Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تنقية وتجميع على البروتين اميلويد السلائف المجال بين الخلايا

Published: August 28, 2012 doi: 10.3791/4204
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Surgery, University of Texas Medical Branch, 2Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

ووصف طريقة لتنقية واسعة النطاق للمجال APP داخل الخلايا (AICD). وصفنا أيضا منهجية للحث

Abstract

اميلويد السلائف البروتين (APP) هو نوع من البروتين عبر الغشاء I المرتبطة التسبب في مرض الزهايمر (AD). ويتميز APP بواسطة ملك خارج الخلية الكبيرة ومجال عصاري خلوي يسمى قصيرة المجال APP داخل الخلايا (AICD). خلال النضج من خلال مسار إفرازية، يمكن المشقوق APP بواسطة البروتياز وصف α، β، γ-secretases و1. انشقاق بروتين متسلسلة من APP مع β γ وsecretases-يؤدي إلى إنتاج بروتين الببتيد الصغيرة، ووصف Aβ، وهو amyloidogenic والمكونة الأساسية لويحات خرف. وAICD أيضا تتحرر من الغشاء بعد تجهيز secretase، ومن خلال التفاعل مع Fe65 وTip60، يمكن نقل من لنواة للمشاركة في تنظيم النسخ من الجينات المستهدفة متعددة 2،3. قد البروتين البروتين التفاعلات التي تنطوي على الاتجار تؤثر AICD، وتجهيز، والوظائف الخلوية من هولو-APP والخمسين C-ترمنشظايا آل. لقد أظهرنا مؤخرا التي يمكن الإجمالية في المختبر، وهذه العملية يتم من قبل AICD تحول دون ubiquilin-1 AD-المتورطين كوصي الجزيئية 4. بما يتفق مع هذه النتائج، AICD كشفت المجالات مسعور والمختلين جوهريا في المختبر 5،6، ومع ذلك فإنه يحصل هيكل مستقر الثانوية عندما يتجهون إلى Fe65 7. وقد اقترحنا أن ubiquilin-1 يمنع غير لائق التفاعلات بين وداخل الجزيء من AICD، ومنع تجميع في المختبر وخلايا سليمة في 4. في حين أن معظم الدراسات تركز على دور APP في التسبب في AD، ودور AICD في هذه العملية ليست واضحة. وقد تبين من التعبير للحث على موت الخلايا المبرمج AICD 8، لتعديل مسارات إشارات 9، وتنظيم الكالسيوم مما يشير 10. الإفراط في التعبير عن AICD وFe65 في نموذج الفأر المعدلة وراثيا يؤدي مثل علم الأمراض مرض الزهايمر 11، ومؤخرا تم الكشف عن AICD في البرازيللست] في غرب النشاف من قبل عند استخدام التقنيات المناسبة استرجاع مستضد 12. لتسهيل الدراسات الهيكلية، والكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية وللAICD، وقد وضعنا الداخلي لإنتاج كميات كبيرة من البروتين recombinantly AICD نقية للغاية. وصفنا طريقة أخرى لإحداث التجميع في المختبر الحراري للAICD والتحليل المجهري القوة الذرية. الأساليب المذكورة مفيدة لتوصيف الكيمياء الحيوية، والفيزياء الحيوية، والهيكلية للAICD وآثار المحرمين الجزيئية على تجميع AICD.

Protocol

1. التعبير عن المؤتلف المجال APP بين الخلايا (AICD)

  1. تحويل E. القولونية BL21 مع توتر AICD الإنسان (بقايا 649-695 من APP، الخلايا العصبية شكل الإسوي الترقيم) المستنسخة في ناقلات pGEX-1-4T (GE للرعاية الصحية). ستبدي AICD هذه النواقل مثل C-شاردة محطة من البروتين الانصهار الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (ضريبة المبيعات). هذه النواقل بترميز أيضا تسلسل الانقسام ثرومبين لتسهيل إزالة شاردة GST. ويمكن الاطلاع على تفاصيل الاستنساخ AICD في pGEX-1-4T في نشر رسائلنا السابقة 4.
  2. من مستعمرة واحدة، تطعيم 10 مل من مرق LB مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل)، واحتضان بين عشية وضحاها في C ° 37 مع اهتزاز قوية.
  3. في صباح اليوم التالي، تطعيم 400 مل LB / الأمبيسلين في قارورة سعة لتر واحد مع 5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها.
  4. احتضان في C ° 37 مع قوي يهز حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر وصلت 0،4 حتي 0،6. سوف يستغرق ذلك عادة 2 حتي 2،5 ساعة.
المحتوى "> عند هذه النقطة قد يكون من المستحسن أن تحصل على عينة صغيرة (~ 10 ميكرولتر) لمتابعة عملية تنقية بواسطة SDS-PAGE (انظر الشكل 1A، B). كل خطوة لاحقة تنقية ينبغي أن يكون أيضا إزالة قسامة الصغيرة لتحليل بواسطة SDS-PAGE.

