Summary
Wir beschreiben Methoden zur Gründung
Abstract
Epithelialen Eierstockkrebs (EOC) sind die häufigste Todesursache bei gynäkologischen Malignomen in westlichen Gesellschaften. Trotz der Fortschritte in der chirurgischen Behandlungen und verbesserten Platin-basierten Chemotherapie, hat es wenig Verbesserung EOC Überlebensraten für mehr als vier Jahrzehnten 1,2. Während im Stadium I Tumoren haben 5-Jahres-Überlebensraten> 85%, sind die Überlebensraten für Stufe III / IV der Krankheit <40%. So konnten die hohen Sterblichkeitsraten für EOC deutlich verringert werden, wenn die Tumore bei früheren, mehr behandelbar, Stufen 3-5 nachgewiesen wurden. Derzeit wird die molekulare genetische und biologische Grundlage der frühen Stadium der Erkrankung die Entwicklung nur unzureichend verstanden. Genauer gesagt, ist nur wenig über die Rolle der Mikroumgebung während Tumorinitiation bekannt, aber bekannten Risikofaktoren für EOC (zB Alter und Parität) legen nahe, dass die Mikroumgebung eine zentrale Rolle spielt in der frühen Entstehung der EOC. Wir entwickelten deshalb dreidimensionale heterotypische Modellesowohl der normalen Ovar und frühzeitig Eierstockkrebs. Für den normalen Ovar, wir co-kultivierten normalen Ovarien Oberflächenepithelzellen (IOSE) und normalen Stromazellen Fibroblasten (Inof) Zellen durch Transduktion retrovrial der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase Holoenzym (hTERT), um die Lebensdauer dieser Zellen in Kultur immortalisierten erstrecken. Um die frühesten Stadien der Ovarialepithelzellen Zelltransformation Überexpression des CMYC Onkogen in IOSE Zellen, wieder mit Inof Zellen co-kultiviert modellieren. Diese heterotypische Modelle wurden verwendet, um die Auswirkungen des Alterns und der Seneszenz der Transformation und Invasion von Epithelzellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die methodischen Schritte Entwicklung dieser dreidimensionalen Modells; diese Methoden sind nicht spezifisch für die Entwicklung einer normalen Ovar und Eierstockkrebs Geweben und könnte verwendet werden, um andere Gewebearten zu untersuchen, wo stromalen und epithelialen Zell-Wechselwirkungen sind ein grundlegendes Aspekt des Gewebes Wartung und diSease Entwicklung.
Protocol
Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den Arbeitsablauf beschrieben.
Ein. Isolation von Normal Ovarian Fibroblasten und Erweiterung der in-vitro-Lebensdauer durch Überexpression der katalytischen Untereinheit der hTERT Holoenzym
- Ovargeweben mit informierter Patient Zustimmung und Genehmigung des Institutional Review Board (für US-Einrichtungen) gesammelt werden. Normale Eierstock-Gewebe kann nach totale abdominale Hysterektomie oder totale laparoskopische Hysterektomie mit bilateraler Salpingoophorektomie gesammelt werden. In dieser Studie wurden die Gewebe von einem Pathologen und einem Abschnitt der Ovar-Stroma zur Zellkultur biopsiert untersucht. Gewebeproben von etwa 2-5 mm 2 wurden aus dem zentralen Bereich des Eierstocks geerntet um zu versuchen, die Wahrscheinlichkeit auch Abtasten Ovar-Epithel reduzieren.
- Transport frischer Eierstockgewebe der Zellkultur-Labor in immortalisierten normalen ovariellen Fibroblasten (INOF) Wachstumsmedium, mit extra Antibiotika und Antimykotika ergänzt. Inof Wachstumsmedium (Inof-GM) umfaßt: Mittel 199 und MCDB105 gemischt im Verhältnis 1:1, ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 50 pg / ml Gentamycin und 250 ng / ml Amphotericin B.
- Arbeiten im Inneren einer biologischen Sicherheitswerkbank: Entfernen Sie alle Epithelzellen, die lose auf dem Gewebe haften bleiben, durch Waschen der Probe mit 5 ml PBS. Absaugen und wiederholen Sie noch zweimal.
