Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Oprensning og Aggregering af amyloidprecursorprotein intracellulært domæne

Published: August 28, 2012 doi: 10.3791/4204
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Surgery, University of Texas Medical Branch, 2Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

En fremgangsmåde til stor skala oprensning af APP intracellulære domæne (AICD) er beskrevet. Vi beskriver også metoder til at fremkalde

Abstract

Amyloidprecursorprotein (APP) er et type I transmembrant protein associeret med patogenesen af ​​Alzheimers sygdom (AD). APP er kendetegnet ved et stort ekstracellulært domæne og en kort cytosolisk domæne kaldet APP intracellulære domæne (AICD). Under modning gennem den sekretoriske sti, kan APP spaltes af proteaser kaldet α, β, og γ-sekretaser 1. Sekventiel proteolytisk spaltning af APP med β-og γ-sekretaser fører til produktion af en lille proteolytisk peptid, betegnet Ap, som er amyloidogene og kernen bestanddel af senile plaques. The AICD er også frigøres fra membranen efter sekretasebearbejdning, og gennem interaktioner med Fe65 og Tip60, kan translokere til kernen for at deltage i transskriptionsregulering af flere målgener 2,3. Protein-protein interaktioner, der involverer AICD kan påvirke handelen, forarbejdning og cellulære funktioner i holo-APP og dets C-terminal-fragmenter. Vi har for nylig vist, at AICD kan aggregere in vitro, og denne fremgangsmåde inhiberes af AD-impliceret molekylchaperone ubiquilin-1 4. I overensstemmelse med disse resultater har AICD eksponerede hydrofobe domæner og er uløseligt uorden in vitro 5,6, men det opnår en stabil sekundær struktur, når det er bundet til Fe65 7. Vi har foreslået at ubiquilin-1 forhindrer uhensigtsmæssige inter-og intramolekylære interaktioner af AICD, forhindrer aggregering in vitro og i intakte celler 4. Mens de fleste undersøgelser fokuserer på den rolle APP i patogenesen af ​​AD, hvilken rolle AICD i denne proces er ikke klar. Ekspression af AICD er blevet vist at inducere apoptose 8, til at modulere signaleringsveje 9, og at regulere calcium signalering 10. Over-ekspression af AICD og Fe65 i en transgen musemodel inducerer Alzheimers som patologi 11, og for nylig AICD er blevet påvist i brai lysater ved Western blotting, når du bruger passende antigen hentning teknikker 12. For at lette strukturelle, biokemiske og biofysiske undersøgelser af AICD, har vi udviklet en fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant store mængder yderst rent AICD protein. Vi beskriver yderligere en fremgangsmåde til induktion af in vitro termiske aggregering af AICD og analyse ved atomic force mikroskopi. De beskrevne fremgangsmåder er nyttige til biokemiske, biofysiske og strukturelle karakterisering af AICD og virkningerne af molekylære chaperoner til AICD aggregering.

Protocol

1. Ekspression af rekombinant APP intracellulært domæne (AICD)

  1. Transformere E. coli-stamme BL21 med human AICD (resterne 649-695 af APP, neuronal isoform nummerering) klonet i pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Denne vektor vil udtrykke AICD som den C-terminale del af et fusionsprotein med glutathion-S-transferase (GST). Denne vektor koder også en thrombinspaltning sekvens for at lette fjernelse af GST-delen. Detaljer vedrørende kloning AICD til pGEX-4T-1 findes i vores tidligere publikation 4.
  2. Fra en enkelt koloni, inokulere 10 ml LB-medium med ampicillin (100 ug / ml) og inkuber natten over ved 37 ° C under kraftig omrystning.
  3. Den følgende morgen, podes 400 ml LB / ampicillin i en én-liters kolbe med 5 ml af overnatskulturen.
  4. Inkuber ved 37 ° C under kraftig rystning, indtil den optiske densitet ved 600 nm har nået fra 0,4 til 0,6. Det vil normalt tage fra 2 til 2,5 timer.
indhold "> På dette tidspunkt kan det være ønskeligt at tage en lille prøve (ca. 10 ul) for at følge oprensningen ved SDS-PAGE (se figur 1A, B). Hver efterfølgende oprensningstrin skal også have en lille prøve fjernet til analyse ved SDS-PAGE.

  1. Inducere ekspression af AICD GST-ved tilsætning af 0,4 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Inkuber ved 37 ° C under kraftig omrystning i 5 timer.
  2. Centrifuger cellerne ved 6000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten kan opbevares ved -80 ° C i flere måneder på dette tidspunkt i proceduren.

