Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Rensing og aggregeringen av amyloid forløperprotein intracellulære domenet

Published: August 28, 2012 doi: 10.3791/4204

Summary

Fremgangsmåte for storskala rensing av APP intracellulære domenet (AICD) er beskrevet. Vi beskriver også metodikk for å indusere

Abstract

Amyloid forløper protein (APP) er en type I transmembrane protein forbundet med patogenesen av Alzheimers sykdom (AD). APP er preget av en stor ekstracellulære domene og en kort cytosoliske domene kalt APP intracellulære domenet (AICD). Under modning gjennom den sekretoriske vei kan APP spaltes av proteaser betegnet α, β og γ-secretases 1. Sekvensiell proteolytisk spaltning av APP med β og γ-secretases fører til fremstilling av en liten proteolytisk peptid, betegnet Aβ, som er amyloidogenic og kjernen bestanddelen av senile plakk. Den AICD er også frigjort fra membranen etter secretase behandling, og gjennom samhandling med Fe65 og Tip60 kan translocate til kjernen til å delta i transkripsjon regulering av flere målgener 2,3. Protein-protein interaksjoner som involverer AICD kan påvirke menneskehandel, behandling og cellulære funksjoner av holo-APP og C-terminal fragmenter. Vi har nylig vist at AICD kan aggregere i vitro, og denne prosessen er hemmet av AD-innblandet molekylær anstand ubiquilin-1 4. Samsvar med disse funnene, har AICD utsatt hydrofobe domener, og er egentlig uordnede in vitro 5,6, men det får stabil sekundær struktur når bundet til Fe65 7. Vi har foreslått at ubiquilin-1 hindrer upassende Inter-og intramolekylær interaksjoner av AICD, hindrer aggregering in vitro og in intakte celler 4. Mens de fleste studier fokuserer på den rollen APP i patogenesen av AD, er rollen AICD i denne prosessen ikke klart. Ekspresjon av AICD har vist seg å indusere apoptose 8, å modulere signalveier 9, og for å regulere kalsium signalisering 10. Over-uttrykk for AICD og Fe65 i en transgen mus modell induserer Alzheimers som patologi 11, og nylig AICD er påvist i BHi lysates av vestlige blotting ved bruk egnede antigen henting teknikker 12. Å lette strukturelle, biokjemiske og biofysiske studier av AICD, har vi utviklet en prosedyre for å produsere rekombinant store mengder av meget rent AICD protein. Vi videre beskrive en fremgangsmåte for å indusere in vitro aggregering av termiske AICD og analyse ved atomic force mikroskopi. Fremgangsmåtene beskrevet er nyttige for biokjemisk, biofysiske og strukturell karakterisering av AICD og virkninger av molekylære anstand for AICD aggregering.

Protocol

1. Uttrykk av rekombinant APP Intracellulær Domain (AICD)

  1. Transform E. coli stamme BL21 med menneskelig AICD (rester 649-695 av APP, neuronal isoform nummerering) klonet inn vektor pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Denne vektoren vil uttrykke AICD som den C-terminale rest av et fusjonsprotein av glutation-S-transferase (GST). Denne vektoren koder også en trombin cleavage sekvens for å lette fjerning av GST moiety. Detaljer om kloning AICD inn pGEX-4T-1 finner du i vår forrige publisering fire.
  2. Fra en enkelt koloni, inokuler 10 ml LB-næringsløsning med ampicillin (100 ug / ml) og inkuber over natten ved 37 ° C med kraftig risting.
  3. Den følgende morgen, inokuler 400 ml LB / ampicillin i en en-liters kolbe med 5 ml av den over natten kultur.
  4. Inkuber ved 37 ° C med kraftig risting inntil den optiske tettheten ved 600 nm har nådd 0,4 til 0,6. Dette vil normalt ta 2 til 2.5 hr.
innhold "> På dette punktet kan det være ønskelig å ta ut en liten prøve (~ 10 ul) for å følge rensing ved SDS-PAGE (se figur 1A, B). Hver påfølgende rensetrinn bør også ha en liten aliquot fjernet for analyse ved SDS-PAGE.

  1. Induser ekspresjon av GST-AICD ved tilsetning 0,4 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Inkuber ved 37 ° C med kraftig risting for 5 timer.
  2. Sentrifuger cellene ved 6000 xg i 15 min ved 4 ° C. Cellepelleten kan lagres ved -80 ° C i flere måneder på dette punktet av prosedyren.

