Summary
APP 세포 도메인 (AICD)의 대규모 정화하기위한 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 또한 유도하는 방법을 설명합니다
Abstract
아밀로이드 전구체 단백질 (APP)이 알츠하이머 병 (AD)의 pathogenesis과 관련된 유형 I의 transmembrane 단백질입니다. APP는 대형 세포 도메인과 APP 세포 도메인 (AICD)이라고한다 짧은 cytosolic 도메인이 특징입니다. 분비 경로를 통해 성숙하는 동안, APP는 α, β, 그리고 γ-secretases 일이라고한다 프로테아제에 의해 흘리고 할 수 있습니다. β와 γ-secretases와 APP 연속 proteolytic 절단은 작은 proteolytic의 펩타이드, 칭했다 Aβ, amyloidogenic하고 치매 액자의 핵심 구성의 생산에 연결됩니다. AICD은 secretase 처리 후도 막에서 해방이며, Fe65와 Tip60와의 상호 작용을 통해 여러 대상 유전자 2,3의 전사 조절에 참여하는 핵으로 이동시키다 수 있습니다. AICD 관련된 단백질 단백질 상호 작용은 트래픽 관리, 처리, 홀로 APP와 C-termin의 세포 기능에 영향을 미칠 수 있습니다알 조각. 우리는 최근 AICD는 AD-연루 분자 보호자 ubiquilin-14에 의해 억제되어 체외에서 집계,이 처리 할 수있는 것으로 나타났습니다. Fe65 7 구속 할 때 다음 결과에 의거하여 AICD는 소수성 도메인을 노출하고 본질적으로 체외 5,6에 섞여 있으며, 그러나 그것은 안정적인 보조 구조를 얻습니다. 우리는 ubiquilin-1 체외에서, 4 그대로 셀의 집계를 방지 AICD의 부적절한 상호 및 분자 상호 작용을 방지 것을 제안했습니다. 대부분의 연구는 AD의 pathogenesis에 APP의 역할에 초점을하지만,이 과정에서 AICD의 역할은 확실하지 않습니다. AICD의 표현은 경로에게 9 신호 변조하는 apoptosis 8 유도하고, 10 신호 칼슘을 조절하는 표시되었습니다. 유전자 변형 마우스 모델에서 AICD와 Fe65 이상의 표현은 병리학 11처럼 알츠하이머을 유도하고, 최근 AICD는 브라에서 발견되었습니다적절한 항원 검색 기술 12를 사용할 때 서쪽이 blotting에 의해 lysates 인치 AICD의, 구조 생화학 및 biophysical 연구를 촉진하기 위해, 우리는 매우 순수 AICD 단백질의 recombinantly 많은 양을 생산 할 수있는 절차를 개발했습니다. 우리는 더 원자 힘 현미경에 의한 AICD 및 분석의 체외 열 집계에를 유도하는 방법을 설명합니다. 설명 방법, 생화학 biophysical 및 구조 AICD의 특성화 및 AICD 집계에 분자 보호자의 효과에 유용합니다.
Protocol
1. 재조합 APP 세포 도메인 (AICD)의 표현
- 변환 E. 대장균은 벡터 pGEX-4T-1 (GE 헬스 케어)에 복제 인간 AICD (잔류 APP의 649-695, neuronal 이소 형 번호)로 BL21을 변형. 이 벡터는 (GST) 글루타티온-S-transferase의 융합 단백질의 C-말단 잔기로 AICD 표현. 이 벡터는 또한 GST 잔기의 제거를 촉진하기 트롬빈 절단 순서를 인코딩합니다. pGEX-4T-1에 AICD 복제에 대한 자세한 내용은 이전 발행 넷에서 찾을 수 있습니다.
- 하나의 식민지에서 암피실린 (100 μg / ML)와 LB의 국물 10 ML의 예방과 활발한 흔들림으로 37 ° C에서 하루 아침에 품다.
- 다음날 아침, 밤 문화의 5 ML과 함께 한 리터 플라스크에 400 ML의 LB / 암피실린의 예방.
- 활발한 600 나노 미터에서 광학 밀도까지 흔들어 0.6-0.4에 도달과 함께 37 ° C에서 알을 품다. 이 일반적으로 2-2.5 시간이 소요됩니다.
- 이소 프로필 - 베타-D-thiogalactopyranoside (IPTG)의 0.4 MM을 추가하여 GST-AICD의 표현을 유도. 활발한 5 시간에 진동과 함께 37 ° C에서 알을 품다.