  1. حمل التعبير عن GST-AICD بإضافة 0.4 مم من الآيزوبروبيل بيتا-D-thiogalactopyranoside (IPTG). احتضان في C ° 37 مع قوي يهز لمدة 5 ساعة.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 6،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. يمكن تخزين بيليه الخلية في C ° -80 لعدة أشهر في هذه المرحلة من العملية.

2. تنقية GST-AICD

  1. مخزنة 1 ملم dithiothreitol، 1MM ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA)، 0.1٪ تريتون-X100، 1 ملم فلوريد phenylmethylsulfonyl (PMSF)، كاملة كوكتيل مثبط البروتياز (روش العلوم التطبيقية)، والفوسفات المالحة: تجهيز 50 مل العازلة تحلل على النحو التالي. البرد على الجليد.
  2. ذوبان الجليد بيليه البكتيرية (إذا جمدت سابقا) علىالجليد.

عند هذه النقطة، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في 4 درجات مئوية للحد من التحلل البروتيني. ينبغي لجميع الأنابيب، مخازن، وغيرها من الكواشف يكون قبل مبردة. إذا باستخدام الصحافة الفرنسية أو مستحلب للتحلل، وينبغي أن تكون هذه قبل المبردة أيضا.

  1. إعادة تعليق بيليه بدقة البكتيرية في 20 مل من العازلة تحلل. ومن خلال الجمع بين vortexing وسحن مع ماصة 10 مل على الجليد ضمان إعادة تعليق كامل للبيليه.
  2. تمر الخلايا البكتيرية من خلال معلق مستحلب (على سبيل المثال، Avestin EmulsiFlex-C3) أو الفرنسية خلية الضغط، قبل المبردة إلى 4 ° C 30000 رطل لكل بوصة مربعة في. تمرير المحللة من خلال مستحلب للمرة الثانية. جمع المحللة في أنبوب ما قبل المبردة 50 مل.

والميزة الرئيسية لهاتين الأداتين هو أنها تقليل تسخين العينة. هذه التقنية تستخدم عادة من صوتنة يولد حرارة كبيرة في الطرف الجنوبي من التحقيق وصوتنةيمكن أن يؤدي إلى تجميع البروتينات المؤتلف.

  1. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة على 15،000 XG لمدة 30 دقيقة. فصل والحفاظ على طاف في أنبوب ما قبل المبردة 50 مل.
  2. إضافة 500 ميكرولتر من 50٪ من الطين الجلوتاثيون-الاغاروز (سيغما الدريخ). تدوير لمدة 30 دقيقة في C. ° 4 في حين أن العينة يدور، وجعل جديدة عازلة شطف: 50 ملي تريس، 7.8-0.1٪ تريتون X100، 0.5 مم dithiothreitol، 10 ملم الجلوتاثيون المختزل.

الخطوة الوحيدة للبروتوكول التي أجريت في درجة حرارة الغرفة هي الخطوة شطف. وهكذا، يتم الاحتفاظ المخزن المؤقت شطف في درجة حرارة الغرفة. وينبغي إعداد العازلة شطف الطازجة.

  1. صب مخزنة المحللة والطين القابل للتصرف في 5 "البوليسترين العمود اللوني مع الخشنة (90-130 ميكرون) مرشحات (العلمية الخضرة). اغسل العمود 5 مرات مع 3 مل من الفوسفات المالحة.
  2. تتويج الجزء السفلي من العمود وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة شطف درجة حرارة الغرفة. سقف أعلىوتناوب العمود لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جمع شطافة إلى 1،5 أنبوب المبرد microfuge مل. تكرار شطف مرتين أخريين (1.5 مل شطافة الكل).
  3. مخزنة في Dialyze شطافة في الغشاء على 10،000 الوزن الجزيئي غسيل الكلى قطع (على سبيل المثال، الحرارية العلمية الشرائح-A-Lyzer غسيل الكلى أشرطة) في 4 لتر ​​من الفوسفات المالحة ليلة وضحاها في C. ° 4 مخزنة Dialyze ضد لتر 4 إضافية من الفوسفات المالحة في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة في اليوم التالي.
  4. إزالة البروتين من كاسيت غسيل الكلى وإجراء فحص البروتين الكمي لتحديد العائد من GST-AICD. وهناك تنقية نموذجية من 400 مل من الثقافة يؤدي إلى غلة 20 ملغ> من البروتين النقي في تركيزات من 10-20 ملغ / مل. قسامة البروتين إلى 200 ميكرولتر مأخوذة وتجميد في -80 ° C.

