplatten)
Pre-+ 20 ul E3/DMSO (1%) / MS-222 in jede Vertiefung mit einem umgekehrten Pipette. Eine erhöhte Pipettenspitze Bohrung ist erforderlich, um die Embryonen vorsichtig damit umgehen, ohne jegliche Verletzung zuzufügen, dies wird durch Schneiden Sie die Spitze auf eine 2 mm Bohrung durchgeführt. Übertragen Sie einzelne Larve in 74 ul Medium in jede Vertiefung (84 ul für unbehandelte Kontrolle). Wenn nötig, mit Orientierung Larven in einer lateralen Position innerhalb des auch eine flexible Eppendorf Microloader Pipettenspitze (Eppendorf, 5242 956,003).
Führen Sie alle folgenden Schritte Liquid-Handling-Roboter mit einer FlüssigkeitHandling Workstation um eine gleichzeitige Behandlung aller Larven zu gewährleisten.
6. Medikamentöse Behandlung
Mischen Verbindungen in Drug Stock Platte 5-mal durch Auf-und Abpipettieren. In 16 ul 7,5-fach Drug Stock Platte in jede Vertiefung und mischen Sie 5-mal. Passen Spitze Position innerhalb Brunnen, um Verletzungen der Larven zu verhindern und verzichten auf das Medium 10 pl / s. Mischen Medium in Wells 4-mal, um eine homogene Verteilung des Arzneimittels innerhalb des Bohrlochs zu gewährleisten.
7. Incubation
Inkubieren Abschirmblech für 1 h bei 29 ° C mit Alufolie bedeckt, um Verbindungen sowie CuSO 4 vor Licht schützen.
8. Chemische Verwundender
In 10 ul 120 uM CuSO 4 funktionierende Lösung in jede Vertiefung mit Ausnahme der negativen Kontrollen, mischen und inkubieren 4 mal wieder für 1 h bei 29 ° C.
9. Waschen
Entfernen und austauschen 80 ul von mir Medium aus jeder Vertiefung zweimal (in 20 ul-Schritten) zu entfernen und Verbindungen CuSO 4.
10. Image Acquisition
Starten der Bildaufnahme auf einem invertierten automatisierten Mikroskop (dh: Olympus scan ^ R) 90 Minuten nach der anfänglichen Behandlung Kupfer. Setzt die initiale z-Ebene, so dass Neuromasten von rechts und links hintere seitliche Linie sichtbar sind. Bild jedes Well einmal pro Stunde in der Kanäle Hellfeld, mit Cy3 und GFP in 4 Fokalebenen (50 mu m Abstand) ein 4-fach-Objektiv (NA = 0,13).
Weitere Informationen zu Bild-und Datenverarbeitung sind auf Anfrage erhältlich.
11. Bildverarbeitung
1. Daten sortieren
Raw-Bilder werden mit unseren Kunden Software LabView-Skript verarbeitet. Die erste Operation in der Bildverarbeitung Pipeline wird von RAW-Bildern Sortierung vom Mikroskop erzeugten Daten-Ordner von Kanal-, Brunnen-und Zeit-Punkt-Informationen.
ove_step "> 2. Erweiterte TiefenschärfeAnschließend erzeugt die Software erweitert unscharfe Bilder von 4 Brennebenen für jeden der Kanäle.
3. RGB-Overlay
In einem letzten Schritt die erweiterten Fokus Bilder aus den 3 Kanälen zusammengeführt werden, um in einem letzten RGB-Overlay-Bild führen.
4. Automatisierte Erkennung Neuromasten
Ein Mustererkennungs-Tool (Rapid-IA LabView-Prototyping-Werkzeug) identifiziert Neuromasten in den RGB-Overlay-Bilder und erstellt eine empirisch definierten Bereich von Interesse rund um den Neuromasten.
5. Quantifizierung
Innerhalb der empirisch definierten Bereich von Interesse umgebenden verletzten Neuromasten rot fluoreszierenden Leukozyten (wider als rote Pixel) werden ausgewertet, was zu einer primären Auslesen von p ercent ein REA o l durch eukocytes (Paol) ccupied. Im Durchschnitt 95,27 ± 2,11% (FDA1) und 95,12 ±1,56% (FDA2) von Brunnen (Larven) wurden ordnungsgemäß erkannt und haben in der Folge zu weiteren Datenverarbeitung unterzogen worden. Die Rohdaten-Ausgang (Paol für jeden erkannten Neuromasten) in einer txt-Datei gespeichert und dient als Daten-Input für den MATLAB-Skripten, die die Rohdaten weiterverarbeiten.