2. Rensing av GST-AICD

  1. Forbered 50 ml lyseringsbuffer som følger: 1 mM ditiotreitol, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF), komplett protease-inhibitor cocktail (Roche Applied Science), og fosfat-bufret saltløsning. Chill på isen.
  2. Tine bakteriell pellet (hvis tidligere frosset) påisen.

På dette punktet, er det vesentlig at alle trinnene er utført ved 4 ° C for å begrense proteolyse. Alle rør, buffere, og andre reagenser bør være pre-kjølt. Hvis du bruker en fransk presse eller emulgator for lysis, bør disse være pre-kjølt også.

  1. Grundig resuspender bakteriell pellet i 20 ml lyseringsbuffer. En kombinasjon av virvling og triturering med 10 ml pipette på is vil sikre fullstendig resuspendering av pelleten.
  2. Før de resuspenderte bakterieceller gjennom en emulgator (f.eks Avestin EmulsiFlex-C3) eller fransk press celle, pre-kjølt til 4 ° C på 30 000 psi. Passere lysatet gjennom emulgatoren en gang. Samle lysatet inn i en pre-avkjølt 50 ml rør.

Den største fordelen med disse to instrumentene er at de minimere oppvarming av prøven. De brukte teknikk sonikering skaper betydelige varme på spissen av sonikering probe ogkan resultere i aggregering av rekombinante proteiner.

  1. Sentrifuger lysatet ved 15.000 xg i 30 min. Separer og holde supernatanten inn i en pre-avkjølt 50 ml rør.
  2. Tilsett 500 pl av en 50% oppslemming av glutation-agarose (Sigma-Aldrich). Roter i 30 min ved 4 ° C. Mens prøven roterer, gjøre fersk elueringsbuffer: 50 mM 7,8 Tris, 0,1% Triton-X100, 0,5 mM ditiotreitol, 10 mM redusert glutation.

Den eneste skritt av protokollen som er utført ved romtemperatur er elueringen trinn. Dermed er elueringsbufferen holdt ved romtemperatur. Elueringsbuffer bør være forberedt frisk.

  1. Hell lysatet og oppslemmingen i en engangs 5 ​​"polystyren kromatografikolonne med grove (90-130 um) filtre (Evergreen Scientific). Vask kolonnen 5 ganger med 3 ml av fosfatbufret saltløsning.
  2. Cap bunnen av kolonnen og tilsett 500 pl av romtemperatur elueringsbuffer. Cap toppen avkolonne og roter i 5 min ved romtemperatur. Samle eluatet i et avkjølt 1,5 ml mikrosentrifuge tube. Gjenta eluering to ganger (1,5 ml totalt eluat).
  3. Dialyser eluatet i en 10.000 molekylvekt cutoff dialysemembran (f.eks Thermo Scientific Slide-A-Lyzer dialyse kassetter) i 4 liter fosfatbufret saltoppløsning over natten ved 4 ° C. Dialyser mot ytterligere 4 liter fosfatbufret saltoppløsning ved 4 ° C i 1 time den påfølgende dagen.
  4. Ta av protein fra dialyse kassett og utføre et protein kvantifisering analyse for å fastslå utbytte av GST-AICD. En typisk rensing fra 400 ml kultur vil resultere i utbytter av> 20 mg renset protein ved konsentrasjoner på 10-20 mg / ml. Alikvoter proteinet inn 200 ul aliquoter og fryse ved -80 ° C.

3. Trombin Spalting av GST-AICD og rensing av AICD

  1. Tine 200 ul renset GST-AICD og legge 20 pl 1 U / pl Thrombigjen Inkuber over natten ved 37 ° C.

Kvaliteten og renheten av trombin varierer betydelig mellom produsenter, og kan være en betydelig kilde for forurensning. Vi bruker trombin fra GE Healthcare (se tabell av reagenser). Etter inkubering over natten, bør> 95% av fusjonsproteinet spaltes (figur 1B).

  1. Etter over natten spaltning med trombin, er det sannsynlig at en brøkdel av den frigjorte AICD gjennomgikk aggregering og løsningen kan vises skyet. Tømme aggregerte materiale ved sentrifugering ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes inn i en pre-avkjølt mikrosentrifuge tube.
  2. Tilsett 50 pl av 50% glutation-agarose oppslemmingen og 50 pl 50% p-aminobenzamidine-agarose oppslemmingen for å fjerne GST og trombin, henholdsvis. Inkuber med rotasjon i 5 min ved romtemperatur.
  3. Sentrifuger kort til sediment de agarosekuler, og fjern supernatanten til et nytt rør. Pakk than GST fire ganger med glutation-agarose. En enkelt ekstraksjon med p-aminobenzamidine-agarose er tilstrekkelig til å fjerne den 20 U av trombin.
  4. Utføre en proteinkvantifisering assay på 5 ul av det rensede AICD. Typiske utbytter fra en 400 ml kultur er 50-100 ug i en konsentrasjon på 0,2 til 0,5 mg / ml. Høyere avkastning er mulig ved å spalte større mengder GST-AICD.

Renset AICD bør være forberedt frisk for biokjemisk / biofysisk karakterisering. Ubrukt materiale skal kastes. Det er også mulig å konsentrere AICD ved lyofilisere prøven og risting i et mindre volum av buffer 6. Hvis påvisning AICD trenger blotting (for eksempel etter et filter felle eller dot blot-analyse), antigen henting på membranen bør utføres som beskrevet av Pimplikar og Suryanarayana 12.

4. AICD Aggregation for Atomic Force Microscopy (AFM)

  1. Fortynn nylagde AICD i phosphate bufret saltvann til en konsentrasjon på 0,1 mg / ml i et endelig volum på 15 ul. På dette punktet, kan forskjellige forbindelser og / eller proteiner legges for å bestemme om de hemmer AICD aggregering. For eksempel, har vi vist at ekvimolare konsentrasjoner av ubiquilin-1 hindre aggregering av AICD i denne analysen 4.

Det er også mulig å samle større reaksjonsvolumer for biokjemiske eksperimenter som filter trap analyser og lysspredning 4. Vi har hatt suksess utfører filter trap assays på reaksjonsblandinger så stor som 400 ul med AICD fortynnet til konsentrasjoner så lave som 1 uM.

  1. Induser termisk aggregering ved inkubering prøvene ved 43 ° C med rysting ved 800 rpm i en Eppendorf Thermomixer i 48 timer. Denne temperaturen ble valgt basert på anstand analyser som undersøker den termiske aggregering av modellen anstand underlaget citrate syntase 4,13.

  1. Fortynne prøven 20 ganger i deionisert vann og flekk 2 ul bort ferskt kløyvde glimmer. Tørk prøven i et tørkeapparat over natten. Det vil være nødvendig empirisk å bestemme den optimale fortynning for bildebehandling, og således flere fortynninger fra 10 - til 100-ganger ville være forsvarlig.
  2. Visualiser den aggregerte AICD med AFM opererer i tappe modus 14. De cantilevers brukes er gull-belagt mikro skarpe nitride spakene (MSNL, Bruker) med en nominell tips radius på 2 nm. Typisk peke amplituder during-avbildning, er 10-20 nm ved resonansfrekvens av cantilevers (30-50 kHz).

Vi fant at bildekvalitet og kontrast av forskjellige protein aggregater avhengig av anvendt kraft, og varigheten av forsøket. Å minimalisere prøven perturbasjon av spissen, beholdt den anvendt kraft relativt lav ved å holde et sett-punkt ratio over 95% og begrense skanning av hver prøve til 5-10 min. Bildebehandling ble utført med WSxM programvare (NANOTEC). Standard bildebehandling besto av flyet subtraksjon og flatere. Våre laboratorier bruker en "hjemme-bygget" AFM 15 tilkobles til en kommersiell skanning probe mikroskop kontrollsystem (NANOTEC).

5. Representant Resultater

Uttrykket og relative berikelse av GST-AICD er vist i figur 1A. Etter lysis, er flertallet av fusjonsproteinet til stede i den oppløselige fraksjon, og derfor ekstraksjon fra inkluderendepå organer er ikke nødvendig. Materialet eluert fra glutation agarose kolonne er> 95% ren. I preparatet er vist i figur 1, var konsentrasjonen av protein eluert fra kolonnen 14,5 mg / ml, og utbyttet var 22 mg (fra en start kultur av 400 ml). Spalting av 200 ul av dette preparatet over natten med 20 U av trombin resulterte i nesten 100% spalting av fusjonsproteinet (figur 1B). Mengden av trombin benyttes er lav nok til å ikke være påviselig av Coomassie blå farging (se "kløyvde" lane, figur 1B). Fjerning av trombin og GST resulterte i noe tap av materiale, men det var> 90% rent med et utbytte i denne prep av 70 ug AICD ved en konsentrasjon på 0,35 mg / ml. Figur 1C viser flytdiagram for aggregering av AICD og påfølgende analyse. AICD aggregater avbildes av AFM er vanligvis sfæroide / amorfe, og varierer i størrelse fra 50 til 100 nM (figur 1D, F). Aggregertmateriale er ikke detekterbare når en ekvimolar mengde av anstand ubiquilin-1 tilsettes til aggregering reaksjon (figur 1E) 4.