3. ثرومبين انشقاق من GST-AICD وتنقية AICD

  1. ذوبان الجليد 200 ميكرولتر من المنقى GST-AICD وإضافة 20 ميكرولتر من thromb U / ميكرولتر 1احتضان بين عشية وضحاها. وعند 37 درجة C.

جودة ونقاء ثرومبين اختلافا كبيرا بين الشركات المصنعة، ويمكن أن تكون مصدرا كبيرا للتلوث. نستخدم ثرومبين من الرعاية الصحية GE (انظر الجدول الكواشف). بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، يجب المشقوق> 95٪ من البروتين الانصهار (1B الشكل).

  1. بعد الانقسام بين عشية وضحاها مع الثرومبين، فمن المرجح أن جزء بسيط من AICD المحررة خضع التجميع والحل قد تظهر غائم. مسح المواد المجمعة بواسطة الطرد المركزي في 20000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف في أنبوب microfuge قبل مبردة.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من 50٪ الجلوتاثيون-الاغاروز الطين و 50 ميكرولتر 50٪ الطين ف aminobenzamidine-الاغاروز لإزالة GST والثرومبين، على التوالي. احتضان مع التناوب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على الرسوبيات حبات الاغاروز، وإزالة طاف في أنبوب جديد. استخراج رانه GST أربع مرات مع الجلوتاثيون-الاغاروز. A استخراج واحد مع ف aminobenzamidine-الاغاروز يكفي لإزالة U 20 من ثرومبين.
  4. إجراء فحص الكميات البروتين في 5 ميكرولتر من AICD المنقى. غلة نموذجية من ثقافة هي 400 مل 50-100 ميكروغرام بتركيز 0،2 حتي 0،5 ملغ / مل. زيادة الغلة ممكنة من كميات أكبر من الشق GST-AICD.

وينبغي إعداد تنقية AICD جديدة لتوصيف البيوكيميائية / البيوفيزيائية. يجب التخلص من المواد غير المستخدمة. ومن الممكن أيضا لتركيز AICD من lyophilizing العينة وresuspending في أصغر حجم المخزن المؤقت 6. إذا كشف AICD يتطلب النشاف (مثل بعد فخ تصفية أو نقطة الفحص صمة عار)، ينبغي أن يقوم استرجاع مستضد على الغشاء كما وصفها Pimplikar وسوريانارايانا 12.

4. AICD تجميع للفحص المجهري القوة الذرية (AFM)

  1. تمييع طازجة أعدت AICD في ع مخزنة المالحة hosphate إلى تركيز 0.1 مجم / مل في الحجم النهائي من 15 ميكرولتر. عند هذه النقطة، يمكن إضافة مركبات مختلفة و / أو البروتينات لتحديد ما إذا كانت تحول دون تجميع AICD. على سبيل المثال، لقد أظهرنا أن تركيزات متساوي المولية من ubiquilin-1 منع تجميع AICD في هذا الاختبار 4.

ومن الممكن أيضا لتجميع كميات أكبر رد فعل للتجارب الكيميائية الحيوية مثل المقايسات فخ تصفية وتشتت الضوء 4. لقد حققنا نجاحا أداء المقايسات فخ تصفية على مخاليط رد فعل بحجم إلى 400 ميكرولتر مع AICD المخفف لتركيزات منخفضة تصل إلى 1 ميكرومتر.

  1. حمل التجميع الحراري عن طريق احتضان العينات في C ° 43 مع اهتزاز في 800 دورة في الدقيقة في Thermomixer إيبندورف لمدة 48 ساعة. وقد تم اختيار هذه الدرجة بناء على المقايسات التي كوصي دراسة التجميع الحراري للسينسيز كوصي نموذج سترات الركيزة 4،13.

> تجميع الحرارية هي وسيلة تستخدم عادة للحث على التحول الهيكلي من البروتين من الأم إلى بنية غير الأصلية (التي عادة ما تكون غنية ورقة بيتا) مما يؤدي إلى تشكيل المجاميع الجزيئات. كما يستخدم التجميع الحراري لفحص وظيفة المحرمين الجزيئية، والتي تحمي قطاعات مسعور من تشكيل التفاعلات بين الجزيئات غير لائق (وبالتالي تؤخر أو تمنع التجميع الحراري).

  1. تمييع العينة 20-أضعاف في الماء منزوع الأيونات وبقعة ميكرولتر 2 على الميكا المشقوق حديثا. تجفيف العينة في dessicator بين عشية وضحاها. وسوف يكون من الضروري تحديد تجريبيا التخفيف الأمثل للتصوير، وبالتالي التخفيفات عدة تتراوح بين 10 - إلى أضعاف-100 سيكون من الحكمة.
  2. تصور AICD المجمعة باستخدام AFM التشغيل في وضع التنصت 14. والكابولي المستخدمة هي الذهب الصغيرة المغلفة العتلات نيتريد حادة (MSNL، بروكر) مع دائرة نصف قطرها الاسمي تلميح من 2 نانومتر. نموذجية التنصت سعة الدرجي هي 10-20 نانومتر التصوير في تردد الرنين من الكابولي (30-50 كيلو هرتز).

وجدنا أن جودة الصورة وعلى النقيض من المجاميع البروتين مختلفة تعتمد على القوة المستخدمة ومدة التجربة. لتقليل الاضطراب عينة من غيض، حافظنا على القوة المستخدمة منخفضة نسبيا عن طريق الحفاظ على نسبة مجموعة نقاط تزيد عن 95٪ والحد من المسح الضوئي من كل عينة إلى 5-10 دقيقة. تم إجراء معالجة الصور مع برنامج WSxM (NANOTEC). وتألفت معيار معالجة الصور من الطائرة وتسطيح الطرح. مختبراتنا استخدام "محلي الصنع" AFM 15 ربطه لتحقيق المسح التجارية نظام التحكم المجهر (NANOTEC).

5. ممثل النتائج

يظهر التعبير وإثراء النسبي للGST-1A AICD في الشكل. بعد تحلل، فإن الغالبية من البروتين الانصهار موجود في جزء القابلة للذوبان، وبالتالي استخراج من inclusiعلى الهيئات غير مطلوب. المواد مزال من العمود الاغاروز الجلوتاثيون هو> 95٪ نقية. في إعداد هو موضح في الشكل 1، وكان تركيز البروتين مزال من العمود 14،5 ملغم / لتر، والعائد كان 22 ملغ (من ثقافة ابتداء من 400 مل). أدى الانقسام من 200 ميكرولتر من إعداد هذا بين عشية وضحاها مع 20 U من الانقسام في ثرومبين٪ تقريبا 100 من انصهار بروتين (1B الشكل). كمية ثرومبين المستخدمة هي منخفضة بما فيه الكفاية حتى لا يكون كشفها بواسطة تلطيخ الأزرق Coomassie (انظر "المشقوق" 1B الشكل حارة،). أسفرت إزالة ثرومبين وGST في فقدان بعض المواد، ومع ذلك فإنه كان> 90٪ نقية مع تحقيق عائد في هذا الإعدادية من 70 ميكروغرام من AICD عند تركيز قدره 0.35 ملغ / مل. الشكل 1C يظهر على الرسم البياني لتدفق تجميع AICD وتحليل لاحقة. المجاميع AICD تصوير بواسطة AFM وعادة ما تكون كروي / غير متبلور، وتتراوح في حجمها. 50 حتي 100 نانومتر (الشكل 1D، F) مجموعالمواد لا يمكن كشفها عند إضافة مبلغ متساوي المولية للكوصي ubiquilin-1 إلى رد فعل التجميع (الشكل 1E) 4.

الشكل 1
الشكل 1. تنقية وتجميع AICD. A) تلطيخ الأزرق Coomassie من العينات التي تم جمعها في كل خطوة من عملية تنقية. لعينات uninduced والمستحثة، وتشغيل 20 ميكرولتر من البكتيريا كامل على هلام. لجزء طاف، تم تشغيل 5 ميكرولتر من المحللة (من وحدة تخزين ما مجموعه 20 مل) على هلام. لجزء بيليه، كان بيليه معلق في 20 مل من العازلة تحلل، وكانت sonicated 5 ميكرولتر من هذه المواد في المياه sonicator حمام لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية قبل تحميلها على هلام. لflowthrough، تم تشغيل 5 ميكرولتر على هلام. يشار إلى مبالغ شطافة تحميلها على هلام. B) الملون الأزرق Coomassie جل من uncleaved والمشقوق GST-AICD (2 ميكرولتر) و 1 و 5 و مAICD ل المطهرون؛ ش. C) من مخطط انسيابي تنقية AICD، وتجميع، وتحليل. D، E) الصور AFM ممثل تجمع حراريا AICD في غياب (D) وجود (E) كوصي الجزيئية للubiquilin-1. F) الرسم البياني لتوزيع حجم الركام AICD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا البروتوكول وقد أوجزنا في إجراءات الحصول على AICD نقية للغاية لتحليل الهيكلية، الفيزياء الحيوية، والكيمياء الحيوية. هذا الإجراء لا يتطلب معدات متطورة اللوني، وبالتالي الوصول إلى معظم المختبرات. طهروا مجموعات أخرى AICD 5-7،16، بما في ذلك GST-AICD 17-19، لتحاليل الكيميائية الحيوية / الهيكلية. عيوب لبروتوكولات السابقة تشمل ذوبان سوء AICD 16، أقل من النقاء المثالي 17، وشرط لاستبعاد حجم 16 أو عكس المرحلة اللوني 6،20. وبالتالي، ينبغي أن بروتوكول الموصوفة هنا يسهل إلى حد كبير في الدراسات المختبرية من AICD. وقد وصفت ونحن أيضا وسيلة لتجميع الحراري للAICD والكشف عن طريق AFM. على الرغم من أن تستخدم بشكل متزايد في مجال اميلويد 21، AFM هي تقنية عالية التخصص. أكثر دود المقايسات مثل تشتت الضوء، الترسيب، وفحوصات فخ مرشح يمكن أيضاأن تستخدم لدراسة التجميع الحراري للAICD 4. وأخيرا، والقدرة على دراسة مباشرة في المختبر قدرة تنقية الجزيئات المصاحبة، مثل ubiquilin-1 4، لمنع التجميع الحراري للAICD يفتح الباب لتوضيح الدور الوظيفي للمرافقين عصاري خلوي أخرى في علم الأحياء APP تحوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشنغ هوى (كلية بايلور للطب) لAPP [كدنا]. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R21AG031948 (DB، JMB)، F30AG030878 (ESS)، R01DK073394 (AFO)، وسيلي جون صندوق الهبات التذكارية للبحوث الطبية الحيوية (AFO)، وجان وليم C. D. ويليس العلوم العصبية بحوث الوقف (ESS). JMB هو باحث في برنامج البحوث الباحث بالحركة وعضو في جامعة تكساس الطبية فرع كلود E. فلفل أقدم مركز الاستقلال الأميركيين (بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح UL1RR029876 وP30-AG-024832 على التوالي).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX-4T-1 GE Healthcare 28-9545-49
Thrombin GE Healthcare 27-0846-01
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Bradford protein assay reagent Bio-Rad 500-0002
Coomassie blue Bio-Rad 161-0786
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) Sigma-Aldrich I6758
Glutathione-agarose Sigma-Aldrich G4510
p-aminobenzamidine-agarose Sigma-Aldrich A7155
Complete protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes Thermo Scientific 66380
Chromatography columns Evergreen Scientific 208-3367-050
Emulsifier Avestin, Inc EmulsiFlex-C3 Highly recommended
Eppendorf Thermomixer Eppendorf 022670107
Mica Disks Ted Pella 50-12
AFM cantilevers Bruker MSNL-10
WSxM software Nanotec N/A Free download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
  2. Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
  3. McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer's disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
  4. Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
  5. Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
  6. Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
  7. Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
  8. Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
  9. von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
  10. Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
  11. Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
  12. Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
  13. Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
  14. Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
  15. Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
  16. Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
  17. Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
  18. Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
  19. Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
  20. Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
  21. Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).

Tags

الطب، العدد 66، علم الأعصاب، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئي، اميلويد السلائف البروتين، APP، AICD، مرض الزهايمر، مجهر القوة الذرية، والتجميع، Ubiquilin-1، الوصيفة الجزيئي
تنقية وتجميع على البروتين اميلويد السلائف المجال بين الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El Ayadi, A., Stieren, E. S.,… More

El Ayadi, A., Stieren, E. S., Barral, J. M., Oberhauser, A. F., Boehning, D. Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain. J. Vis. Exp. (66), e4204, doi:10.3791/4204 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter