Summary
Метод крупномасштабной очистки APP внутриклеточного домена (AICD) описывается. Мы также описать методологию, чтобы побудить
Abstract
Белка-предшественника амилоида (APP) представляет собой трансмембранный типа я белка, связанного с патогенезом болезни Альцгеймера (AD). APP характеризуется большой внеклеточный домен и короткий цитозольного домена называется APP внутриклеточного домена (AICD). Во время созревания через секреторный путь, APP могут расщепляться протеазами называется α, β, γ и-секретазы 1. Последовательное протеолитического расщепления APP с β и γ-секретазы приводит к образованию небольшого пептида протеолитические, называется Ар, который является амилоидогенных и основной составляющей старческих бляшек. AICD также освобожден от мембраны после обработки секретазы, и через взаимодействие с Fe65 и Tip60, можно перемещать в ядро участвовать в регуляции транскрипции нескольких генов-мишеней 2,3. Белок-белковые взаимодействия, связанные с AICD могут повлиять на торговлю, обработку и клеточных функций голо-APP и C-терминологиюАль-фрагментов. Недавно мы показали, что AICD можете совокупности в пробирке, и этот процесс тормозится AD-замешан молекулярного шаперона ubiquilin-1 4. В соответствии с этими выводами, AICD выявила гидрофобных доменов, и внутренне неупорядоченным в пробирке 5,6, однако он получает стабильную вторичную структуру при связывании с Fe65 7. Мы предположили, что ubiquilin-1 предотвращает нарушение меж-и внутримолекулярных взаимодействий AICD, предотвращая агрегацию в пробирке и в неповрежденные клетки 4. Хотя большинство исследований сосредоточена на роли АЭС в патогенезе БА, роль AICD в этом процессе не ясно. Выражение AICD было показано, индуцируют апоптоз 8, для модуляции сигнальных путей, 9 и регулировать кальция сигнализации 10. Сверхэкспрессия AICD и Fe65 в трансгенных мышах вызывает болезнь Альцгеймера, как патология 11, а в последнее время AICD был обнаружен в бюстгальтерВ лизатов с помощью вестерн-блоттинга при использовании соответствующего антигена поиска методов 12. Для облегчения структурных, биохимических и биофизических исследований AICD, мы разработали процедуру для получения рекомбинантных большого количества очень чистой AICD белка. Мы также описать способ индуцирования в пробирке тепловой агрегации AICD и анализ атомно-силовой микроскопии. Методы, описанные полезны для биохимических, биофизических и структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на AICD агрегации.
Protocol
1. Экспрессия рекомбинантного APP внутриклеточного домена (AICD)
- Transform E. Штамм BL21 с человеческим AICD (остатки 649-695 АРР, нейронные изоформы нумерации) клонировали в векторе pGEX-4Т-1 (GE Healthcare). Этот вектор будет выражать AICD как С-концевой фрагмент гибридный белок глутатион-S-трансферазы (GST). Этот вектор также кодирует последовательность расщепления тромбином для облегчения удаления фрагмента GST. Подробная информация о клонировании AICD в pGEX-4Т-1 можно найти в нашей предыдущей публикации 4.
- С одной колонии, привить 10 мл LB бульоне с ампициллином (100 мкг / мл) и инкубировали в течение ночи при 37 ° C при сильном встряхивании.
- На следующее утро, привить 400 мл LB / ампициллин в одну литровую колбу с 5 мл ночной культуры.
- Инкубировать при 37 ° С при интенсивном встряхивании до оптической плотности при 600 нм достигла 0,4 до 0,6. Это обычно занимает от 2 до 2,5 часов.
- Индуцируют экспрессию GST-AICD добавлением 0,4 мМ изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG). Инкубировать при 37 ° С при интенсивном встряхивании в течение 5 часов.
- Центрифуга клетки при 6000 х г в течение 15 мин при 4 ° C. Осадок клеток могут храниться при -80 ° C в течение нескольких месяцев на данном этапе процедуры.
2. Очистка GST-AICD
- Подготовка 50 мл буфера для лизиса следующим образом: 1 мМ ДТТ, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), полный коктейль ингибиторов протеаз (Roche Applied Science), и фосфатным буферным раствором. Охладить на льду.
- Оттепель бактериальных гранул (если ранее замороженных) нальда.
В этот момент очень важно, чтобы все действия выполняются при 4 ° С для ограничения протеолиза. Все трубы, буферы и другие реагенты должны быть предварительно охлажденным. При использовании французской прессе или эмульгатор для лизиса, они должны быть предварительно охлажденное, а также.
- Тщательно ресуспендируйте бактериальных гранул в 20 мл буфера для лизиса. Сочетание встряхивания и растирания с 10 мл пипетки на льду будет обеспечивать полное ресуспендирования гранул.
- Передайте ресуспендированных бактериальных клеток через эмульгатор (например, Авестина EmulsiFlex-C3) или французского ячейки давления, предварительно охлажденный до 4 ° C на 30000 фунтов на квадратный дюйм. Передайте лизат через эмульгатор второй раз. Сбор лизат в предварительно охлажденный 50 мл трубки.
Основным преимуществом этих двух документов является то, что они минимизируют нагрева образца. Обычно используется техника ультразвука создает значительные тепла на кончик зонда и ультразвукомможет привести к агрегации рекомбинантных белков.
- Центрифуга лизата при 15000 х г в течение 30 мин. Отделите и держать супернатанта в предварительно охлажденный 50 мл трубки.
- Добавить 500 мкл 50% суспензии глутатион-агарозы (Sigma-Aldrich). Поворот в течение 30 мин при 4 ° C. В то время как образец вращается, делает свежего буфера элюирования: 50 мМ Трис 7,8, 0,1% Triton-X100, 0,5 мМ ДТТ, 10 мМ восстановленный глутатион.
Единственный шаг протокол, который проводился при комнатной температуре элюции. Таким образом, элюирующего буфера хранится при комнатной температуре. Элюции буфером должны быть готовы свежие.
- Залить лизат и шлама в одноразовый 5 "колоночной хроматографии полистирола с грубыми (90-130 мкм), фильтры (Evergreen Scientific). Промойте колонку 5 раз с 3 мл фосфатным буферным раствором.
- Закройте нижнюю часть колонны и добавить 500 мкл буфера элюирования номере температуры. Закройте верхнюю частьколонки и вращаться в течение 5 мин при комнатной температуре. Собрать элюат в охлажденный 1,5 трубку микроцентрифуге мл. Повторите элюирования еще два раза (1,5 мл элюата общего).
- Диализировать элюата в 10,000 молекулярная масса отсечки диализной мембраны (например, Thermo Scientific Slide-A-анализатора диализа кассеты) в 4 л фосфатный буферный раствор в течение ночи при 4 ° C. Диализ против дополнительных 4 литра фосфатным буферным раствором при 4 ° С в течение 1 часа на следующий день.
- Удалить белка из диализ кассеты и выполнения анализа белков для определения количественного выхода GST-AICD. Типичный очистка от 400 мл культуры приведет к выходам> 20 мг очищенного белка в концентрации 10-20 мг / мл. Аликвотировать белка в 200 мкл аликвоты и заморозить при температуре -80 ° C.
3. Тромбин Расщепление GST-AICD и очистка AICD
- Оттепель 200 мкл очищенного GST-AICD и добавить 20 мкл 1 ед / мкл Thrombдюйм Инкубируют в течение ночи при 37 ° C.
Качество и чистота тромбина значительно варьирует среди производителей, и может быть значительным источником загрязнения. Мы используем тромбина от GE Healthcare (см. таблицу реагентов). После инкубации в течение ночи> 95% слитого белка должно быть расщеплен (рис. 1б).
- После ночного расщепления тромбином, вполне вероятно, что часть освобожденных AICD прошли агрегации и решение может появиться облачность. Снимите агрегированного материала путем центрифугирования при 20000 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Удалить супернатант в предварительно охлажденный пробирке.
- Добавить 50 мкл 50% глутатион-агарозы суспензии и 50 мкл 50% р-aminobenzamidine-агарозы суспензии для удаления GST и тромбин, соответственно. Инкубируйте с вращением в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга кратко осадка агарозном бисером, и удалите супернатант в новую пробирку. Извлечение тОн GST еще четыре раза с глутатион-агарозы. Один экстракции р-aminobenzamidine-агарозы достаточно, чтобы удалить 20 U тромбина.
- Выполнить анализ белков количественного по 5 мкл очищенного AICD. Типичные выходы из 400 мл культуры 50-100 мкг в концентрации от 0,2 до 0,5 мг / мл. Повышение урожайности возможно путем расщепления больших объемов GST-AICD.
Очищенный AICD должны быть готовы свежие для биохимических / биофизических характеристик. Неиспользованный материал должен быть уничтожен. Кроме того, можно сосредоточиться AICD путем лиофилизации образца и ресуспендирования в меньшем объеме буфера 6. Если обнаружение AICD требует блоттинга (например, после фильтра ловушки или дот-блот анализа), антиген поиска на мембране должна быть выполнена, как описано Pimplikar и Suryanarayana 12.
4. AICD агрегации для атомно-силовой микроскопии (АСМ)
- Развести свежеприготовленный AICD в рhosphate буферный раствор с концентрацией 0,1 мг / мл в конечном объеме 15 мкл. На данный момент, различные соединения и / или белки могут быть добавлены, чтобы определить, если они тормозят агрегацию AICD. Например, мы показали, что эквимолярной концентрации ubiquilin-1 предотвращения агрегации AICD в этом тесте 4.
Кроме того, можно объединять большие объемы реакции для биохимических экспериментов, таких как фильтр анализы ловушку и рассеяние света 4. Мы имели успех выполнения анализов фильтр ловушки на реакционной смеси такого размера, как 400 мкл с AICD разбавляют до таких низких концентрациях, как 1 мкМ.
- Вызвать тепловой агрегации путем инкубации образцов при 43 ° C при встряхивании со скоростью 800 оборотов в минуту в Eppendorf Thermomixer течение 48 часов. Эта температура была выбрана основаны на сопровождающих анализов, которые исследуют тепловой агрегации подложки модель шаперона цитрат-синтазы 4,13.
- Развести образца 20-кратный в деионизированной воде и месте 2 мкл на свежесколотых слюды. Высушите образца в эксикаторе в течение ночи. Это будет необходимо эмпирически определить оптимальные разведения для работы с изображениями, и таким образом несколько разведений от 10 - до 100-кратного бы разумным.
- Визуализируйте агрегированных AICD с помощью операционной AFM в освоении режиме 14. Консолей используются с золотым покрытием микро резкое рычаги нитрида (MSNL, Bruker) с номинальным радиусом кончика 2 нм. Типичные нажав амплитуды мажорния изображений на 10-20 нм на резонансной частоте консолей (30-50 кГц).
Мы обнаружили, что качество и контрастность изображения различных агрегатов белка зависит от приложенной силы и продолжительности эксперимента. Чтобы свести к минимуму образца возмущение чаевые, мы сохранили применять силу относительно низкой, сохраняя заданное соотношение выше 95% и ограничение сканирования каждого образца до 5-10 мин. Обработка изображений проводили с WSxM программного обеспечения (Nanotec). Стандартная обработка изображений состояла из плоскости вычитание и уплощение. Наши лаборатории используют "домашний построен" АСМ-15 сопряжена с коммерческими сканирующего зондового микроскопа системы управления (Nanotec).
5. Представитель Результаты
Выражения и относительного обогащения GST-AICD показано на рисунке 1а. После лизиса, большинство из слитого белка присутствует в растворимой фракции, и, следовательно, извлечение из inclusiна телах не требуется. Материал элюировали из колонки глутатион агарозном составляет> 95% чистой. При подготовке показано на рисунке 1, концентрация белка элюировали из колонки составила 14,5 мг / мл, а доходность составила 22 мг (от исходной культуры на 400 мл). Расщепление 200 мкл этого препарата в течение ночи с 20 U тромбина в результате почти 100% расщепления гибридного белка (рис. 1б). Количество тромбина использовали достаточно низкой, чтобы не быть обнаружены путем окрашивания Кумасси синим (см. "Расколотая" переулок, Рис. 1b). Удаление тромбина и GST привело к некоторой потере материала, однако это было> 90% чистой с выходом в этой подготовительной из 70 мкг AICD в концентрации 0,35 мг / мл. Рис. 1С показана схема для агрегации AICD и последующего анализа. AICD агрегатов изображается AFM, как правило, сфероид / аморфным, и варьируются в размерах от 50 до 100 нм (рис. 1D, F). СовокупныйМатериал не поддается обнаружению при эквимолярного количества сопровождающих ubiquilin-1 добавляют в реакцию агрегации (рис. 1E) 4.
Рисунок 1. Очистка и агрегации AICD.) Кумасси синего окрашивания образцов, собранных на каждом этапе процесса очистки. Для неиндуцированных и индуцированные образцов 20 мкл от общего числа бактерий проводили на геле. Для фракции супернатанта, 5 мкл лизатов (от общего объема 20 мл) проводили на геле. Для фракции гранул, осадок суспендируют в 20 мл буфера для лизиса, и 5 мкл этот материал обрабатывали ультразвуком в ультразвукового водяной бане в течение 30 мин при 4 ° C до погрузки на гель. Для расходе, 5 мкл были работать на геле. Количество элюата загружены на гель указаны. B) кумасси синим окрашенный гель нерасщепленного и дрова GST-AICD (2 мкл) и 1 и 5-мU; л очищенного AICD. C) Блок-схема AICD очистки, агрегации и анализа. D, E) представитель АСМ изображение термически объединяются AICD в отсутствии (D) и наличие (E) молекулярного шаперона ubiquilin-1. F) Гистограмма распределения по размерам AICD агрегатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы наметили порядок получения особо чистой AICD для структурных, биофизических и биохимических анализов. Эта процедура не требует сложного оборудования хроматографии и, следовательно, доступными для большинства лабораторий. Другие группы, очистив AICD 5-7,16, в том числе GST-AICD 17-19, для биохимического / структурного анализа. Недостатки в предыдущие протоколы включают плохой растворимости AICD 16, меньше, чем идеал чистоты 17, и требования к размеру исключением 16 или хроматография с обращенной фазой 6,20. Таким образом, протокол описанные здесь, должны значительно облегчить лабораторные исследования в AICD. Мы также описали метод тепловой агрегации AICD и обнаружения с помощью АСМ. Хотя чаще используется в амилоида поле 21, AFM является узкоспециализированной техники. Более доступным анализов, таких как рассеяние света, седиментация, и фильтр анализы ловушка может такжебыть использован для изучения тепловой агрегации AICD 4. Наконец, способность исследовать непосредственно в пробирке способность очищенного молекулярных шаперонов, таких как ubiquilin-1 4, чтобы предотвратить тепловой агрегации AICD открывает двери для выяснения функциональной роли других цитозольного шаперонов в модуляции биологии APP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Хуэй Чжэн (Медицинского колледжа Бэйлора) для APP кДНК. Эта работа финансировалась грантами NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (АФК), Джон Сили мемориальный благотворительный фонд для биомедицинских исследований (АФК), и Жан С. и Уильяма Д. Уиллис Neuroscience исследований фонда (ESS). JMB является ученым в Поступательное Программа научный сотрудник и член Техасском университете Медицинского отделения Клод Пеппер пожилых американцев Независимости центра (при поддержке грантов NIH UL1RR029876 и P30-AG-024 832, соответственно).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
- De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
- Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
- McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer's disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
- Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
- Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
- Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
- Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
- Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
- von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
- Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
- Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
- Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
- Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
- Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
- Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
- Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
- Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
- Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
- Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
- Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
- Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).
