Summary
Um método para a purificação em larga escala do domínio intracelular de APP (AICD) é descrita. Nós também descrevem metodologia de indução
Abstract
Proteína precursora amilóide (APP) é uma proteína transmembranar de tipo I associado à patogénese da doença de Alzheimer (AD). APP é caracterizada por um grande domínio extracelular e um domínio citosólico curto denominado o domínio intracelular de APP (AICD). Durante a maturação através da via secretora, APP pode ser clivada por proteases denominadas α, β e γ-secretases 1. A clivagem proteolítica da APP sequencial com β e γ-secretases conduz à produção de um péptido pequeno proteolítico, denominado de Ap, que é amiloidogénica e o constituinte principal das placas senis. A AICD também é libertada a partir da membrana, após o processamento secretase, e por meio de interacções com Fe65 e Tip60, pode translocar para o núcleo para participar na regulação da transcrição de genes alvo múltiplas 2,3. Interacções proteína-proteína envolvendo a AICD podem afectar o tráfico, o processamento e as funções celulares de holo-APP e seus C-terminfragmentos al. Mostrámos recentemente que AICD pode agregar in vitro, e este processo é inibido pelo ubiquilin-1-AD implicado chaperone molecular 4. Consistente com estes resultados, a AICD expôs domínios hidrofóbicos e está intrinsecamente desordenados in vitro 5,6, no entanto, obtém estrutura secundária estável quando ligado ao Fe65 7. Propusemos que ubiquilin-1 impede inadequado interacções inter-e intramolecular da AICD, prevenindo a agregação in vitro e em células intactas 4. Enquanto a maioria dos estudos focado o papel de APP na patogénese de AD, o papel da AICD neste processo não são claras. Expressão da AICD foi mostrado para induzir a apoptose 8, para modular as vias de sinalização 9, e para regular a sinalização de cálcio 10. A sobre-expressão da AICD e Fe65 num modelo de ratinho transgénico induz patologia de Alzheimer, como 11, e recentemente AICD foi detectado no braem lisados por western blotting quando usando técnicas de recuperação de antigénios apropriados 12. Para facilitar os estudos estruturais, bioquímicas e biofísicas da AICD, desenvolvemos um procedimento para a produção de quantidades grandes de forma recombinante altamente pura proteína AICD. Iremos descrever um método para a indução in vitro da agregação térmica da AICD e análise por microscopia de força atómica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica, biofísica e estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares na agregação AICD.
Protocol
1. Expressão de domínio recombinante APP intracelular (AICD)
- E. Transformação coli BL21 com AICD humana (resíduos 649-695 de APP, isoforma neuronal de numeração) clonado no vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Este vector expressará AICD como a porção C-terminal de uma proteína de fusão de glutationa-S-transferase (GST). Este vector também codifica uma sequência de clivagem pela trombina para facilitar a remoção da porção GST. Detalhes da clonagem AICD em pGEX-4T-1 pode ser encontrada na nossa publicação anterior 4.
- A partir de uma colónia isolada, inocular 10 ml de caldo de LB com ampicilina (100 jig / ml) e incubar durante a noite a 37 ° C com agitação vigorosa.
- Na manhã seguinte, inocular 400 ml de LB / ampicilina, num balão de um litro com 5 ml da cultura durante a noite.
- Incubar a 37 ° C com agitação vigorosa até a densidade óptica a 600 nm ter atingido 0,4 e 0,6. Isto normalmente levar de 2 a 2,5 horas.
- Induzem a expressão de GST-AICD pela adição de 0,4 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Incubar a 37 ° C com agitação vigorosa durante 5 horas.
- Centrifugar as células a 6.000 xg durante 15 min a 4 ° C. O pelete de células pode ser armazenada a -80 ° C durante vários meses, neste ponto do procedimento.
2. Purificação de GST-AICD
- Preparar 50 ml de tampão de lise como se segue: 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,1% de Triton-X100, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), cocktail inibidor de protease completo (Roche Applied Science), e solução salina tamponada com fosfato. Relaxar no gelo.
- Descongelar pelete bacteriana (se previamente congelado) emgelo.
Neste ponto, é importante que todos os passos são realizados a 4 ° C para limitar a proteólise. Todos os tubos, tampões, e outros reagentes devem ser pré-arrefecida. Se usar uma imprensa francesa ou emulsificante para lise, estes devem ser pré-refrigerados também.
- Completamente ressuspender o sedimento bacteriano em 20 ml de tampão de lise. Uma combinação de centrifugação e a trituração com 10 ml de pipeta em gelo assegurará completa ressuspensão do sedimento.
- Passar as células ressuspensas bacterianas através de um emulsionante (por exemplo, Avestin EmulsiFlex-C3) ou célula de pressão Francesa, pré-refrigerada a 4 ° C a 30000 psi. Passar o lisado por o emulsionante uma segunda vez. Recolher o lisado para um tubo de ml pré-refrigerada 50.
A principal vantagem destes dois instrumentos é que eles minimizar o aquecimento da amostra. A técnica normalmente usada de sonicação produz calor significativo na ponta da sonda de ultra-sons epode resultar em agregação de proteínas recombinantes.
- Centrifuga-se o lisado a 15.000 xg durante 30 min. Separa-se e manter-se o sobrenadante para um tubo de ml pré-refrigerada 50.
- Adicionar 500 ul de uma suspensão a 50% de esférulas de glutationa-agarose (Sigma-Aldrich). Rodar durante 30 min a 4 ° C. Enquanto a amostra está a rodar, fazer de tampão de eluição fresco: 50 mM de Tris 7,8, 0,1% de Triton X100, 0,5 mM de ditiotreitol, 10 mM de glutationa reduzida.
O único passo do protocolo, que é realizado à temperatura ambiente é o passo de eluição. Assim, o tampão de eluição é mantida à temperatura ambiente. Tampão de eluição deve ser preparada.
- Verter o lisado e lama numa coluna de cromatografia de 5 descartável "poliestireno com grosseiras (90-130 mm) (filtros Evergreen Scientific). Lava-se a coluna 5 vezes com 3 ml de solução salina tamponada com fosfato.
- Tapar a parte inferior da coluna e adicionar 500 ul de tampão de eluição de temperatura ambiente. Tapar o topo dacoluna e girar durante 5 min à temperatura ambiente. Recolher o eluato num refrigerados tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita a eluição mais duas vezes (1,5 ml eluato total).
- Dialisar o eluato num molecular da membrana de diálise de corte de peso 10000 (por exemplo, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer de diálise cassetes) em 4 litros de solução salina tamponada com fosfato durante a noite a 4 ° C. Dializar contra um adicional de 4 litros de tampão fosfato salino a 4 ° C durante 1 hora no dia seguinte.
- Remover a proteína a partir da cassete de diálise e realizar um ensaio de quantificação de proteína para determinar o rendimento de GST-AICD. Uma purificação típica de 400 ml de cultura irá resultar em rendimentos de> 20 mg de proteína purificada em concentrações de 10-20 mg / ml. Alíquota da proteína em alíquotas de 200 ul e congelar a -80 ° C.
3. A clivagem de trombina de GST-AICD e Purificação de AICD
- Ul descongelamento 200 das purificada GST-AICD e adicionar 20 ul de uma Thromb U / ulpol Incubar durante a noite a 37 ° C.
A qualidade e pureza da trombina varia consideravelmente entre os fabricantes, e pode ser uma importante fonte de contaminação. Usamos trombina da GE Healthcare (ver tabela de reagentes). Após incubação durante a noite,> 95% da proteína de fusão deve ser clivado (Figura 1B).
- Após a clivagem com trombina durante a noite, é provável que uma fracção da AICD libertada foi submetido a agregação e a solução pode parecer turva. Limpar o material agregado por centrifugação a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de pré-arrefecida.
- Adicionar 50 ul de 50% de esférulas de glutationa-agarose a suspensão aquosa e 50 ul de 50% de p-aminobenzamidina-agarose suspensão para remover GST e da trombina, respectivamente. Incubar com rotação durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugar brevemente para sedimentar as esferas de agarose, e remover o sobrenadante para um novo tubo. Extrair tele GST mais quatro vezes com glutationa-agarose. A única extracção com p-aminobenzamidina-agarose é suficiente para remover o U 20 da trombina.
- Executar um ensaio de quantificação de proteínas em 5 ul da AICD purificada. Os rendimentos típicos a partir de uma cultura de 400 ml são 50-100 ug, a uma concentração de 0,2 a 0,5 mg / ml. Rendimentos mais altos são possíveis por meio de clivagem de volumes maiores de GST-AICD.
Purificada AICD deve ser preparado para a caracterização bioquímica / biofísica. Material não utilizado deve ser descartado. Também é possível concentrar a AICD por liofilização da amostra e ressuspensão em um pequeno volume de tampão 6. Se detectar AICD requer blotting (tal como após uma armadilha de filtro ou de ensaio dot blot), a recuperação do antigénio da membrana deve ser realizada como descrito por Pimplikar Suryanarayana e 12.
4. Agregação AICD de Microscopia de Força Atômica (AFM)
- Diluir preparado de fresco AICD em phosphate solução salina tamponada a uma concentração de 0,1 mg / ml num volume final de 15 ul. Neste ponto, vários compostos e / ou proteínas podem ser adicionados, para determinar se eles inibem a agregação AICD. Por exemplo, demonstramos que as concentrações equimolares de ubiquilin-1 prevenir a agregação de AICD neste ensaio 4.
Também é possível acrescentar um maior volume de reacção para experiências bioquímicas, tais como ensaios de armadilha de filtragem e de espalhamento de luz 4. Tivemos sucesso realizando ensaios de armadilha de filtro em misturas reaccionais tão grande como 400 ul com AICD diluído para concentrações tão baixas como 1 uM.
- Induzir a agregação térmica por incubação das amostras a 43 ° C com agitação a 800 rpm num Thermomixer de Eppendorf durante 48 horas. Esta temperatura foi escolhida com base em ensaios que examinam a chaperones agregação térmica do modelo da citrato sintase chaperone substrato 4,13.
- Dilui-se a amostra 20 vezes em água desionizada e ul ponto 2 sobre mica clivada de fresco. Seca-se a amostra num exsicador durante a noite. Será necessário determinar empiricamente a diluição óptima para a imagiologia, e, portanto, várias diluições que variam de 10 - e 100 vezes seria prudente.
- Visualize a AICD agregado utilizando a operação AFM em modo de tocar 14. As vigas são utilizados ouro revestidas com nitreto de micro alavancas afiados (MSNL, Bruker), com um raio da ponta nominal de 2 nm. Típico tocando durante amplitudesção de imagem são 10-20 nm, a frequência de ressonância das consolas (30-50 kHz).
Nós descobrimos que a qualidade da imagem e do contraste de agregados de proteínas diferentes dependia da força aplicada e da duração da experiência. Para minimizar a perturbação da amostra pela ponta, é mantida a força aplicada relativamente baixo, mantendo uma relação de set-point acima de 95% e limitando o varrimento de cada uma das amostras de 5-10 min. Processamento de imagem foi realizada com WSxM software (Nanotec). Processamento de imagem padrão consiste em avião subtração e achatamento. Nossos laboratórios utilizam uma "casa-construída" AFM 15, interligados a um sistema de digitalização sonda comercial controle microscópio (Nanotec).
5. Resultados representativos
A expressão e um enriquecimento relativo de GST-AICD é mostrado na Figura 1A. Após a lise, a maior parte da proteína de fusão está presente na fracção solúvel e, portanto, a extracção a partir de inclusiem órgãos não é necessária. O material eluído da coluna de agarose de glutationa é> 95% puro. Na preparação mostrado na Figura 1, a concentração de proteína eluída da coluna foi de 14,5 mg / ml, e o rendimento foi de 22 mg (a partir de uma cultura inicial de 400 ml). A clivagem de 200 ul da preparação, durante a noite, com 20 U de trombina resultou em quase 100% de clivagem da proteína de fusão (Figura 1B). A quantidade de trombina utilizada é suficientemente baixo para não ser detectáveis por coloração com azul de Coomassie (ver "Clivadas" pista Figura 1B). A remoção da trombina e GST resultou em alguma perda de material, no entanto, foi> 90% puro com um rendimento nesta preparação de 70 ug de AICD, a uma concentração de 0,35 mg / ml. Figura 1C mostra o diagrama de fluxo para a agregação de AICD e subsequente análise. Agregados AICD fotografada por AFM são tipicamente esferoidais / amorfa, e variam em tamanho de 50 a 100 nm (Figura 1D, F). Agregadomaterial não é detectável, quando uma quantidade equimolar da chaperona ubiquilin-1 é adicionado à reacção de agregação (Figura 1E) 4.
Figura 1. Purificação e agregação de AICD. A) Coloração com azul de Coomassie de amostras recolhidas em cada passo do processo de purificação. Para as amostras não induzidas e induzidas, 20 uL de bactérias totais foram corridas no gel. Para a fracção sobrenadante, 5 ul de lisado (a partir de um volume total de 20 ml), foram executados no gel. Para a fracção de sedimento, o sedimento foi ressuspenso em 20 ml de tampão de lise, e 5 ul deste material foram sonicadas num sonicador de banho de água durante 30 min a 4 ° C antes do carregamento para o gel. Para o fluxo contínuo, 5 pi foram corridos no gel. As quantidades de líquido eluído carregadas no gel são indicadas. B) de Coomassie azul do gel corado não clivada e clivada GST-AICD (2 ul) e 1 e 5 m &u; l purificada AICD. C) Fluxograma de purificação AICD, agregação e análise. D, E) representativas de imagem AFM termicamente agregada AICD na ausência (D) e na presença (E) da chaperona molecular ubiquilin-1. F) Histograma da distribuição de tamanho de agregados AICD.
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Discussion
Neste protocolo temos delineado um procedimento para obter AICD altamente puro para análises estruturais, biofísicos e bioquímicos. Este procedimento não requer equipamento sofisticado cromatografia e é, portanto, acessível para a maioria dos laboratórios. Outros grupos têm purificada AICD 5-7,16, incluindo GST-AICD 17-19, para as análises bioquímicas / estrutural. Desvantagens aos protocolos anteriores incluem fraca solubilidade do AICD 16, menos do que ideal pureza 17, e o requisito de exclusão de tamanho 16 ou cromatografia de fase inversa 6,20. Assim, o protocolo descrito aqui deve facilitar grandemente os estudos in vitro de AICD. Também foi descrito um método para a agregação térmica do AICD e detecção por AFM. Embora cada vez mais utilizado no campo amilóide 21, AFM é uma técnica altamente especializada. Ensaios mais approachable tais como a dispersão de luz, sedimentação, e ensaios de armadilha de filtro pode tambémser usado para examinar a agregação térmica do AICD 4. Finalmente, a capacidade de examinar directamente in vitro a capacidade dos purificado chaperonas moleculares, tais como ubiquilin-1 4, para impedir a agregação térmica do AICD abre a porta para elucidar o papel funcional de outros chaperones citosólicos em biologia APP modulante.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) para a APP cDNA. Este trabalho foi financiado pelo NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), o John Sealy Memorial Fund Endowment for Biomedical Research (AFO), e Jean C. e D. William Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB é um estudioso do Programa de Pesquisa Translacional Scholar e membro da Universidade do Texas Medical Sucursal Claude E. Pimenta antiga americanos Independência Centro (apoiado pelo NIH UL1RR029876 e P30-AG-024832, respectivamente).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
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