- 4에 15 분에 6,000 XG에서 세포를 원심 분리기 ° C. 셀 펠렛은 절차의이 시점에서 몇 달 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. GST-AICD의 정화
- 다음과 같이 50 ML의 용해 버퍼를 준비 : 1 ㎜ dithiothreitol, 1mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 0.1 % 트리톤 - X100, 1 밀리미터 phenylmethylsulfonyl 플루오르 화 (PMSF), 전체 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 응용 과학), 그리고 인산은 염분 버퍼. 얼음에 진정.
- 에 박테리아 펠렛을 (이전 얼어 붙은 경우) 해동얼음.
이 시점에서, 모든 단계 ° C가 proteolysis를 제한 할 4에서 수행하는 것이 중요합니다. 모든 튜브, 버퍼 및 기타 시약은 사전 차가운해야합니다. 프랑스 언론 용해를위한 유화제를 사용하는 경우,이 역시 사전 차가운해야합니다.
- 철저하게 용해 버퍼의 20 ML에있는 박테리아 펠렛을 resuspend. 얼음 10 ML의 피펫과 vortexing과 분쇄의 조합은 펠릿의 전체 resuspension을 보장합니다.
- 4 ° C 30,000에서 PSI에 대한 사전 차가운 유화제를 통해 resuspended 박테리아 세포 (예를 들어, Avestin EmulsiFlex-C3) 또는 프랑스어 압력 셀을 전달합니다. 유화제 두 번째 시간을 lysate를 전달합니다. 미리 차가운 50 ML 튜브에 lysate를 수집합니다.
이 두 악기의 가장 큰 장점은이 샘플의 가열을 최소화 할 것입니다. sonication의 일반적으로 사용되는 기술은 sonication 프로브의 끝에서 상당한 열을 생성하고재조합 단백질의 집계 될 수 있습니다.
- 30 분에 15,000 XG에서 lysate를 원심 분리기. 별도의 사전 차가운 50 ML 튜브에 표면에 뜨는을 유지.
- 글루타티온 - 아가로 오스 (시그마 - 알드리치)의 50 % 슬러리 500 μl를 추가합니다. 4 ° C.에 30 분을 위해 회전 50 ㎜ 트리스 7.8, 0.1 % 트리톤 - X100, 0.5 MM dithiothreitol, 10 MM 감소 글루타티온 : 예제는 회전하는 동안, 신선한 용출 버퍼를합니다.
실온에서 수행되는 프로토콜의 유일한 단계는 용출 단계입니다. 따라서, 용출 버퍼는 실온에서 보관됩니다. 용출 버퍼는 신선한 준비해야합니다.
- 조립 (90-130 μm) 필터 (에버그린 과학). 인산염의 3 ML로 열 다섯 번 씻으과 일회용 5 "폴리스티렌 크로마토 그래피 칼럼으로 lysate와 슬러리를 따르다가 염분 버퍼.
- 열의 하단에 캡과 룸 온도 용출 버퍼 500 μl를 추가합니다. 상단을 캡열 및 상온에서 5 분 동안 회전 할 수 있습니다. 차가운 1.5 ML의 microfuge 관에 eluate를 수집합니다. 용출 두 배 (1.5 ML 총 eluate)를 반복합니다.
- 인산의 4리터에서 10,000 분자량의 컷오프 투석 막 (예를 들어, 열 과학 슬라이드-A-Lyzer 투석 카세트)에서 eluate을 Dialyze는 4 ° C.에서 하루 아침에 염분 버퍼 인산염의 추가 4리터에 대한 Dialyze은 4에서 염분 버퍼 ° C 1 시간 다음 날.
- 투석 카세트에서 단백질을 제거하고 GST-AICD의 수율을 결정하는 단백질 정량화 분석을 수행합니다. 문화 400 ML의 전형적인 정화가 10-20 MG / ML의 농도에서 단백질을 정제의> 20 밀리그램의 수율이 높아집니다. -80 200 μl aliquots 및 동결로 나누어지는이 단백질 ° C.
3. 트롬빈의 GST-AICD의 절단 및 AICD의 정화
- 해동 200 정화 GST-AICD의 μl 1 U / μl thromb의 20 μl를 추가합니다인치 37 박 품다 ° C.
트롬빈의 품질과 순도는 제조업체들 상당히 다양하고, 오염의 중요한 소스가 될 수 있습니다. 우리는 GE 헬스 케어 (시약의 표 참조) 트롬빈을 사용합니다. 박 부화 후, 융합 단백질의> 95 %는 (그림 1B) 흘리고해야합니다.
- 트롬빈과 밤 절단 후 해방 AICD의 일부가 집계를 받았습니다 및 솔루션은 흐린 나타날 수 가능성이 높습니다. 4에 30 분에 20,000 XG에서 원심 분리에 의해 집계 된 자료를 삭제 ° C. 미리 차가운 microfuge 관에 표면에 뜨는을 제거합니다.
- 각각 GST 및 트롬빈을 제거을 50 % 글루타티온 - 아가로 오스 슬러리 50 μl 50% P-aminobenzamidine - 아가로 오스 슬러리의 50 μl를 추가합니다. 상온에서 5 분 동안 회전 품다.
- 침전 아가로 오스 비즈를에 짧게 원심 분리기, 그리고 신선한 튜브로 표면에 뜨는을 제거합니다. t의 압축을 풉니 다그는 글루타티온 - 아가로 오스와 GST 네 개를 더 번. P-aminobenzamidine - 아가로 오스와 단일 추출 트롬빈의 20 U를 제거 할 수있는 것입니다.
- 정화의 AICD의 5 μl에 단백질 quantitation 분석을 수행합니다. 400 ML 문화의 일반적인 수율은 0.2-0.5 MG / ML의 농도에 50-100 μg 있습니다. 높은 수율은 GST-AICD의 큰 볼륨을 cleaving에 의해 가능합니다.
정화 AICD는 생화학 / biophysical 특성화에 대한 새로운 준비를해야합니다. 사용하지 않는 자료는 폐기해야합니다. 이 샘플을 lyophilizing와 버퍼 6 작은 볼륨으로 resuspending하여 AICD을 집중하는 것도 가능합니다. AICD을 검출하는 것은 blotting (예 : 필터 트랩 또는 도트 얼룩 분석 후) 막에 대한 항원 검색이 Pimplikar과 Suryanarayana 12 설명으로 수행해야합니다 필요합니다.
4. 원자 힘 현미경을위한 AICD 집적 (AFM)
- 희석은 갓 P에 AICD 준비hosphate는 0.1 밀리그램 / 15 μl의 최종 볼륨의 ML의 농도에 염분 버퍼. 이 시점에서, 다양한 화합물 및 / 또는 단백질들은 AICD 집계를 억제 여부를 결정하기 위해 추가 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 ubiquilin-1의 몰 농도가 검정 4 AICD의 집계를 방지하는 것으로 나타났습니다.
또한 이러한 필터 트랩 assays와 빛의 분산 4와 같은 생화학 실험에 대한 통합 큰 반응 볼륨 할 수 있습니다. 우리는 성공은 1 μM의 낮은 농도로 희석 AICD 400 μl로 크게 반응 혼합물에 필터 트랩 assays을 수행 있었다.
- 48 시간에 Eppendorf Thermomixer 800 rpm으로 흔들어와 43 ° C에서 샘플을 잠복기에 의해 열 집계를 유도. 이 온도는 모델 보호자 기판 구연산의 synthase 4,13의 열 집계를 검토 보호자 assays에 따라 선정되었습니다.
- 갓 흘리고 운모에 탈 이온수와 장소 2 μl에 20 배 샘플을 희석. 밤새 dessicator에서 샘플을 말린다. 그것은 경험적으로 이미지를위한 최적의 희석을 확인할 필요가있을 것이고, 따라서 10 일부터 이르기까지 여러 dilutions - 100 배에는 신중한 것입니다.
- 모드 14 도청에 AFM 운영을 사용하여 집계 AICD를 표시합니다. 사용 cantilevers은 2 nm의 공칭 팁 반경 골드 코팅 마이크로 날카로운 질화물 레버 (MSNL, Bruker)입니다. 일반적인 도청 진폭 두어ING 영상은 cantilevers (30-50 kHz에서)의 공명 주파수에서 10-20 nm의 수 있습니다.
우리는 서로 다른 단백질을 합산의 이미지 품질 및 대비는 가해진 힘과 실험 기간에 의존 것으로 나타났습니다. 팁이 샘플 섭동을 최소화하기 위해, 우리는 95 % 이상 세트 포인트 비율을 유지하고 5-10 분 각 샘플의 검사를 제한하여 상대적으로 낮은 적용 힘을 유지하고있다. 이미지 처리가 WSxM 소프트웨어 (Nanotec)로 수행되었습니다. 표준 영상 처리는 비행기 빼기와 납작로 구성. 우리 실험실 사용 "집에서 내장"상업 스캐닝 프로브 현미경 제어 시스템 (Nanotec)에 인터페이스 AFM 15.주세요
5. 대표 결과
표현과 GST-AICD의 상대적 농축은 그림 1A에 표시됩니다. 용해 후, 융합 단백질의 대부분은 수용성 분수에 존재하며, 따라서 inclusi에서 추출몸에 필요하지 않습니다. 글루타티온 아가로 오스 칼럼에서 용출 자료> 95 % 순수입니다. 그림 1에 표시된 준비에 열로부터 용출 단백질의 농도는 14.5 밀리그램 / ML이었고, 수율은 22 밀리그램 (400 ML의 시작 문화에서)이었다. 트롬빈 20 U과 밤이 준비 200 μl의 절단은 융합 단백질 (그림 1B)의 거의 100 % 절단하게되었습니다. ( "흘리고"레인, 그림 1b 참조) Coomassie 푸른 얼룩에 의해 감지 될하지로 사용 트롬빈의 양만큼 낮습니다. 트롬빈과 GST의 제거하지만이 0.35 밀리그램 / ML의 농도에 AICD의 70 μg의 사립의 수율과> 90% 순수이었고, 재료의 일부 손실되었습니다. 그림 1C는 AICD의 집합에 대한 플로우 차트를 보여줍니다 및 이후 분석. AFM으로 이미징 AICD 집계는 일반적으로 회전 타원체 / 비정질이며, 크기 범위 50-100 나노 미터 (그림 1D, F)에서. 집계자료 자야 ubiquilin-1의 몰 금액이 집계 반응 (그림 1E) 4에 추가 될 때 감지되지 않습니다.
1 그림. 정화 및 AICD의 집합이 있습니다. 샘플 A) Coomassie 푸른 얼룩 정화 과정의 각 단계에서 수집. uninduced 및 유도 샘플의 경우, 총 세균의 20 μl은 젤에서 실행되었습니다. 표면에 뜨는 분수를 들어, lysate의 5 μl가 (20 ML의 총 볼륨에서) 젤에서 실행되었습니다. 펠렛 분수를 들어, 펠릿이 용해 버퍼의 20 ML에 resuspended되었고,이 자료의 5 μl은 4시 30 분에 물 목욕 sonicator에 sonicated되었습니다 ° C 전에 젤에로드합니다. flowthrough를 들어, 5 μl은 젤에서 실행되었습니다. 젤에로드 eluate의 양이 표시됩니다. uncleaved 흘리고 GST-AICD (2 μl)와 1, 5 및 m의 B) Coomassie 푸른 스테인드 젤U; 리터 정화가 AICD. AICD 정화, 집계 및 분석 C) 흐름도. 의 D, E) 대표 AFM 이미지 열 분자 보호자 ubiquilin-1의 부재 (D)와 존재 (E)에 AICD 집계됩니다. AICD 집계의 크기 분포 F) 히스토그램.
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Discussion
이 프로토콜에서 우리는, 구조 biophysical 및 생화학 분석을위한 매우 순수 AICD를위한 절차를 설명합니다. 이 절차는 복잡한 크로마토 그래피 장비를 필요로하기 때문에 대부분의 실험실에 액세스 할 수 없습니다. 다른 그룹은 생화학 / 구조 분석을위한 GST-AICD 17-19 포함한 AICD 5-7,16을 정화하고 있습니다. 이전 프로토콜 단점은 가난한 AICD 16 용해도, 이상적인 순도 17 이하 및 크기 제외 16 요구 사항을 포함하거나 상에게 크로마토 그래피 6,20을 뒤집. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜은 크게 AICD의 체외 연구에 용이합니다. 우리는 또한 AFM에 의해 AICD와 감지의 열 집계하는 방법을 설명합니다. 점점 더 아밀로이드 필드 21에 사용했지만, AFM은 고도로 전문화 된 기술입니다. 이러한 빛의 분산, 침강 및 필터 트랩 assays로 더 가까이 assays 또한AICD 4의 열 집계를 검토하는 데 사용할 수. 마지막으로, 체외에서 직접 AICD의 열 집계를 방지하기 위해 예 : 4 ubiquilin-1과 같은 분자 보호자로써, 정화의 능력을 검사 할 수있는 능력이 변조 APP 생물학에있는 다른 cytosolic 보호자의 기능 역할을 elucidating을 위해 문을 엽니 다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 cDNA APP에 박사 후이 청 (의학 베일러 대학)을 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), 바이오 메디컬 연구에 대한 존 씰리 (Sealy) 브랜드의 기념 기금 (AFO), 그리고 장 C.와 윌리엄 D. 윌리스, 신경 과학 연구 기금의 지원을받는 한 (ESS). JMB는 병진 연구 학술 프로그램의 학자와 텍사스 의료 지점 클로드 E. 페퍼 이전 미국인 독립 센터의 대학의 구성원 (NIH 교부금을 각각 UL1RR029876 및 P30-AG-024832에 의해 지원)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
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