Figur 1
Figur 1. Rensing og aggregering av AICD. A) Coomassie blå farging av prøver samlet ved hvert trinn i renseprosessen. For uninduced og induserte prøvene ble 20 ul av totale bakterier kjøres på gelen. For supernatanten fraksjonen, ble 5 ul av lysat (fra et totalt volum på 20 ml) kjøres på gelen. For pellet fraksjonen, ble pelleten resuspendert i 20 ml lysebuffer, og 5 pl av dette materialet ble sonikert i et vannbad sonikator i 30 minutter ved 4 ° C før den settes inn i gelen. For flowthrough ble 5 pl kjørt på gelen. Mengdene av eluat loaded på gel er indikert. B) Coomassie blå farget gel av uncleaved og spaltet GST-AICD (2 pl) og 1 og 5 & mu; l renset AICD. C) Flytskjema av AICD rensing, aggregering og analyse. D, E) representant AFM bilde av termisk aggregert AICD i fravær (D) og nærvær (E) av det molekylære anstand ubiquilin-1. F) Histogram over størrelsesfordelingen for AICD aggregater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen har vi skissert en prosedyre for å oppnå svært ren AICD for strukturelle, biofysiske og biokjemiske analyser. Denne fremgangsmåten krever ikke avansert kromatografi utstyr og er derfor tilgjengelig for de fleste laboratorier. Andre grupper har renset AICD 5-7,16, inkludert GST-AICD 17-19, for biokjemiske / strukturelle analyser. Ulemper til tidligere protokoller er dårlig løselighet av AICD 16, mindre enn ideelle renhet 17, og kravet til størrelsen ekskludering 16 eller reversert fase kromatografi 6,20. Således bør protokollen beskrevet her sterkt forenkle in vitro studier av AICD. Vi har også beskrevet en fremgangsmåte for termisk aggregering av AICD og påvisning av AFM. Selv i økende grad brukt i amyloid feltet 21, er et høyt spesialisert AFM teknikk. Mer tilnærmelig analyser som lysspredning, sedimentering og filtrere felle analyser kan ogsåbrukes til å undersøke den termiske aggregering av AICD 4. Til slutt åpner muligheter for å undersøke direkte in vitro evnen av renset molekylære anstand som ubiquilin-1 4, for å hindre den termiske aggregering av AICD døren for å belyse den funksjonelle rollen til andre cytosoliske anstand i modulerende APP biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) for APP cDNA. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), John Sealy Memorial Endowment Fund for Biomedical Research (AFO) og Jean C. og William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB er en lærd i translasjonsforskning Scholar Program og medlem av University of Texas Medical Branch Claude E. Pepper Eldre amerikanere Independence Center (støttet av NIH Grants UL1RR029876 og P30-AG-024 832, henholdsvis).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX-4T-1 GE Healthcare 28-9545-49
Thrombin GE Healthcare 27-0846-01
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Bradford protein assay reagent Bio-Rad 500-0002
Coomassie blue Bio-Rad 161-0786
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) Sigma-Aldrich I6758
Glutathione-agarose Sigma-Aldrich G4510
p-aminobenzamidine-agarose Sigma-Aldrich A7155
Complete protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes Thermo Scientific 66380
Chromatography columns Evergreen Scientific 208-3367-050
Emulsifier Avestin, Inc EmulsiFlex-C3 Highly recommended
Eppendorf Thermomixer Eppendorf 022670107
Mica Disks Ted Pella 50-12
AFM cantilevers Bruker MSNL-10
WSxM software Nanotec N/A Free download

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
  2. Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
  3. McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer's disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
  4. Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
  5. Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
  6. Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
  7. Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
  8. Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
  9. von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
  10. Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
  11. Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
  12. Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
  13. Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
  14. Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
  15. Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
  16. Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
  17. Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
  18. Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
  19. Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
  20. Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
  21. Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).

Tags

Medisin Neuroscience cellebiologi molekylær biologi amyloid forløper protein APP AICD Alzheimers sykdom Atomic Force Microscopy Aggregation Ubiquilin-1 Molecular anstand
Rensing og aggregeringen av amyloid forløperprotein intracellulære domenet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El Ayadi, A., Stieren, E. S.,More

El Ayadi, A., Stieren, E. S., Barral, J. M., Oberhauser, A. F., Boehning, D. Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain. J. Vis. Exp. (66), e4204, doi:10.3791/4204 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter