Summary
גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.
Abstract
זיהוי של גרעיני cardiomyocyte כבר מאתגר בסעיפים רקמות כמו רוב אסטרטגיות לסמוך רק על חלבונים סמן cytoplasmic 1. אירועים נדירים מיוציטים לב כגון התפשטות אפופטוזיס מחייבים זיהוי מדויק של גרעיני myocyte לב לנתח חידוש הסלולר הומאוסטזיס ובתנאים פתולוגיות 2. כאן, אנו מספקים שיטה לבודד את הגרעינים cardiomyocyte מרקמות מורטם הודעה על ידי שקיעה צפיפות immunolabeling עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) ומיון לאחר cytometry הזרימה. אסטרטגיה זו מאפשרת ניתוח התפוקה בידוד גבוה עם יתרון של עובד באותה מידה על רקמות טרי חומר ארכיוני קפוא. זה מאפשר ללמוד החומר שנאסף כבר biobanks. טכניקה זו ישימה ונבדקו מגוון רחב של מינים מתאימים ליישומים רבים במורד הזרם כמו פחמן 14 תיארוך 3, תאים סיCLE ניתוח 4, ויזואליזציה של אנלוגים תימידין (למשל BrdU ו IdU) 4, ניתוח transcriptome ו epigenetic.
Protocol
1. הבידוד של גרעינים לב
- Ultracentrifuge המעיל צינורות (צינורות Beckman צנטריפוגות # 363664) עם 10 מ"ל של תמיסת BSA / PBS 1% ציפוי. מכסה צינורות ולתת להם להסתובב למשך 30 דקות ב Rotator צינור. הסר את פתרון הציפוי ולתת צנטריפוגות צינורות אוויר יבש (1 צינור לכל הלב העכבר נדרש ניתוח לב עכבר אחת, לסירוגין עד 5 לבבות עכבר או 1 גרם של רקמת לב ממספר זנים שונים (למשל אדם) יכול להיות מעובד בצינור 1).
- כל השלבים הבאים יש לבצע על הקרח. לנתח את החדר השמאלי של הלב העכבר טרי או קפוא הצמד עם אזמל. שים לב, פרוטוקול זה הוא מותאם במיוחד הלב העכבר אבל יכול גם להיות מותאם חולדה או לב אנושי. לחלופין, השתמש עד 1 גרם של רקמת לב מכמה מינים שונים.
- חתוך את הדגימה לתוך תאים קטנים עם אזמל.
- מעבירים את חתיכות רקמה לתוך צינור פלקון 50 מ"ל 15 מ"ל מלא של המאגר תמוגה.
- Homogenizeרקמת לב עם T-25-Ultra Turrax בדיקה homogenizer (איקא) בסל"ד 24,000 עבור 10 שניות.
- לדלל את homogenate עם נפח שווה של חיץ תמוגה ל 30 מ"ל.
- השתמש כוס douncer (40 מ"ל) כדי להמשיך homogenize רקמות גרעינים חינם. לבצע שמונה משיכות עם העלי אישור גדולה.
- להעביר את הגרעינים גולמי לבודד באמצעות 100 מיקרומטר ו 70 מיקרומטר רשת ניילון התא מסננת (BD Biosciences), ברציפות.
- לסובב את הגרעינים גולמי לבודד בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10.
- הסר את supernatant בקפידה על ידי צינורות היפוך ולנגב את פנים הצינור עם מגבת נייר. להיזהר לא להפריע גרעינים גלולה.
- ממיסים את הגרעינים גולמי לבודד ב 5 מ"ל של חיץ סוכרוז על ידי pipetting הפתרון מספר פעמים למעלה ולמטה. הוסף עוד 25 מ"ל של חיץ סוכרוז כדי גלולה המומס.
- הוסף 10 מ"ל של חיץ סוכרוז מוכן טרי לצינור ultracentrifuge מצופה (ראה שלב 1.1). </ Li>
- בזהירות כיסוי מ"ל מוסף 10 של המאגר סוכרוז עם גרעינים גלולה resuspended מומס חיץ סוכרוז משלב 1.9.
- יתרה צינורות צנטריפוגות לפני הצבתם לתוך הרוטור JS13.1 מתנדנד חופשי למקם את הרוטור לתוך הצנטריפוגות במהירות גבוהה (Beckman אוואנטי-S 25).
- ספין גרעיני מדגם XG ב 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
- כאשר ספין השלימה, להסיר את צינורות בקפידה מתוך הרוטור וזורקים supernatant ידי צינורות היפוך ומוחה את הפסולת שנותרה מבפנים של צינורות עם מגבת נייר.
- ממיסים את הגרעינים גלולה ב 1ml של למאגר אחסון גרעינים (NSB בתוספת חיץ). הערה: NSB פלוס מכיל 1.5 מ"מ spermine כמייצב DNA.
- המשך עם צעד 2.1, immunostaining של גרעיני cardiomyocyte.
2. Immunostaining עבור cytometry זרימה
- מכינים את השליטה שלילי immunostaining. קח את aliquot של 20 μl של המדגם גרעינים וdd 980 μl של NSB בתוספת חיץ.
- הוסף חומר אנטי pericentriolar 1 נוגדנים (הארנב נגד PCM-1, נוגדנים אטלס) מדגם גרעינים בדילול של 1:500 כדי גרעינים immunolabel cardiomyocyte. מוסיפים את הנוגדן isotype בדילול כמו נוגדנים נגד PCM-1 לשליטה שלילי, מוכן בשלב 2.1.
- דגירה שליטה שלילי צינור דגימה ב 4 ° C למשך הלילה.
- לשטוף את השליטה מדגם שלילי לפחות פעם אחת עם NSB בתוספת חיץ (לסובב את הצינורות בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. מחק supernatant ו לפזר את הגרעינים גלולה ב 1 מ"ל של NSB בתוספת חיץ).
- הוסף נגד ארנב נוגדנים משני ניאון (FITC או APC) לשליטה שלילי צינור דגימה בדילול של 1:1000.
- דגירה שליטה שלילי צינור דגימה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לשטוף את השליטה מדגם שלילי לפחות פעם אחת עם NSB בתוספת חיץ (לסובב את הצינורות בצנטריפוגה קירור (4 ° C) בשעה XG 700 דקות 10. מחק supernatant ו לפזר את הגרעינים גלולה ב 1 מ"ל של NSB בתוספת חיץ).
- להמשיך ניתוח זרימת מיון cytometric ו.
3. תזרים Cytometry
- גרעינים המעיל איסוף צינורות פלקון (15 מ"ל) עם פתרון BSA / PBS 1% לפני תחילת זרימת cytometry מיון כמתואר בשלב 1.1.
- סנן מדגם הביקורת השלילית דרך מסננת 30 מיקרומטר תא המטען הראשון הביקורת השלילית cytometer את זרימת (זרם BD). הגדר את השער הראשון והשני להגדיר גרעינים ו singlets (גרעינים אחת), המבוססת על פיזור קדימה (FSC), פיזור קדימה רוחב הפולס (רוחב הדופק FS) ולפזר בצד (SSC) (איור 2 א 'וב'). הוספת ה-DNA כתם (DRAQ5 (1:500)) המדגם יכול לעזור לזהות את האוכלוסייה גרעינים בתחילה.
- טען מדגם immunolabeled ולהגדיר את השער 3 לבודד גרעינים cardiomyocyte (PCM-1-positve) מן הגרעינים הלא cardiomyocyte (PCM-1-שלילי). להתחיל את המיון(איור 2 ג ו - ד).
אופציונלי: כדי לנתח את תוכן ה-DNA הגרעיני (ploidy) ולבצע ניתוח מחזור התא להוסיף DNA המתאים כתם על גרעינים (למשל Hoechst 33342 או DRAQ5) (איור 2 ה).
- לאחר מיון cytometry זרימה, הצב את הגרעינים על הקרח מחדש לנתח כדי לקבוע את טוהר מיון (איור 3 א 'וב').
- לסובב את הגרעינים למיין את צינורות לאיסוף XG 1500 בצנטריפוגה בקירור במשך 15 דקות.
- ממיסים את הגרעינים גלולה במאגר תואם יישום במורד הזרם.
4. נציג תוצאות
מורפולוגיה גרעינים ויושרה ניתן להעריך על ידי כתמי דנ"א דמיינו ידי מיקרוסקופ (איור 1). מוצלח PCM-1 תיוג ניתן להעריך על ידי מיקרוסקופ epifluorescence ועל ידי cytometry זרימה (איור 1, איור. 2C ו-D). PCM-1-positiיש ואוכלוסיות שליליות צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה (איור 2 ג ו - ד). ב החדר השמאלי Murine על 30% גרעינים כל צריך להיות cardiomyocyte גרעינים (איור 2). מיון טוהר אפשר להעריך מחדש על ידי ניתוח מיון גרעינים (איור 3 א 'וב'). שתי אוכלוסיות גרעינים צריך טוהר מיון עולה על 95%.
באיור 1. PCM-1 מזהה גרעינים cardiomyocyte. גרעינים לב (א) מגואלות נוגדנים ל PCM-1 (ב) ו Nkx2.5 (ג) בלב עכבר בוגר. (ד) PCM-1-שכותרתו גרעינים מוקפים בציטופלסמה cardiomyocyte (שרשרת כבדה שרירן (MHC)) ולהביע גורם שעתוק Nkx2.5, המתעד את זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte ידי מכתים-1 PCM (ברים בקנה מידה 20 ו -10 מיקרומטר מיקרומטר (ד, הבלעה)). (ה) מבודד גרעינים הלב דמיינו עם ה-DNA כתם DRAQ5. (F ו-G) Cardiomyocגרעינים yte מסומנים עם נוגדנים כנגד PCM-1 (מיקרומטר בהיקף 10 בר). שים לב, דפוס מכתים epinuclear של PCM-1 בגרעין myocyte בסעיף רקמות בגרעין מבודד (חיצים).
איור 2. תזרים מיון cytometric של גרעיני cardiomyocyte. (א) גרעיני לב מזוהים פיזור קדימה (FSC) וצד פיזור (SSC). (ב) שער 2 מזהה גרעינים אחד על ידי FSC ו FS רוחב פולס 5. (ג, ד) gating פלורסנט מאפשר הפרדת הגרעינים cardiomyocyte (PCM-1-חיובי) ולא cardiomyocyte (PCM-1-שלילי) גרעינים של רקמת לב. (ה) עכבר cardiomyocyte הם ברובם (> 80%) דיפלואידי (2n), רק קבוצה קטנה הוא tetraploid (4n) 6. שים לב, cardiomyocytes אדם להכיל תדירות גבוהה יותר של גרעינים polyploidy (> 2n) 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי מדויק של גרעיני cardiomyocyte הוא קריטי לניתוח תהליכי ההתחדשות של שריר הלב 2,3. טכניקות קונבנציונאלי לבודד מרקמות cardiomyocytes טרי מבוססים בעיקר על עיכול אנזימטי של חלבונים תאי מטריקס וטיהור הבאים מתאי ביניים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור נוסף של cardiomyocytes חיים מתאי גזע עובריים (ESC) יכול להתבצע על ידי immunolabeling עם סמנים פני השטח כגון SIRPA 9 או 10 צבעים המיטוכונדריה, cardiomyocytes קבועות ניתן לזהות על ידי סמנים cytoplasmic כגון שרשרת שרירן כבד (MHC) או חלבונים גרעיניים כגון GATA4 או Nkx2.5. עם זאת, הביטוי של Nkx2.5 ו GATA4 אינו מוגבל cardiomyocytes בוגרים, אבל ניתן לאתר גם במהלך הפיתוח לאחר אוטם לבבי 11,12 ב ובתאים. אסטרטגיות גנטיות לזיהוי cardiomyocytes להראות את הספציפיות הגבוהה ביותר, אבל גannot ליישם במודלים של בעלי חיים גדולים או בני אדם 1. המגבלות של אסטרטגיות קיימות הובילו למסקנות במחלוקת בהסתמך על כימות של אירועים נדירים, כמו אפופטוזיס התפשטות, chimerism 1,13. לכן, יש צורך להקים אסטרטגיה מדויקת לזהות ולטהר cardiomyocyte בוגרת גרעינים מובחן.
כאן אנו מתארים שיטה לטיהור מבוסס על חומר pericentriolar 1 (PCM-1). לפני כן, חיזקנו את תוקפו של בידוד גרעיני שלנו מראה כי שלושה סמנים גרעיניים בלתי תלויים, PCM-1, לב טרופונין T ו I, לזהות את האוכלוסייה cardiomyocyte אותו. 2,3 האוכלוסייה מזוכך הראו העשרה גבוהה של מוצרים cardiomyocyte גנים ספציפיים כגון כמו troponins לב, חלבון שרירן שרשרת כבדה ו גורם שעתוק Nkx2.5 ו GATA4 2,3.
הפרוטוקול הנוכחי, בהתבסס על PCM-1, יושם בהצלחה Fאו ניתוח מחזור cardiomyocyte אדם ועכבר 2,4, כמו גם ניתוח של פרופיל תעתיק cardiomyocyte 2. אנו צופים כי האסטרטגיה הציג יכול גם להיות מותאם לבידוד של cardiomyocytes ממינים אחרים. PCM-1, חלבון centrosome, מחדש localizes קרום הגרעין שם הוא מצטבר ויוצר מטריקס מסיס רק מיוציטים הבדיל 2,14 (איור 1). Cytometry זרימה מאפשר ניתוח מהיר של פניות מספר גבוה של תאים, אשר נדרש לכמת אירועים נדירים cardiomyocytes כמו אפופטוזיס מחזור התא מחדש הכניסה 15. יתר על כן, אנלוגים נוקלאוטידים (למשל BrdU) מבחני ההפצה מבוסס יכול להיות מיושם בקלות באמצעות הטכניקה הציגה שלנו 4. הטכניקה שלנו יש את היתרון כי תכולת ה-DNA של גרעיני cardiomyocyte אחד (ploidy גרעינית) יכול להיות מנותח cardiomyocytes multinuclear 16,17, המספק מידע חשובלהבחין בין שכפול cardiomyocyte ו polyploidisation 6-8. עם זאת, בשל אופייה של האסטרטגיה שלנו, אפיון multinucleation cardiomyocyte אינו אפשרי.
יישומים נוספים של שיטת הציג מחקרים התמקדו שינויים אפיגנטים המשנים של הכרומטין, נוקלאופרוטאינים, אינטראקציות protein-DNA/RNA ועל transcriptome גרעינית 18,19.
בגלל היציבות של גרעיני ברקמות להקפיא, להפשיר, בידוד הציג את האסטרטגיה גרעינים יכול לחול גם על רקמות קפואים, כך שניתן לנצל חומר גנוז biobanks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנחנו אוהבים להכיר מרסלו טורו לעזרה עם cytometry הזרימה. מחקר זה נתמך על ידי השוודי לב, ריאות וגם קרן, הנציבות של האיחוד האירופי FP7 "CardioCell", שוודית מועצת המחקר, AFA ביטוחים ו ALF. OB נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
- Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
- Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
- Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
- Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
- Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
- Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
- Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
- Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
- Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
- Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
- Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
- Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).