2. Oprensning af GST-AICD

  1. Fremstilling af 50 ml lyseringsbuffer som følger: 1 mM dithiothreitol, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Complete protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science) og phosphatbufret saltvand. Chill på is.
  2. Tø bakterielle pellet (hvis tidligere frosne) påis.

På dette tidspunkt er det afgørende, at alle trin udføres ved 4 ° C for at begrænse proteolyse. Alle rør, puffere og andre reagenser skal være præ-kølet. Hvis du bruger en fransk presse eller emulgator for lyse, skal disse være pre-kølet så godt.

  1. Grundigt resuspendere bakterielle pellet i 20 ml lysisbuffer. En kombination af hvirvelblanding og triturering med 10 ml pipette på is sikrer fuldstændig resuspension af pelleten.
  2. Passerer de resuspenderede bakterieceller gennem et emulgeringsmiddel (f.eks Avestin EmulsiFlex-C3) eller fransk trykcelle, præ-kølet til 4 ° C ved 30.000 psi. Passerer lysatet gennem emulgatoren en gang. Opsaml lysatet til en forud afkølet 50 ml rør.

Den væsentligste fordel ved disse to instrumenter er, at de minimere opvarmning af prøven. Den almindeligt anvendte teknik af lydbehandling genererer betydelig varme på spidsen af ​​sonikeringssonde ogkan resultere i aggregering af rekombinante proteiner.

  1. Centrifuger lysatet ved 15.000 x g i 30 min. Adskilt og føre supernatanten til en forud afkølet 50 ml rør.
  2. Der tilsættes 500 pi af en 50% opslæmning af glutathion-agarose (Sigma-Aldrich). Rotere i 30 minutter ved 4 ° C. Medens prøven roterer, gøre frisk elueringspuffer: 50 mM Tris 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM dithiothreitol, 10 mM reduceret glutathion.

Den eneste trin i protokollen, der udføres ved stuetemperatur, er elueringstrinnet. Således er elueringspufferen holdt ved stuetemperatur. Elueringsbuffer skal tilberedes frisk.

  1. Hæld lysat og opslæmningen i en engangs 5 ​​"polystyren kromatografisøjle med grove (90-130 um) filtre (Evergreen Scientific). Kolonnen udvaskes 5 gange med 3 ml phosphatpufret saltvand.
  2. Sæt låg på bunden af ​​kolonnen, og der tilsættes 500 pi stuetemperatur elueringspuffer. Sæt låg på toppen afkolonne og rotere i 5 minutter ved stuetemperatur. Eluatet opsamles i en afkølet 1,5 ml mikrofugerør. Gentag eluering to gange (1,5 ml i alt eluat).
  3. Dialyseres eluatet i en 10.000 molekylvægtsafskæring dialysemembran (f.eks Thermo Scientific Slide-A-Lyzer dialyse-kassetter) i 4 liter phosphatpufret saltvand natten over ved 4 ° C. Dialyseres mod yderligere 4 liter phosphatpufret saltvand ved 4 ° C i 1 time den følgende dag.
  4. Tag proteinet fra dialyse kassette og udføre et protein kvantificering assay for at bestemme udbyttet af GST-AICD. En typisk oprensning fra 400 ml kultur resulterer i udbytter på> 20 mg af oprenset protein ved koncentrationer på 10-20 mg / ml. Alikvot proteinet i 200 ul alikvoter og fryse ved -80 ° C.

3. Thrombinspaltning af GST-AICD og oprensning af AICD

  1. Tø 200 pi oprenset GST-AICD og der tilsættes 20 ul 1 U / ul Thrombi. inkuberes natten over ved 37 ° C.

Kvaliteten og renheden af ​​thrombin varierer betydeligt blandt producenter, og kan være en væsentlig kilde til forurening. Vi bruger thrombin fra GE Healthcare (se tabellen af ​​reagenser). Efter inkubation natten over, bør> 95% af fusionsproteinet spaltes (figur 1B).

  1. Efter natten over spaltning med thrombin, er det sandsynligt, at en brøkdel af den frigjorte AICD undergik aggregering og opløsningen kan forekomme uklar. Fjerne det aggregerede materiale ved centrifugering ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes i en forud kølet mikrofugerør.
  2. Der tilsættes 50 ml 50% glutathion-agarose slurry og 50 pi 50% p-aminobenzamidin-agarose opslæmningen for at fjerne GST og thrombin hhv. Inkuberes med rotation i 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Centrifugeres kort for at sediment agaroseperlerne, og fjern supernatanten til et frisk rør. Uddrag tHan GST yderligere fire gange med glutathion-agarose. En enkelt ekstraktion med p-aminobenzamidin-agarose er tilstrækkelig til at fjerne 20 U af thrombin.
  4. Udfør et protein kvantificering assay på 5 ul af det oprensede AICD. Typiske udbytter fra en 400 ml kultur er 50 til 100 ug i en koncentration på 0,2 til 0,5 mg / ml. Højere udbytter er mulige ved spaltning større mængder af GST-AICD.

Renset AICD skal tilberedes frisk for biokemisk / biofysisk karakterisering. Ubrugt materiale skal kasseres. Det er også muligt at koncentrere AICD ved lyofilisering prøven og resuspendering i et mindre volumen af puffer 6. Hvis detektering AICD kræver blotting (såsom efter et filter fælde eller dot-blot assay), antigen hentning på membranen skal udføres som beskrevet af Pimplikar og Suryanarayana 12.

4. AICD Aggregering for Atomic Force Microscopy (AFM)

  1. Fortynd frisklavet AICD i phosphate saltvand til en koncentration på 0,1 mg / ml i et slutvolumen på 15 pi. På dette tidspunkt kan forskellige forbindelser og / eller proteiner tilsættes at bestemme, om de inhiberer AICD aggregering. For eksempel har vi vist, at ækvimolære koncentrationer af ubiquilin-1 forhindre aggregering af AICD i dette assay 4.

Det er også muligt at aggregere større reaktionsvolumener til biokemiske forsøg som f.eks filter trap assays og lysspredning 4. Vi har haft succes udfører filter trap assays på reaktionsblandinger så stor som 400 gl med AICD fortyndet til koncentrationer så lave som 1 uM.

  1. Inducerer termisk aggregering ved at inkubere prøverne ved 43 ° C under omrystning ved 800 rpm i en Eppendorf Thermomixer i 48 timer. Denne temperatur blev valgt baseret på chaperone-assays der undersøger den termiske aggregering af modellen chaperone substrat citrat-syntase 4,13.

  1. Fortynde prøven 20 gange i deioniseret vand og spot 2 pl på frisk spaltet glimmer. Tør prøven i en dessikator natten over. Det vil være nødvendigt empirisk at bestemme den optimale fortynding til billeddannelse, og således adskillige fortyndinger i området fra 10 - til 100-fold ville være klogt.
  2. Visualiser den aggregerede AICD vha. AFM opererer i tappe modus 14. De anvendte køreledningsophæng er guld-belagte mikro skarpe nitrid arme (MSNL, Bruker) med en nominel radius på 2 nm. Typisk trykke amplituder durING billeddannelse er 10-20 nm ved resonansfrekvensen af ​​køreledningsophæng (30-50 kHz).

Vi fandt, at billedkvalitet og kontrasten af ​​forskellige proteinaggregater afhang af den anvendte kraft og varigheden af ​​forsøget. For at minimere prøve perturbation af spidsen, vi opretholdt den påførte kraft relativt lav ved at holde en set-point-forhold på over 95% og begrænser scanning af hver prøve til 5-10 min. Billedbehandling blev udført med WSxM software (Nanotec). Standard billedbehandling bestod af planet subtraktion og udfladning. Vores laboratorier anvender et "home-bygget" AFM 15 forbundet med en kommerciel scanning probe mikroskop kontrolsystem (Nanotec).

5. Repræsentative resultater

Ekspressionen og relative berigelse af GST-AICD er vist i figur 1A. Efter lyse, er størstedelen af ​​fusionsproteinet er til stede i den opløselige fraktion, og derfor ekstraktion fra inclusipå organer, er ikke påkrævet. Materialet elueret fra glutathion-agarose-søjle er> 95% rent. Ved fremstillingen vist i figur 1, var koncentrationen af protein elueret fra søjlen 14,5 mg / ml, og udbyttet var 22 mg (fra en udgangsposition kultur af 400 ml). Spaltning af 200 pi af denne præparation natten over med 20 U af thrombin resulterede i næsten 100% spaltning af fusionsproteinet (figur 1B). Mængden af thrombin anvendes, er lav nok til ikke at være detekterbar ved Coomassie blå farvning (se "Spaltet" bane, figur 1 B). Fjernelse af thrombin og GST medført tab af materiale, men det var> 90% ren med et udbytte i denne prep 70 ug AICD ved en koncentration på 0,35 mg / ml. 1C viser rutediagrammet for aggregering af AICD og efterfølgende analyse. AICD aggregater afbildes af AFM er typisk sfæroide / amorft, og varierer i størrelse fra 50 til 100 nm (figur 1D, F). AggregeredeMaterialet er ikke detekterbart, når en ækvimolær mængde af chaperonen ubiquilin-1 sættes til aggregering reaktionen (Figur 1E) 4.