12. Data Processing
1. Imaps
Beurteilung des Erfolgs einzelner Experimente durch grafische Visualisierung der Rohdaten-Ausgang Paol in einem Farbcode konnte mit sogenannten Entzündung Karten (IMAPS) (Abbildung 2) realisiert werden. Leuchtend grüne spiegelt eine hohe initiale entzündliche Index; schwarz bedeutet, dass keine Entzündung. Dies ermöglicht schnellen Überblick zur raschen Identifizierung von gescheiterten Versuchen, die dann von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen werden können.
2. Mittelung von Kontrollen
Jede experimentelle Platte enthält 320 Verbindungen spiegelt eineinzelnen Datenpunkt pro Verbindung und Zeit-Punkt-sowie 32 positiven und negativen Kontrollen. Der 32-Steuerung repliziert sind gemittelte und die Standardabweichung berechnet. Für die Kontrollen nur Datenpunkte innerhalb 2 Standardabweichungen enthalten sind.
3. Normalisierung
Die Normalisierung wird durch Tabellenkalkulation getan. Der durchschnittliche Wert von DMSO, wobei die Negativkontrolle, wird auf 0 gesetzt und der höchste gemittelten Paol für die Kupfer-Steuerung wird auf 1 gesetzt, so dass die maximale Differenz zwischen dem positiven und negativen Kontrollproben auf 1 gesetzt ist. Jede Verbindung der Paol wird linear interpoliert oder extrapoliert zur jeweiligen Kontrolle über die experimentelle Platte.
4. Abschließende Auslesen: Entzündliche Index
Nach einer ausreichenden Wiederholungsversuchen (zB 15) durchgeführt wurden, werden normalisierte Rohdaten Wiederholungsversuchen gemittelt, was zu einer endgültigen Auslesen - die entzündlicheIndex. Die anfängliche Entzündungsreaktion Index des Kupfer-Steuerung beginnt bei 100% für die Zeit-Punkt-Null und korreliert mit der Bildaufnahme Startzeit (90 Minuten nach der anfänglichen Behandlung Kupfer).
5. Monotone Exponentialregression Fitting
Aufgrund einer Entzündung Auflösung im Laufe der Zeit führen wir eine monotone nichtlineare Regression exponentiellen Fitting in Richtung der anfänglichen Entzündung durch 
- A 0 ist ein Maß für die ursprüngliche Antwort bei t = 0, wird ein 1 zu der Steigung der Größe über die Zeit passt.
6. 2-D-Merkmalsraum Plot (Abbildung 4)
Um den Merkmalsraum zu erzeugen, wird eine nicht-lineare Regression und einen Cluster-Analyse teilt die Merkmalsraum in charakteristische Bereiche, wodurch eine automatisierte Erkennung von interessanten Kandidaten aus verschiedenen immunmodulatorischen Kategorien (Anti-inflammatORY, Anti-Auflösung, pro-inflammatorische, pro-Auflösung). Alle Verbindungen sind in der 2-D-Darstellung von den Parametern a 0 und a 1 bezogen angezeigt.
13. Datenmanagements und der Datenspeicherung
Unsere Daten-Handling-Routinen erstellen Internetseiten zu visualisieren und zu repräsentieren, wie Drogen-Bildschirme bieten einen schnellen Überblick über die Bild-und Datenverarbeitung Schritte 'Ergebnisse sowie eine detaillierte Ansicht, wenn durch den Benutzer 10 angefordert. Soft-Links zu anderen relevanten heterogenen biologischen und chemischen Datenbanken sowie um eine wertvolle Ressource für vergleichende Studien und Roman 11 vorzusehen integriert. Durch diese Routinen werden die Daten richtig Normen und Metainformationen für die langfristige Speicherung dieser Daten eingestellt.
14. Repräsentative Ergebnisse
In einer Pilotstudie Bildschirm analysierten wir eine Bibliothek, bestehend aus 640 FDA zugelassen bekannten bioaktiven Verbindungen für Auswirkungen auf die Initiation, Progression oder Auflösung eines Granulocytic Entzündungsreaktion. Basierend auf der beobachteten Effekte wir klassifiziertes 4 Arten von immunmodulatorischen Phänotypen, die ein Anzeichen sein für verschiedene Wirkmechanismen kann: anti-inflammatorische (1), Anti-Auflösung (2), pro-inflammatorische (3) und pro-Auflösung (4) , welche mit den Parameter a 0 und 1, die von einer monoton nicht-lineare Regression Armatur (E + ao ALX -) entstehen beschrieben in Richtung der ersten Entzündung. A 0 repräsentiert die Größe der Entzündungsreaktion während ein 1 charakterisiert die Steigung der Kurve und beschreibt somit Entzündung die Lösung. Anzeigen aller Verbindungen in einem 2-D-Merkmalsraum Grundstück (A 1 im Vergleich zu einem 0) ermöglicht die automatisierte Identifizierung von Kandidaten schlagen aus den verschiedenen Kategorien immunmodulatorische (Abbildung 3).
45. Stelle von 640 Verbindungen ausgeübt signifikante anti-inflammatorische Wirkung durch Reduktion der entzündlichen ersten Index zu 50% oder weniger. Innerhalb this Kategorie fanden wir sechs Verbindungen aus der pharmakologischen Klasse der nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs), Bestätigung der Gültigkeit unseres Ansatzes. Allerdings rangiert NSAR nicht zu den stärksten entzündungshemmenden Medikamenten. Abgesehen von den NSAR fanden wir einige zusätzliche pharmakologische Wirkstoff-Klassen wie zum Beispiel Angiotensin-Rezeptorblocker (ARB), Antibiotika und Protonenpumpenhemmern.
7 Verbindungen erfüllten die Kriterien empirisch definierte Schwelle für potenzielle Pro-Auflösung Drogen.
18 Drogen übten einen pro-inflammatorische Wirkung, was zu übertriebenen Leukozytenrekrutierung verletzt Neuromasten im Vergleich zu den positiven Kontrollen.
Nur 2-Verbindungen verhindert rechtzeitige Lösung der Entzündungsreaktion.
Die entzündungshemmende Wirkung der mehrere Hit-Kandidaten (exemplarische Kandidaten aus oben genannten pharmakologischen Wirkstoffklassen) aus dem Pilot-Bildschirm could in einer Dosis-abhängigen Weise in den nachfolgenden sekundären Assays Chin (Daten nicht gezeigt) bestätigt werden. Eine Wiederholung von 4 potentiellen pro-Auflösung Medikamente nicht bestätigen Sie die angegebene Wirkungsweise wie in der primären Bildschirm ausgeübt. 2 der Medikamente einen leichten entzündungshemmend bei höheren Konzentrationen (20 pM). Ein drittes Medikament zeigte eine marginale Nicht-Dosis-abhängigen anti-inflammatorische Wirkung Arzneimittelkonzentrationen im Bereich von 5 bis 20 uM. Die vierte Droge hatte keine Wirkung auf die entzündliche Reaktion bei den getesteten Konzentrationen.
Abbildung 1. Workflow des Chin-Assay. Einzelne Verbindung transgenen cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 Larven (3 DPF) werden von Hand in 384-Well Mikrotiterplatten verteilt. Drogen werden gleichzeitig in jede Vertiefung mit einem Zephyr Compact Liquid Handling Workstation hinzugefügt. Die Testplatten werden dann für 1 h bei 29 ° C inkubiert Die Behandlung mit CuSO 4
Abbildung 2. . Übersicht Bild von RAW-Bildern Die Abbildung zeigt RAW-Bilder von 4 Fokalebenen (Z = 0 - 3) im Abstand von 50 um in den Kanälen Cy3 (links) und GFP (rechts) sind. Arrows (Z = 1,2) zeigen beispielhaft Neuromasten, Pfeilspitzen (Z = 1,2) Punkt zu geclusterten Leukozyten um Neuromasten.
Abbildung 3. Entzündung Maps (IMAPS) Der Erfolg der einzelnen Versuche in imaps was die Entzündungsreaktion (Rohdaten) in einem Farbcode beurteilt werden kann:. Hellgrün spiegelt eine hohe anfängliche Inflation mmatory Antwort; schwarz bedeutet, dass keine Entzündung imaps Zum Zeitpunkt 0 (links) und Zeit-Punkt 5 (rechts) zeigen deutlich, ob ein Experiment in weiteren Datenverarbeitung einbezogen werden sollten.. Kupfer Kontrollen (Zeile 13 und 24) zeigen sich in unterschiedlichen Schattierungen von Grün, während DMSO Kontrollvertiefungen (Zeile 1 und 12) in dunkelgrün oder schwarz erscheinen. Zum Zeitpunkt-Nummer 5 wird eine Entzündung fast in Kupfer Kontrollen lösen, jetzt in dunklen Schattierungen von grün oder schwarz gekennzeichnet. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 4. 2-D-Merkmalsraum Diagramm von 320 Verbindungen eines FDA-Bibliothek und ihre entsprechenden Kontrollen. Alle Verbindung Vertiefungen in einem 2-D Merkmalsraum Plots basierend auf der Parameter a 0 und a 1, die aus einem nicht-linearen ergeben angezeigt Regression Armatur (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" Gleichung 1 "/>) in Richtung der anfänglichen Entzündung. Diese Funktion Raum Grundstück erlaubt die automatisierte Identifizierung von interessanten Kandidaten, die zu einer der folgenden vier Kategorien immunmodulatorischen achten, die Anzeichen der Medikamente kann "Wirkungsweise:. anti-inflammatorische (1), Anti-Auflösung (2), pro-inflammatorische (3) und pro-Auflösung (4) Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Discussion
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH Co KG | A994.2 | |
| Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH Co KG | PO23.1 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |
References
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