Summary
心臓核密度沈降を介して分離し、フローサイトメトリーにより心筋細胞核を識別し、ソートするための中心体周辺物質1（PCM-1）に対する抗体で免疫標識されています。
Abstract
ほとんどの戦略は、唯一の細胞マーカータンパク質1に依存しているとして、心筋細胞の核の同定は、組織切片に挑戦されています。そのような増殖およびアポトーシスとして心筋細胞では稀なイベントは、心筋細胞核の正確な同定は、恒常性と病理学的状態2の細胞の更新を分析する必要があります。ここでは、中心体周辺物質1（PCM-1）およびそれ以降のフローサイトメトリー選別に対する抗体を用いた密度の堆積作用と免疫標識によって死後組織から心筋細胞核を単離する方法を提供します。この戦略は、新鮮な組織と凍結アーカイブ材料にも同様の作業の利点を有するハイスループット解析と分離することができます。これにより、既にバイオバンクで収集された材料を研究することができます。この手法は適用可能で、種の広い範囲でテストし、そのような炭素14年代測定3、セル-CYなどの複数のダウンストリームアプリケーションに適していますCLE分析4、チミジン類似体の可視化（例えば、BrdUとIDU）4、トランスクリプトームとエピジェネティクス解析。
Protocol
1。心臓核の単離
- 1％BSA / PBSコーティング溶液10mlとコート遠心管（Beckmanの遠心チューブ＃363664）。チューブにフタをし、それらがチューブローテーターで30分間回転させましょう。コーティング溶液を除去し、遠心チューブの空気乾燥した（マウスの心臓ごとに管が異なる種からの単一のマウスの心臓、交互に最大5つのマウスの心臓や心臓の組織の1グラムの分析のために必要とされるみましょう（例えば、ヒト）処理することができます1チューブで）。
- すべての次の手順は氷の上で実行する必要があります。メスで新鮮な、またはスナップインを凍結したマウスの心臓から左心室を解剖。 （注）このプロトコルは、マウスの心臓のために最適化されていますが、また、ラットやヒトの心臓に適合させることができます。また、異なる種から心臓組織の1グラムまで使用しています。
- メスの小さな個室に試料をトリミングします。
- 溶解緩衝液15ミリリットルを充填した50mlファルコンチューブに組織片を転送します。
- ホモジナイズ10秒24,000 rpmでT-25ウルトラタラックスプローブホモジナイザー（IKA）の心臓組織。
- 30ミリリットルに溶解用緩衝液と等量のホモジネートを希釈する。
- さらに組織と自由核を均一にガラスdouncer（40ミリリットル）を使用します。大クリアランス乳棒で8打を実行します。
- 連続して、100μmと70μmのナイロンメッシュセルストレーナー（BD Biosciences社）を介して分離し、粗核を渡します。
- 原油核スピンダウンし、10分間700×gで冷却遠心（4°C）に分離します。
- 反転管によって注意深く上清を除去し、ペーパータオルで管の内側を拭いてください。核ペレットを乱さないように注意してください。
- 原油核が上下にソリューションを数回ピペッティングしてショ糖緩衝液の5ミリリットルで分離溶解する。溶解したペレットに、ショ糖バッファのさらに25ミリリットルを追加します。
- コーティングされた遠心チューブ（ステップ1.1参照）に新たに調製し、ショ糖緩衝液10mlを追加します。</ LI>
- 慎重にステップ1.9からショ糖緩衝液に溶解し再懸濁した核ペレットを蔗糖バッファーの追加10ミリリットルを重ねる。
- JS13.1フリースイングローターにそれらを配置する前に、遠心チューブのバランスをとり、高速遠心機（ベックマンアヴァンティS-25）にローターを配置します。
- 60分間、4℃で13000×gで核サンプルをスピン。
- スピンが完了したとき、ロータから慎重にチューブを取り外し、反転チューブの上清を捨て、ペーパータオルのチューブの内側から、残りの破片を拭く。
- 核格納バッファの1ミリリットル（NSBプラスバッファ）で核ペレットを溶解する。注：NSBに加えて、DNAの安定剤として1.5mMのスペルミンが含まれています。
- 心筋細胞核の免疫染色は、ステップ2.1に進みます。
2。フローサイトメトリーのために免疫染色
- 免疫染色のために、ネガティブコントロールを用意します。核サンプルの20μlのアリコートを取り出し、NSB PlusバッファのDD 980μL。
- immunolabel心筋細胞核に1:500の希釈で核サンプルに抗中心体周辺物質1抗体（ウサギ抗-PCM-1、アトラス抗体）を追加します。ステップ2.1で調製したネガティブコントロールに抗-PCM-1抗体と同じ希釈でアイソタイプの抗体を追加します。
- 4℃で一晩、ネガティブコントロールとサンプルチューブをインキュベートします。
- NSBプラスバッファ（10分間700×gで冷却遠心（4℃）にチューブをスピンダウンし、上清を捨て、NSB Plusバッファの1ミリリットルで核ペレットを溶解）で少なくとも1回はネガティブコントロールとサンプルを洗浄します。
- 1:1000の希釈で、ネガティブコントロールとサンプルチューブに抗ウサギ蛍光二次抗体（FITCまたはAPC）を追加します。
- 1時間4℃で、ネガティブコントロールとサンプルチューブをインキュベートします。
- NSBプラスバッファ（10分間700×gで冷却遠心（4℃）にチューブをスピンダウンして、少なくとも一度はネガティブコントロールとサンプルを洗う。上清を破棄して）NSB Plusバッファの1ミリリットルで核ペレットを溶解する。
- フローサイトメトリー分析およびソートを続行します。
3。フローサイトメトリー
- 手順1.1で説明したようにソートし、フローサイトメトリーを開始する前に、1％BSA / PBS溶液で被覆核のコレクションチューブ（ファルコン15ミリリットル）。
- 30μmのセルストレーナーを通してサンプルとネガティブコントロールをフィルタリングし、フローサイトメーター（BD流入）に最初の負の制御をロードします。前方散乱光（FSC）、前方散乱パルス幅（FSパルス幅）と側方散乱（SSC）（ 図2AおよびB）に基づいて、核とシングレット（単核）を定義する第1および第2のゲートを定義します。サンプルにDNA染色（DRAQ5（1:500））を追加すると、最初に核の集団を識別するのに役立ちます。
- 免疫標識サンプルをロードし、非心筋細胞核（PCM-1陰性）から心筋細胞核（PCM-1高い正）を分離する第3のゲートを定義します。ソートを開始（ 図2cおよびd）。
オプション：核DNA量（倍数性）を分析し、核への染色適切なDNA（例えば、ヘキスト33342またはDRAQ5）（ 図2e）を追加し 、細胞周期の解析を実行するために。
- フローサイトメトリー選別した後、氷上に核を配置し、選別純度（ 図3AおよびB）を決定するために再分析します。
- 15分間冷却遠心機で1500×gでコレクションチューブ内のソート済み核スピンダウンする。
- 下流のアプリケーションと互換性の緩衝液中で核ペレットを溶解する。
4。代表的な結果
核の形態との整合性は、DNA染色により評価し、顕微鏡（ 図1）によって可視化することができます。成功したPCM-1標識は、落射蛍光顕微鏡により、フローサイトメトリー（ 図1、図2CおよびD）で評価することができる。 PCM-1-positiveと負の集団がよく（ 図2cおよびd）互いに分離する必要があります。マウスの左心室にすべての核の約30％が心筋細胞核（ 図2D）でなければなりません。純度のソートは、再分析ソート核（ 図3a及びb）によって評価することができる。両方の原子核の集団は95％を超えて選別純度を持っている必要があります。
図1。 PCM-1は心筋細胞の核を識別します。心臓核（）は、成体マウスの心臓にPCM-1（b）に及びNkx2.5（C）に対する抗体で染色されています。 （d）のPCM-1-標識心筋細胞の核細胞質に囲まれた（ミオシン重鎖（MHC））と転写因子Nkx2.5を発現し、PCM-1染色（スケールバーは20μmと10心筋細胞核の正確な識別を文書化されているμmの（D、挿入図））。 （e）のDNAを用いて可視化心臓核分離株はDRAQ5を染色する。 （FおよびG）Cardiomyocyte核は、PCM-1（スケールバーは10μm）に対する抗体で標識されています。 （注）、組織切片の筋細胞核内および単離された核（矢印）のPCM-1のepinuclear染色パターン。
図2。心筋細胞核のフローサイトメトリー選別（）心臓核は前方散乱光（FSC）と側方散乱（SSC）によって識別されます。 （b）は第二のゲートは、FSCとFSパルス幅5で、単一の核を識別します。 （c、d）の蛍光ゲーティングは、心臓組織から心筋細胞核の分離（PCM-1陽性）と非心筋細胞（PCM-1陰性）が核になります。マウスの心筋細胞はほとんど（> 80％）二倍体（2n）である（e）は、唯一の小さなサブセットの（4n）6倍体である。 （注）、人間の心筋細胞は倍数性核（> 2n）の7,8の高い周波数が含まれています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
心筋細胞核の正確な識別は、心筋2,3の再生過程の分析のために重要である。新鮮な組織から心筋細胞を分離する従来の手法は、主に細胞外マトリックスタンパク質の酵素消化と低速遠心分離により間質細胞からの後続の精製に基づいています。胚性幹細胞（ESC）から生きている心筋細胞のさらなる精製は、そのようなSIRPA 9またはミトコンドリアの染料10などの表面マーカーで免疫標識により行うことができ、固定の心筋細胞は、そのようなミオシン重鎖（MHC）あるいは次のような核タンパク質として細胞質のマーカーにより識別することができますGATA4またはNkx2.5。しかし、Nkx2.5とGATA4の発現は、成熟した心筋細胞に限定されず、また、開発中および心筋梗塞後の11,12前駆細胞で検出することができます。心筋細胞を識別するための遺伝的戦略は、最高の特異性が、Cを示してannotは、大規模な動物モデルやヒト1で適用されます。既存戦略の限界は、増殖、アポトーシスおよびキメラ1,13としてまれな事象の定量化に頼る論争の結論につながっている。したがって、成熟した分化した心筋細胞の核を識別し、精製する正確な戦略を確立する必要があります。
ここでは、中心体周辺物質1（PCM-1）に基づいて精製技術を説明します。以前、我々は3つの独立した核のマーカーPCM-1、心筋トロポニンTと私は、同じ心筋細胞集団を特定することを示すことによって私たちの核分離の妥当性を強化しました。2,3精製人口は心筋細胞の特定の遺伝子産物の高濃縮を示したような心臓トロポニン、ミオシン重鎖タンパク質と転写因子Nkx2.5とGATA4 2,3など。
PCM-1に基づいて、現在のプロトコルは、正常にfを適用されていますまたはヒトおよびマウスの心筋細胞売上高2,4と同様に心筋細胞の転写プロファイル2の分析のための分析。我々は提示戦略はまた、他の種からの心筋細胞の分離に適合させることができることを期待しています。 PCM-1、中心体タンパク質は、それが蓄積し核膜への再局在と分化した心筋細胞のみの2,14（ 図1）不溶性マトリックスを形成している。フローサイトメトリーは、アポトーシスや細胞周期再入国15と心筋細胞では稀なイベントを定量化するために必要とされる細胞の数が多いの迅速公平な分析を行うことができます。さらに、ヌクレオチド類似体（例えば、BrdU）のベースの増殖アッセイは、容易に私たちの提示手法4を使用して適用することができます。我々の技術は、単一心筋細胞核（核の倍数性）のDNA含有量は重要な情報を提供する多核心筋16,17で分析することができるという利点があります心筋細胞の複製とpolyploidisation 6月8日を区別する。しかし、我々の戦略の性質上、心筋細胞多核の特性評価を行うことはできません。
提示方法の更なるアプリケーションでは、クロマチンのエピジェネティックな変化、核タンパク質、protein-DNA/RNAの相互作用に、核トランスクリプトーム18,19に焦点を当てた研究である。
ので、凍結融解組織の核の安定性、提示核の分離戦略は、バイオバンクからアーカイブされた材料を利用することが可能となる、凍結した組織に適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
我々は、フローサイトメトリーの支援についてはマルセロ·トロに感謝したい。本研究では、スウェーデンのハートと肺財団、欧州委員会FP7 "CardioCell"、スウェーデンの研究評議会、AFA保険やALFによってサポートされていました。 OBは、ドイツ学術振興によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Lysis Buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.32 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM CaCl2 | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 2.0 mM EDTA | |||
| 0.5 mM EGTA | |||
| 1 mM DTT | |||
| 2. Sucrose buffer | |||
| Name of the reagent | |||
| 2.1 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | |||
| 5 mM magnesium acetate | |||
| 1 mM DTT | |||
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) | |||
| Name of the reagent | |||
| 0.44 M sucrose | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) | |||
| 70 mM KCl | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 1.5 mM spermine | |||
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam | ||
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies | ||
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies | ||
| DRAQ5 | Biostatus | ||
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences | ||
| Glass douncer (40 ml) and pestle "L" | VWR (Wheaton Industries Inc.) | ||
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany | ||
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany | ||
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR | ||
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter | ||
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter | ||
| Influx cytometer | Beckman Coulter | ||
| Tube Rotator | VWR |
References
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).
- Bergmann, O. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science. 324, 98-102 (1126).
- Walsh, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation. Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).
- Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122, 133-143 (2005).
- Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts. Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).
- Adler, C. P., Friedburg, H. Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age. Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).
- Dubois, N. C. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature. 29, 1011-1018 (2011).
- Hattori, F. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7, 61-66 (2010).
- Fransioli, J. Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium. Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).
- Elliott, D. A. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A. Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts. Circulation Research. 90, 634-640 (2002).
- Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation. BMC cell biology. 10, 28 (2009).
- Spoelgen, R. A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain. Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).
- Olivetti, G. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).
- Okada, S. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue. J. Vis. Exp. (20), e914 (2008).