Figur 1
Figur 1. Oprensning og aggregering af AICD. A) Coomassie blue-farvning af prøver opsamlet ved hvert trin i oprensningsprocessen. For de ikke-inducerede og inducerede prøver blev 20 ul af de samlede bakterier kørt på gelen. For supernatantfraktionen blev 5 pi lysat (fra et totalvolumen på 20 ml) kørt på gelen. For pellet-fraktionen blev pelleten resuspenderet i 20 ml lysisbuffer, og 5 pi af dette materiale blev sonikeret i et vandbad-sonikator i 30 minutter ved 4 ° C forud for påføring på gelen. For gennemstrømning, blev 5 pi kørt på gelen. Mængderne af eluat loaded på gelen er angivet. B) Coomassie blue-farvet gel af uspaltet og spaltet GST-AICD (2 pi) og 1 og 5 & mu, l renset AICD. C) Flowchart af AICD rensning, aggregering og analyse. D, E) repræsentant AFM image termisk aggregeres AICD i fravær (D) og nærvær (E) af den molekylære chaperone ubiquilin-1. F) Histogram af størrelsesfordelingen af ​​AICD aggregater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol har vi skitseret en procedure for opnåelse af yderst ren AICD for strukturelle, biofysik, og biokemiske analyser. Denne procedure kræver ikke sofistikeret chromatografi udstyr og er derfor tilgængelig for de fleste laboratorier. Andre grupper har oprenset AICD 5-7,16, herunder GST-AICD 17-19, for biokemiske / strukturelle analyser. Ulemper til tidligere protokoller omfatter dårlig opløselighed af AICD 16, mindre end ideel renhed 17, og kravet om størrelse udelukkelse 16 eller omvendt fase chromatografi 6,20. Således bør protokollen beskrevet her i høj grad lette in vitro undersøgelser af AICD. Vi har også beskrevet en fremgangsmåde til termisk aggregering af AICD og påvisning ved AFM. Selv om stigende grad benyttes i amyloid felt 21, AFM er en højt specialiseret teknik. Lettere tilgængelige assays, såsom lysspredning, sedimentering og filtrere trap assays kan ogsåbruges til at undersøge den termiske aggregering af AICD 4. Endelig er evnen til at undersøge direkte in vitro evnen af oprenset molekylære chaperoner såsom ubiquilin-1 4, for at forhindre den termiske aggregering af AICD åbner døren for at belyse den funktionelle rolle af andre cytosoliske chaperoner til modulering af APP biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) for APP cDNA. Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), John Sealy Memorial Endowment Fund for Biomedical Research (AFO) og Jean C. og William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB er en lærd i Translationel Forskning Scholar Program og et medlem fra University of Texas Medical Branch Claude E. Pepper Ældre amerikanere Independence Center (støttet af NIH Tilskud UL1RR029876 og P30-AG-024.832, henholdsvis).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX-4T-1 GE Healthcare 28-9545-49
Thrombin GE Healthcare 27-0846-01
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Bradford protein assay reagent Bio-Rad 500-0002
Coomassie blue Bio-Rad 161-0786
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) Sigma-Aldrich I6758
Glutathione-agarose Sigma-Aldrich G4510
p-aminobenzamidine-agarose Sigma-Aldrich A7155
Complete protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes Thermo Scientific 66380
Chromatography columns Evergreen Scientific 208-3367-050
Emulsifier Avestin, Inc EmulsiFlex-C3 Highly recommended
Eppendorf Thermomixer Eppendorf 022670107
Mica Disks Ted Pella 50-12
AFM cantilevers Bruker MSNL-10
WSxM software Nanotec N/A Free download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
  2. Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
  3. McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer's disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
  4. Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
  5. Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
  6. Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
  7. Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
  8. Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
  9. von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
  10. Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
  11. Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
  12. Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
  13. Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
  14. Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
  15. Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
  16. Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
  17. Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
  18. Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
  19. Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
  20. Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
  21. Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).

Tags

Medicin Neuroscience Cellular Biology Molecular Biology amyloidforstadieprotein APP AICD Alzheimers sygdom Atomic Force Microscopy Aggregation Ubiquilin-1 molekylchaperone
Oprensning og Aggregering af amyloidprecursorprotein intracellulært domæne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El Ayadi, A., Stieren, E. S.,… More

El Ayadi, A., Stieren, E. S., Barral, J. M., Oberhauser, A. F., Boehning, D. Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain. J. Vis. Exp. (66), e4204, doi:10.3791/4204 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter