Summary
We beschrijven methoden voor het vaststellen
Abstract
Epitheliale eierstokkanker (EOCs) zijn de belangrijkste oorzaak van overlijden door gynaecologische maligniteit in de westerse samenlevingen. Ondanks de vooruitgang in chirurgische behandelingen en verbeterde op platina gebaseerde chemotherapie, is er weinig verbetering in de EOC overlevingscijfers voor meer dan vier decennia 1,2. Terwijl stadium I tumoren hebben 5-jaarsoverleving> 85%, overleving voor stadium III / IV ziekte zijn <40%. Zo kan de hoge sterftecijfers voor EOC aanzienlijk worden verlaagd als tumoren werden aangetroffen bij eerder, meer behandelbaar, podia 3-5. Momenteel wordt de moleculaire genetische en biologische basis van beginnende ziekte ontwikkeling slecht begrepen. Meer in het bijzonder, is er weinig bekend over de rol van de micro-omgeving tijdens tumorinitiatie, maar bekende risicofactoren voor EOCs (zoals leeftijd en pariteit) suggereren dat de micro-omgeving een belangrijke rol speelt in de vroege ontstaan van EOCs. Daarom ontwikkelde drie-dimensionale heterotypische modellenvan zowel de normale eierstok van beginnende eierstokkanker. Voor de normale ovarium, we co-gekweekte normale ovarium oppervlak epitheel (IOSE) en normale stromale fibroblasten (INOF) cellen geïmmortaliseerd door retrovrial transductie van de katalytische subeenheid van menselijk telomerase holoënzym (hTERT) om de levensduur van deze cellen in kweek te verlengen. De vroegste stadia van eierstokepitheliaalcellen celtransformatie, overexpressie van het oncogen in CMYC IOSE cellen opnieuw samen gekweekt met cellen INOF model. Deze heterotypische modellen werden gebruikt om de effecten van veroudering en veroudering onderzoeken op de transformatie en invasie van epitheelcellen. Hier beschrijven we de methodologische stappen in de ontwikkeling van deze driedimensionale model, deze methoden zijn niet specifiek voor de ontwikkeling van normale ovarium en eierstokkanker weefsels en kan worden gebruikt om andere weefseltypes waar bestuderen stromale en epitheelcellen interacties fundamenteel aspect van het weefsel onderhoud en diSease ontwikkeling.
Protocol
Figuur 1 toont een overzicht van de workflow hieronder beschreven.
1. Isolatie van normale fibroblasten en Ovarian Uitbreiding van in vitro levensduur door overexpressie van de katalytische subeenheid van het hTERT holoënzym
- Ovariële weefsels kunnen worden verzameld met geïnformeerde toestemming van de patiënt en de goedkeuring van de Institutional Review Board (voor Amerikaanse instellingen). Normaal ovariële weefsels kunnen worden verzameld na een totale abdominale hysterectomie of totale laparoscopische hysterectomie met bilaterale salpingo-ovariëctomie. In deze studie werden weefsels onderzocht door een patholoog en een gedeelte van de ovariële stroma biopsie voor celcultuur. Weefselmonsters van ongeveer 2-5 mm 2 werden geoogst uit het centrale gebied van de eierstokken om te proberen de kans ook proeven ovariële epithelia verminderen.
- Transport verse eierstokweefsel de celkweek laboratorium in geïmmortaliseerde normale ovariële fibroblast (INVAN) groeimedium, aangevuld met extra antibiotica en antimycotica. INOF groeimedium (GM-INOF) omvat: Medium 199 en MCDB105 gemengd in een 1:1 verhouding, aangevuld met 15% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 50 ug / ml gentamicine en 250 ng / ml amfotericine B.
- Werken in een bioveiligheid kast: Verwijder alle epitheliale cellen die los blijft vastzitten aan het weefsel, door het wassen van het monster met 5 ml PBS. Zuig en herhaal nog twee keer.
- Breng het monster plus PBS in een schone 10 cm diameter (P100) cultuur schotel. Gebruik steriele tang om het weefsel en plaats de hendel in een tweede, droge P100 schoon cultuur schotel. Gebruik steriele scalpel om weefsel 0,5 cm 2 stuks te snijden. Leg elk stuk weefsel in een aparte P100 schotel en verder in stukken gesneden <1 mm 2 groot. Voeg 20 ml INOF-GM (plus antibiotica en antimycotica), en incuberen bij 37 ° C, 5% CO2. Monitor celgroei met behulp van fase microscopie. Cellen kunnen worden gezien los van de schaal wit hin 24 uur.
- Re-feed na een week, het verwijderen van niet-hechtende weefsel door aspiratie. Daarna opnieuw invoeren culturen twee keer per week. Cellen kolonies vormen, meestal binnen 1-3 weken. Zodra deze kolonies groot genoeg om subcultuur (zodra ze ongeveer 500 urn), isoleer het klonen met trypsine beklede schijven klonen.
Bevestigen cellen en fibroblast 100% vrij van andere cellulaire verontreinigingen door het uitplaten van een monster van de cellijn op dekglaasjes en het uitvoeren van immuno-fluorescentiekleuring voor een fibroblast marker (FSP), een epitheliale marker (pan-cytokeratine) en een endotheelcel marker (von Willenbrand Factor VIII). - Passage primaire normale ovariële fibroblast (NOF) cel isolaten een P100 schaal in 3 schalen P100 een dag voor de retrovirale transductie van hTERT. Pre-made virale supernatanten kunnen worden gekocht of zijn geproduceerd in eigen huis met behulp van standaard protocollen voor co-transfectie van HEK293T-cellen (zietarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Retrovirale supernatanten kunnen worden geproduceerd met behulp van de pBABE-hygro-hTERT vector (Addgene). Verwijder NoFS uit de incubator en dan zuigen het celkweekmedium. Voeg 3 ml van virale supernatant bij elk gerecht: een schotel ontvangt hTERT-retrovirus, de 2 e schotel ontvangt GFP-retrovirus en de derde gerecht krijgt geen virus. Overlay virale supernatanten met INOF-GM bevattende polybreen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml. Re-feed cellen de volgende dag met vers medium. Twee dagen na infectie begonnen selectie met lage dosis (10 U / ml) hygromycine B. Na zeven dagen deze dosis verhoogd worden tot 20 U / ml; selectie moet volledig binnen 10-14 dagen. - Klonen die hTERT of GFP kan worden geïsoleerd door ring klonering zodra ze ongeveer 500 urn. Cellijnen extra karakterisering van de succesvolle expressie van hTERT en het behoud van de primaire cellijn functies te bevestigen. Dit in: (a)bevestigen telomerase activiteit door PCR-ELISA en telomeerlengte door Southern blot of PCR 6,7, (b) bevestiging van de expressie van kritische markers (bijv. immunokleuring met een anti-pan-cytokeratine antilichaam aan epitheliale cellen te identificeren en een anti- fibroblast oppervlakte-eiwit antilichaam fibroblasten) is vergelijkbaar tussen primaire en hTERT-geïmmortaliseerde cellen (c) bevestigen de cellen geen eigenschappen van neoplastische transformatie (bijvoorbeeld met verankering onafhankelijke groei assays), (d) bevestiging uitbreiding van in vitro levensduur waargenomen . cellen die hTERT maar niet GFP hTERT-expressie geïmmortaliseerde normale ovariële fibroblasten (INOFs) te omzeilen replicatieve senescentie maar niet neoplastisch getransformeerd, daarnaast de INOF cellen moeten de expressie van fibroblast oppervlakte-eiwit maar niet epitheliale merkers zoals cytokeratine (figuur 2) handhaven .
2. Coating van Tissue Culture Gerechten met PolyHEMA voor niet-klevende Cultuur van de Cel
- Om de polyHEMA oplossing te bereiden, weeg 1,5 g polyHEMA, en plaats in een steriele fles. Voeg 95 ml moleculaire biologie klas absolute ethanol en 5 ml celkweek kwaliteit gedestilleerd water. De polyHEMA hydrogel zal oplossen in het water van de oplossing en de ethanol wordt het preparaat steriliseren.
- Plaats de polyHEMA oplossing in een waterbad van 65 ° C tot het volledig opgelost. Dit kan tot 8 uur. Merk op dat de polyHEMA oplossing kan worden opgeslagen voor lange tijdsperioden en dus altijd vers worden bereid.
PROBLEMEN: Oplossingen van polyHEMA vereisen lange incubatietijden bij 65 ° C. Regelmatig omkeren de polyHEMA oplossing te mengen. Viscositeit waargenomen op de bodem van de glazen fles geeft de polyHEMA nog niet volledig opgelost en verdere incubatie bij 65 ° C vereist. - Werken in een laminaire stroming kap, jas weefselkweekplaten met de polyHEMA oplossing. Elke size van weefselkweekplaat, kolf of multiwell plaat worden bekleed met polyHEMA. Aanbevolen hoeveelheden polyHEMA oplossing voor elke vaartuig worden gegeven in tabel 2.
- Laat celcultuurschalen te drogen in de laminaire stroming kap. Dit kan 2-3 dagen duren. Gentle rocking op een schommelende platform kan worden gebruikt om zelfs coating van groter formaat schotels of flesjes waarborgen. Als de polyHEMA oplossing droogt te snel het oppervlak niet glad zijn. Om dit te vermijden, moet de deksel van het schaaltje / kolf blijft gedurende het droogproces.
- Breng een tweede laag polyHEMA en laten drogen zoals hierboven beschreven.
PROBLEMEN: Gaten in de polyHEMA coating kan in het bijzonder optreden, wanneer platen drogen te snel. Dubbele coating de platen met polyHEMA helpt dekking gaten of scheuren in de coating zijn bedekt voor gebruik. Platen meestal 2-3 dagen voor elke polyHEMA vacht te drogen en dus moeten worden voorbereid ten minste een week voordat ze nodig zullen zijn voor celkweek. - PolyHEMA beklede platen worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot gebruik.
Opmerking 1% agarose oplossingen, opgelost in 1X PBS en geautoclaveerd te steriliseren, kan ook worden gebruikt voor het coaten celcultuurschalen een niet-hechtende ondergrond voor kort 3D kweken (minder dan een week) te maken. Agarose coating van multi-well platen ontstaat een concaaf oppervlak dat de vorming van een bolvormige per gedurende vele cellijnen bevordert. Echter, voor een langere 3D culturen polyHEMA coating wordt aanbevolen als agarose coating vaak desintegreert na langere cultuur periodes.
3. Het genereren van driedimensionale (3D) heterotypische sferoïden en Re-voeding van 3D culturen
- Herstellen en uit te breiden INOF en epitheliale celculturen in vitro om genoeg cellen voor te bereiden voor de oprichting van 3D heterotypische sferoïden. Voor 'massa culturen' we meestal zaad 2-4x10 6 INOFs per P100 schotel en 0,5-1x10 6 epitheelcellen een stromale te geven: epitheliale ratio van 4:1. INOF cellen worden gekweekt in groeimedium INOF (INOF-GM) zonder gentamicine en amfotericine B. Desgewenst fibroblast cellen worden voorbehandeld voor 3D cultuur (bijvoorbeeld voor inductie van senescentie, kunnen cellen worden behandeld met subletale doses van waterstofperoxide ).
- Was een droge polyHEMA plaat met 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten. Zuig het PBS en te vervangen door 15 ml INOF-GM.
- Ondertussen trypsinize geïmmortaliseerde normale ovarium fibroblastcellen te los van de kweekschaal na 3-5 min de trypsine neutraliseren met een gelijk volume kweekmedium en pellet van de cellen door centrifugatie bij 450 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant. Maak een single-celsuspensie door resuspenderen de cel pellet in 5 ml INOF-GM, meng goed door en neer te pipetteren of vortexen zachtjes. Bepaal celconcentratie door 10 pi celsuspensie en 10 ul trypan blauw en opsommen met een hemocytometer. Trypan blauw uitsluiting kan worden gebruiktd om levende cellen te identificeren.
- Voeg 4x10 6 INOF cellen aan het medium reeds afgegeven in de polyHEMA-gecoate plaat. Vul het kweekmedium volume tot 20 ml met een geschikte hoeveelheid vers INOF-GM en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Cellen beginnen te aggregeren in multicellular spheroids binnen 24 uur. Sferoïde vorming kan worden gevolgd door fase microscopie.
Nauwkeurige telling van sferoïde nummers onder de massacultuur omstandigheden is moeilijk, maar we schatten dat we 50 tot 100 sferoïden te verkrijgen wanneer 4x10 6 stromale cellen worden uitgeplaat. Sferoïde maten variëren meestal 80 tot 250 micrometer. - Opnieuw in te voeren bolvormige culturen om de 2-3 dagen met rust de platen onder een hoek op een pipet geplaatst in de laminaire stroming kap. Laat de sferoïden om zich te vestigen. Dit kan tot 20 minuten. Verwijder voorzichtig de uitgeputte media met een 5 ml pipet, totdat er slechts ongeveer 4 ml blijven in de schotel. Zorg ervoor dat u de sferoïden te zuigen. Re-feed met 16 ml verse INOF-GM en terug te keren naar de incubator.
- Op dag 7, voeg epitheelcellen aan fibroblast bolletjes om heterotypische culturen als volgt maken. Suspensies bereid van eierstokepitheliaalcellen (fenotypisch normale of getransformeerde) door behandeling met trypsine zoals beschreven in paragraaf 3.4-3.5. Bepaal celconcentratie met een hemocytometer. Was eenmaal in INOF-GM aan een groeifactoren voorkomen dat overgedragen van de epitheliale groeimedia.
In ons laboratorium normale ovariële oppervlakte-epitheel cel (OSEC) lijnen werden verzameld met geïnformeerde toestemming van de patiënt uit eierstokken verwijderd door totale abdominale hysterectomie of totale laparoscopische hysterectomie met bilaterale salpingo-ovariëctomie. Eierstokken werden geborsteld met een steriele Cytobrush het epitheel verzamelen. Primaire cellijnen vastgesteld en getransduceerd met hTERT volgens de methode beschreven. Details van OSEC cultuur in 2D, 3D en kan OSEC immortalisatie worden gevonden in de referenties 10 en 11. - Om heterotypische sph vormeneroids eerste re-feed culturen van fibroblast sferoïden alleen. Vervolgens enten fibroblast cultures sferoïde met 1x10 6 epitheelcellen in een verhouding van 4:1 fibroblasten aan epitheelcellen. Cultuur de heterotypische sferoïden in INOF-GM.
- Re-FEED heterotypische cultures elke 2-3 dagen nog eens 14 dagen.
4. Verwerking voor beeldvorming en moleculaire analyses
- Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om de heterotypische sferoïden analyseren. Voor beeldvorming, is het raadzaam om sferoïden worden geoogst van de cultuur schotel met een 25 ml pipet. Pipetteren langzaam zal het minimaliseren van de kans van schuifkrachten het verstoren van de architectuur van de bolvormige. Sferoïden kunnen vervolgens worden gewassen in PBS en gepelleteerd door voorzichtig centrifugeren bij 100 g gedurende 10 min; hogere centrifugale krachten beschadiging van de sferoïden. Als alternatief kunnen de culturen overgebracht naar een 50 ml falcon-buis om te bezinken en het groeimedium verwijderd.
- Voor immunohistochemischechemie, vast Steroiden met neutraal gebufferde formaline gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Pellet de sferoïden en vervangen formaline met 70% ethanol. Proces in paraffine behulp van standaardprotocollen voor menselijke weefsels. Paraffine ingebedde coupes kunnen sferoïden, en gekleurd met ofwel hematoxyline en eosine of specifieke moleculaire merkers met standaard immunohistochemie (figuur 3).
- Als alternatief kunnen sferoïden gewassen in PBS worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde (bereid in PBS), ingebed in optimale snijtemperatuur oktober medium en snel bevroren voor bevroren coupes en immunofluorescente kleuring.
- Voor moleculaire analyses, kunnen de sferoïden worden geoogst, gepelleteerd en tweemaal in PBS gewassen voordat lyseren cellen DNA, RNA of eiwit-extractie.
- Voor analyse door doorstroomcytometrie kunnen sferoïden worden gewassen in PBS en gedissocieerd door trypsine of Accutase digestie bij 37 ° C. Om dit te doen, dompel de Falcon buis met sferoïden ina waterbad trypsine vergemakkelijken. Volledige dissociatie van bolvormige deeltjes in een celsuspensie kan worden bevorderd door pipetteren de oplossing op en neer met een 1 ml pipet. Zorg ervoor dat u over-trypsinize de cellen.
Neutraliseer de reactie met een gelijk volume kweekmedium en verwijder celklonten door het passeren van de suspensie door een 40-70 urn celzeef. Pellet-cellen, wassen met PBS, opsommen en resuspendeer het gewenste aantal cellen in FACS-buffer. Vlek cellen volgens instructies van de fabrikant.
5. Representatieve resultaten
Deze benadering kan worden gebruikt voor een breed scala van toepassingen, en voor de studie van normale ovariële biologie en de studie van eierstokkanker opening. Een groot voordeel van deze benadering over 3D kweken gemaakt met in de handel verkrijgbare extracellulaire matrix gel is dat de normale fibroblasten ovariële de extracellulaire matrix die maakt u producerenp de kern van de bolvormige deeltjes. In onze ervaring, het matrixmateriaal geproduceerd door normale fibroblasten ovarian heterogeen en lijkt op de extracellulaire matrix van de eierstok dan handel verkrijgbare matrix gel. In ons laboratorium hebben we gebruik gemaakt epitheliale cellen die gedeeltelijk zijn omgezet in vitro met behulp van gedefinieerde genetische elementen (bijv. CMYC overexpressie) en co-gekweekte deze cellen met een normale en verouderde eierstokken fibroblasten om beginnende eierstokkanker na te bootsen in een post-menopauzale eierstok. Onze gegevens suggereren dat het verouderingsproces micro neoplastische functies (bijv. proliferatie) van gedeeltelijk getransformeerde epitheliale cellen (Figuur 3) bevordert, terwijl een normale micro remt neoplastische progressie 8. Ons laboratorium en anderen hebben ook vergelijkbare benaderingen normale eierstokepitheliaalcellen 9, eileider epitheelcellen, stapsgewijze modellen van neoplastische progressie modelleren
Figuur 1. Schematisch overzicht van het protocol voor 3D heterotypische kweken. Weefselkweekflessen tweemaal bekleed met een 1% oplossing polyHEMA en gedroogd. PolyHEMA gecoate kunststoffen gewassen met 1x PBS onmiddellijk vóór gebruik. Geïmmortaliseerde normale ovarium fibroblast cellen (4x10 6 cellen) worden uitgeplaat in de kolf met 20 ml groeimedium. Sferoïde vorming en groei gevolgd gedurende 7 dagen. Op dit punt worden fibroblast cultures bolvormige geïnoculeerd met 1x10 6 epitheelcellen, en de twee celtypen samen gekweekt gedurende 14 dagen voor de multicellulaire bolvormige deeltjes worden geoogst en verwerkt voor downstream toepassingen (moleculaire analyses, imaging, etc).
Figuur 2. Immunofluorescentiekleuring van hTERT </ Em> vereeuwigd normale ovariële fibroblasten. Zowel primaire normale ovariële fibroblasten (Pr NoFS) en vereeuwigd normale ovariële fibroblasten (INOFs) uitdrukkelijke fibroblast specifiek eiwit (FSP), spreken zich niet uit cytokeratine-7 (Ck-7) en een automatische vimentine (VIM) . Markers van belang zijn in het groen, DNA wordt gekleurd met DAPI en weergegeven in blauw, wordt cytoplasma tegengekleurd met Evan's blauw en in rood weergegeven.
Figuur 3. Immunohistochemie van co-gekweekte stromale en epitheelcellen. Linkergrafiek, normale ovariële fibroblast sferoïde monocultuur, gekleurd met hematoxyline en eosine. Normale ovarium fibroblast cellen alleen gekweekt in 3D vorm bestaande uit bolvormige cellen met een spindled-morfologie en overvloedige extracellulaire matrix. Rechter paneel: normale ovariële fibroblasten werden blootgesteld aan waterstofperoxide aan senescentie induceren. Gedeeltelijk getransformeerd ovariële epitheliale cellen (IOSE
Figuur 4. Histologische kenmerken van 3D gekweekte cellen tijdens primaire weefsels. (A) Clear cell ovariumcarcinomen beeldkarakteristiek duidelijk celstructuren, die afwezig zijn bij clear cell EOC lijnen gekweekt op plastic maar soortgelijke structuren worden gedetecteerd wanneer dezelfde cellen worden gekweekt zoals 3D sferoïden ( B). (C) Scanning elektron micrograaf van normale eierstokepitheliaalcellen gekweekt zoals Steroiden gedurende 14 dagen. Oppervlakte microvilli zijn zichtbaar (pijlen). (D) sereuze eierstokkanker cellijn Steroiden, in cultuur. (A, B) hematoxyline en eosine kleuring van secties paraffine ingebed tumorweefsel of 3D Steroiden, (C) scanning elektronenmicroscopie; (D) fasecontrastmicroscopie. Sferoïden kunnen bolvormig (gestreepte cirkel)of onregelmatige vorm, zoals bij de constructie gezien in de linkerkant van het beeld.
| Schotel / Plaat Grootte | Volume PolyHEMA (tweemaal worden toegepast) | Cultuur Media Final Volume |
| 6-well plaat | 3 ml | 5-7 ml |
| 12-well plaat | 1,5 ml | 2 ml |
| 24-well plaat | 500 pi | 1,5 ml |
| 48-well plaat | 250 pl | 500 pi |
| 96-well plaat | 50 pi | 200 pi |
| P100 cultuur schotel | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 cultuur schotel | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25 fles | 2-3 ml | 7 ml |
| F75 fles | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175 fles | 15 ml | 30-50 ml |
Tabel 2. Aanbevolen volumes polyHEMA coating en 3D kweken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De biologie van een vroeg stadium ovariumcarcinoom (EOC) is slecht begrepen. Misschien is een van de voornaamste problemen op dit gebied vele jaren is het gebrek aan inzicht in de weefselspecifieke oorsprong van de ziekte, en het belang van de rol van de micro EOC in ontwikkeling. In de afgelopen jaren is wordt duidelijk geworden dat EOC is een heterogene ziekte met meerdere verschillende histophathological subtypes, waarschijnlijk met verschillende cellulaire oorsprong voor verschillende subtypes. Bijvoorbeeld, de huidige gegevens blijkt dat hoogwaardige sereuze EOCs kunnen afkomstig zijn van zowel eileider uitscheidende epitheelcellen en eierstokkanker oppervlak epitheelcellen, ten minste een deel van endometrioid en clear cell EOCs wordt gedacht afkomstig te zijn uit eierstok endometriose (endometrioma) en mucineuze EOCs kunnen voortvloeien uit paraovarian of paratubal overgangsperiode type epitheel 15,16. Toch zijn er slechts beperkte in vitro en <em> in vivo modellen van ziekteprogressie bij een van deze histotypes. In vitro heterotypische modellering van EOC de tumor stroma-epitheliale interacties en het micromilieu verband met de ontwikkeling ovariumcarcinomen studie is een nog minder ontwikkeld gebied van onderzoek. De tumor stroma waarschijnlijk zowel een bron van tumor biomarkers en een nieuw doelwit voor therapie. De ontwikkeling en toepassing van heterotypische modellen van EOC kan daarom om het identificeren van nieuwe biomarkers geassocieerd met vroege stadium van de ziekte die kunnen worden gebruikt als onderdeel van een programma van screening en vroege ziektedetectie, of voor de identificatie van nieuwe, aan druggable therapeutische targets te verbeteren behandelingen voor patiënten met EOC.
Nog belangrijker is dat de modellen die we hebben beschreven worden gebruikt om een dieper begrip van de onderliggende fenotypische en moleculaire veranderingen die optreden tijdens de EOC initiatie en de vroege ontwikkeling van de ziekte te krijgen. Het is nu duidelijk dat verschillende EOC subtypes verschillende moleculaire profielen, klinische kenmerken en de onderliggende biologie. Door het genereren van een bibliotheek van EOC precursor cellen en modelleren van de ontwikkeling van elk subtype kanker, waaronder microenvironmental invloeden, is het mogelijk om nieuwe inzichten in de ontwikkeling van EOC histotypes door modellen die nauwkeurig ziekte ontwikkeling in de menselijke conditie. De methoden beschrijven we kunnen worden toegepast op een groot aantal studies en toepassingen, waaronder de studie van andere solide tumoren. We hebben getest sferoïde vorming vermogen in meer dan vijftig verschillende normale en getransformeerde cellijnen ovarium date en waargenomen dat de meeste cellijnen kunnen bolletjes vormen wanneer uitgeplaat bij hoge celdichtheden op polyHEMA beklede platen. Wij verwachten dat celkweekmodellen van andere zoogdieren organen en ook andere soorten kunnen ook worden gekweekt in 3D met deze benadering.
ve_content "> Deze benaderingen een voorschot specifiek vormen voor onderzoek naar de rol van de micro tijdens tumorinitiatie bijvoorbeeld in studies van de wisselwerkingen van discrete somatische afwijkingen in tumor epitheelcellen bestaande gelijktijdig met specifieke microenvironmental variabelen. We hebben aangetoond dat fenotypische veranderingen in stromale cellen kunnen epitheelcel fenotype beïnvloeden 8. Door verandering van de celtypen in het model, kan men onderzoeken of verschillende stromacellen differentieel epitheelcelproliferatie beïnvloeden en ook de expressie van andere specifieke markers zoals markers verbonden met invasie of metastase. Bovendien zijn deze modellen kunnen ook worden gebruikt in de studie van goedaardige ziekte en normale ovarium fysiologie. bijvoorbeeld zoals 3D-modellen kunnen worden gebruikt in fertiliteitsonderzoek de rol van de ovariële stroma evalueren tijdens eicelrijping.Voor het bestuderen van de bijdrage van de microenvironment om EOC ontwikkeling en de rol van eierstokkanker geassocieerde fibroblasten in maligne EOCs Deze modellen kunnen worden aangepast door co-kweken eierstokkankercellen met fibroblasten geïsoleerd van tumor specimens. Complexere culturen kunnen ook worden gegenereerd door extra, relevante celtypen in de heterotypische structuur. Zo kan het model van stroma en epitheelcel interacties we ontwikkeld aangevuld met de introductie van granulosacellen immune of endotheelcellen. Een andere mogelijkheid is co-cultuur andere precursor cellen in het ovariële stroma model, zoals epitheelcellen van de eileider en endometrium. Het is ook mogelijk modelleren aanvullende paracriene interacties die worden voorgesteld belangrijk tijdens EOC initiatie. Kan bijvoorbeeld steroïdhormonen worden ingebracht in de heterotypische model, of expressie van genen die paracriene kan uitsluitend worden verstoord in het stromale compartiment enHet effect op epitheelcellen gemeten.
De meeste eierstokkanker worden geïdentificeerd in een laat stadium, nadat de ziekte is ruim verspreid in de peritoneum. Eierstokkanker gediagnosticeerd als gelokaliseerd in de eierstokken (fase 1) kunnen effectief worden behandeld met chirurgie en in meer dan 90% van de gevallen de patiënten zijn genezen van hun ziekte. Het is duidelijk dat strategieën voor eerdere detectie van eierstokkanker aanzienlijk kunnen verminderen, eierstokkanker morbiditeit en mortaliteit. Door het verkrijgen van een dieper inzicht in een vroeg stadium de ziekte-ontwikkeling met behulp organotypische modelmatige benaderingen, zoals die hier beschreven, wordt verwacht dat nieuwe kansen voor de ziekte van detectie in at-risk populaties zal worden onthuld en uiteindelijk vertaald naar de klinische praktijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd uitgevoerd bij de Keck School of Medicine, University of California, VS, en het University College London, Verenigd Koninkrijk. KL wordt gefinancierd door het National Institute of Health subsidie 5 U19 CA148112-02. BG werd gefinancierd door een projectsubsidie van de Eve beroep gynaecologische oncologie liefdadigheid (UK). Een deel van deze werkzaamheden die op UCLH / UCL werd gedeeltelijk gefinancierd uit het ministerie van Volksgezondheid de NIHR Biomedical Research Centre subsidieregeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
|||
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