- Übertragen Sie die Probe plus PBS in ein sauberes 10 cm Durchmesser (P100) Kulturschale. Verwenden einer sterilen Pinzette, um das Gewebe und in einen zweiten, trockenen P100 saubere Kulturschale zu behandeln. Verwenden sterilen Skalpell, um Gewebe 0,5 cm 2 Stücke schneiden. Legen Sie jedes Stück Gewebe in einem separaten P100 Schüssel und weitere in Stücke schneiden <1 mm 2 groß. 20 ml Inof-GM (plus Antibiotika und Antimykotika), und bei 37 ° C, 5% CO 2. Überwachen Zellwachstum mit Phasenmikroskopie. Cells zu sehen in der Schale anhaftende wit werden hin 24 Stunden.
- Re-feed nach einer Woche, um jegliche nicht-adhärente Gewebe durch Aspiration. Danach refeed Kulturen zweimal pro Woche. Zellen bilden Kolonien, in der Regel innerhalb von 1-3 Wochen. Sobald diese Kolonien groß genug, um Subkultur (sobald sie erreicht rund 500 um) sind, isolieren die Klone mit Trypsin-beschichtete Klonen Festplatten.
Bestätigen Zellen sind Fibroblasten und 100% frei von anderen zellulären Verunreinigungen durch Plattieren einer Probe der Zelllinie auf Deckgläser und Durchführen Immuno-Fluoreszenz-Färbung für einen Fibroblasten-Marker (FSP), einer epithelialen Marker (pan-Cytokeratin) und einen endothelialen Zell-Marker (von Willenbrand Factor VIII). - Passage primären normalen Eierstock-Fibroblasten (NOF) Zelle isoliert von einem einzigen P100 Gericht in 3 P100 Gerichte einen Tag vor der retroviralen Transduktion von hTERT. Pre-made viralen Überstände können gekauft werden, oder produziert im eigenen Haus über Standardprotokolle für Cotransfizieren HEK293T Zellen (siehetarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Retrovirale Überstände können unter Verwendung der pBABE-Hygro-hTERT Vektor (Addgene) werden. Entfernen NoFS aus dem Brutschrank und dann absaugen Zellkulturmedium. 3 ml der viralen Überstand zu jedem Gericht: ein Teller bekommt hTERT-Retrovirus, erhält der 2 nd Gericht GFP-Retrovirus und die dritte Schale erhält keine Viren. Überlagern viralen Überstände mit Inof-GM enthaltend Polybren, um eine Endkonzentration von 8 ug / ml zu erhalten. Re-feed-Zellen am folgenden Tag mit frischem Medium. Zwei Tage nach der Infektion beginnt die Auswahl mit niedriger Dosis (10 U / ml) Hygromycin B. Nach sieben Tagen diese Dosis bis 20 U / ml erhöht werden kann; Auswahl sollte innerhalb von 10-14 Tagen abgeschlossen. - Klone hTERT oder GFP kann durch den Ring Klonen isoliert werden, sobald sie erreichen rund 500 um. Zelllinien zusätzliche Charakterisierung der erfolgreiche Expression von hTERT und Aufbewahrung von primären Zelllinie Funktionen bestätigen. Dies beinhaltet: (a)Bestätigen Telomeraseaktivität durch PCR-ELISA und Telomerlänge, durch Southern Blot oder PCR 6,7, (b) Bestätigen der Expression Anflugbaken (zB Immunfärbung mit einem Anti-Pan-Cytokeratin Antikörpers an Epithelzellen zu identifizieren, und mit einem anti- Fibroblasten-Oberflächenprotein-Antikörper für Fibroblasten) ähneln zwischen primären und hTERT-immortalisierten Zellen, (c) Bestätigen der Zellen zeigen keine Eigenschaften neoplastischen Transformation (zB mittels Verankerung unabhängiges Wachstum Assays), (d) Bestätigen Verlängerung der in vitro Lebensdauer beobachtet in . exprimieren hTERT aber nicht GFP-exprimierenden hTERT immortalisierte normalen Ovarien Fibroblasten (INOFs) sollte Bypass replikative Seneszenz aber nicht neoplastisch transformierten werden, zusätzlich die Inof Zellen sollten die Expression von Fibroblasten-Oberflächenprotein jedoch nicht epithelialen Marker wie Cytokeratin (Abbildung 2) zu halten .
2. Beschichtung von Tissue Culture Gerichte mit polyHEMA für Nicht-adhärente Zellkultur
- Um die polyHEMA Lösung herzustellen, wiegen 1,5 g polyHEMA und Ort in eine sterile Flasche. Fügen Sie 95 ml Molekularbiologie absolutem Ethanol und 5 ml Zellkultur destilliertem Wasser. Die polyHEMA Hydrogel wird in der Wassergehalt der Lösung zu lösen, und das Ethanol wird die Herstellung sterilisieren.
- Legen Sie die polyHEMA Lösung in einem Wasserbad bei 65 ° C bis vollständig gelöst. Dies kann bis zu 8 Stunden. Beachten Sie, dass die polyHEMA Lösung nicht für längere Zeit gelagert werden und sollte immer frisch zubereitet werden.
FEHLERSUCHE: Lösungen von polyHEMA erfordern lange Inkubationszeiten bei 65 ° C. Regelmäßig invertieren polyHEMA Lösung zu mischen. Viskosität am Boden der Glasflasche beobachtet zeigt die polyHEMA nicht vollständig gelöst und weitere Inkubation bei 65 ° C erforderlich. - Arbeiten im Inneren einer Laminarströmungshaube, Mantel Zellkulturschalen mit dem polyHEMA Lösung. Jede size Gewebekulturschale, Kolben oder Multiwellplatte mit polyHEMA beschichtet werden. Empfohlen Volumina polyHEMA Lösung für jedes Schiff erforderlich sind in Tabelle 2 angegeben.
- Lassen Zellkulturschalen innerhalb des Laminarströmungshaube trocknen. Dies kann 2-3 Tage dauern. Sanfte Schaukeln auf einem schaukelnden Plattform kann verwendet werden, um eine gleichmäßige Beschichtung der größer dimensionierte Gerichte oder Flaschen zu gewährleisten. Wenn die polyHEMA Lösung trocknet zu schnell kann die Oberfläche nicht glatt sein. Um dies zu vermeiden, stellen Sie sicher den Deckel der Schale / Kolben bleibt während der Trocknung.
- Tragen Sie eine zweite Schicht polyHEMA und trocknen lassen, wie oben beschrieben.
FEHLERSUCHE: Löcher in der polyHEMA Beschichtung kann besonders dann auftreten, wenn die Platten zu schnell trocknen. Doppel-Beschichtung wurden die Platten mit polyHEMA hilft, Lücken oder Risse in der Beschichtung abzudecken werden vor Gebrauch abgedeckt. Platten der Regel 2-3 Tage für jeden polyHEMA Fell zu trocknen und so sollten darauf vorbereitet sein, mindestens eine Woche, bevor sie für die Zellkultur benötigt werden. - PolyHEMA beschichteten Platten kann bei Raumtemperatur bis zur Verwendung gelagert werden.
Hinweis: 1% Agarose Lösungen in 1X PBS gelöst und autoklaviert zu sterilisieren, kann auch zur Beschichtung Zellkulturschalen verwendet werden, um eine nicht-haftende Oberfläche für die kurzfristige 3D Kultivieren (weniger als eine Woche) zu erstellen. Agarose Beschichtung der Multi-Well-Platten erstellt eine konkave Oberfläche, die die Bildung eines einzigen Sphäroids pro Vertiefung für viele Zelllinien fördert. Doch für mehr 3D-Kulturen polyHEMA Beschichtung wie Agarose Beschichtung oft zerfällt nach mehr Kultur Perioden empfohlen.
3. Erzeugen Dreidimensionale (3D) heterotypische Sphäroide und Re-Fütterung von 3D Kulturen
- Erholen und Erweitern Inof und epithelialen Zellkulturen in vitro, um genügend Zellen zum Aufbauen 3D heterotypische Sphäroide vorzubereiten. Für "Masse Kulturen" wir in der Regel Samen 2-4x10 6 INOFs pro P100 Gericht und 0,5-1x10 6 Epithelzellen eine stromale geben: epithelial ratio von 4:1. Inof Zellen in Inof Wachstumsmedium (Inof-GM) ohne Gentamicin oder Amphotericin B. Gewünschtenfalls Fibroblastenzellen kann vor 3D-Kultur vorbehandelt werden (zB zur Induktion der Seneszenz angebaut werden, können Zellen mit subletalen Dosen von Wasserstoffperoxid behandelt werden ).
- Waschen eines trockenen polyHEMA Platte mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 5 min. Saugen Sie die PBS und ersetzen mit 15 ml Inof-GM.
- Unterdessen normalen Ovarien immortalisierte Fibroblastenzellen trypsinieren, um sie von der Kulturschale abzunehmen, nach 3-5 min neutralisieren Trypsin mit einem gleichen Volumen von Nährmedien und Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g für 5 min.
- Überstand verwerfen. Erstellen Sie eine Einzelzell-Suspension durch Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml Inof-GM zugeben, durch Auf-und Abpipettieren oder Vortexen sanft. Bestimmen Zellkonzentration durch Vermischen von 10 ul Zellsuspension und 10 ul Trypanblau und Aufzählen unter Verwendung eines Hämozytometers. Trypanblau-Ausschluss können verwendend, um lebende Zellen zu identifizieren.
- Fügen 4x10 6 Inof Zellen in das Medium bereits in der polyHEMA-beschichtete Platte verzichtet. Make-up die Kulturmedien Volumen auf 20 ml mit einem geeigneten Volumen an frischem Inof-GM und bei 37 ° C, 5% CO 2. Zellen beginnen zu aggregieren in mehrzelligen Sphäroiden innerhalb von 24 Stunden. Sphäroid-Bildung kann durch Phasenmikroskopie überwacht werden.
Genaue Zählung der Sphäroid Zahlen unter Massenkultur Bedingungen ist schwierig, aber wir schätzen, dass wir 50-100 Sphäroiden erhalten, wenn 4x10 6 Stromazellen beschichtet sind. Spheroid Größen liegen typischerweise im Bereich von 80 bis 250 um. - Neu einspeisen Sphäroid Kulturen alle 2-3 Tage ruhen die Platten in einem Winkel auf einer Pipette in der Laminarströmungshaube platziert. Lassen Sie die Sphäroide zu begleichen. Dies kann bis zu 20 min. Entfernen Sie vorsichtig die erschöpfte Medien mit einer 5 ml-Pipette, bis nur noch ca. 4 ml in der Schale bleiben. Achten Sie darauf, die Sphäroide anzusaugen. Re-Feed mit 16 ml frisches INOF-GM und in den Inkubator zurück.
- Am Tag 7, fügen Epithelzellen an Fibroblasten Sphäroide zu heterotypische Kulturen wie folgt erstellen. Suspensionen von Eierstock-Epithelzellen (phänotypisch normalen oder transformierten) durch Trypsinisierung wie in Abschnitt 3,4-3,5 beschrieben. Bestimmen Zellkonzentration unter Verwendung eines Hämozytometers. Waschen Sie einmal in Inof-GM, alle Wachstumsfaktoren aus, die infolge des epithelialen Wachstumsfaktor Medien zu verhindern.
In unserem Labor normalen ovariellen Oberfläche Epithelzellen (OSEC) Linien wurden mit informierter Patient Zustimmung Eierstöcke durch totale abdominale Hysterektomie oder totale laparoskopische Hysterektomie mit bilateraler Salpingoophorektomie entfernt gesammelt. Eierstöcke wurden mit einem sterilen Zytobürste das Epithel sammeln gebürstet. Primären Zelllinien wurden etabliert und transduziert mit hTERT mit dem oben beschriebenen Ansatz. Details OSEC Kultur in 2D, kann 3D und OSEC Immortalisierung in den Referenzen 10 und 11 zu finden. - Um heterotypische sph bildeneroids, erste re-feed Kulturen von Fibroblasten Sphäroide allein. Dann inokulieren Fibroblasten Sphäroids Kulturen mit 1x10 6 Epithelzellen in einem Verhältnis von 4:1 Fibroblasten, Epithelzellen. Kultur die heterotypische Sphäroide in Inof-GM.
- Re füttern heterotypische Kulturen alle 2-3 Tage für weitere 14 Tage.
4. Verarbeitung für Imaging und Molekulare Analysen
- Viele verschiedene Verfahren können verwendet werden, um die Sphäroide heterotypische analysieren. Zum Abbilden, empfiehlt es sich, Sphäroiden von der Kulturschale mit einer 25 ml Pipette geerntet. Pipettiervorrichtung langsam minimiert Chancen Scherkräfte Störung der Architektur des Sphäroid. Sphäroide können dann in PBS und pelletiert durch sanftes Zentrifugieren bei 100 xg für 10 min gewaschen werden, höhere Fliehkräfte kann die Sphäroide beschädigen. Alternativ können Kulturen in ein 50 ml Falcon-Röhrchen übertragen und absetzen gelassen, und das Wachstumsmedium dann entfernt.
- Für immunhistochemischeChemie, fixieren Sphäroide mit neutral gepuffertem Formalin für 30 min bei Raumtemperatur. Pellet die Sphäroide und ersetzen Sie das Formalin mit 70% Ethanol. Prozess in Paraffin über Standardprotokolle für menschliche Gewebe verwendet. Paraffin eingebetteten Sphäroide können geschnitten und gefärbt mit entweder Hämatoxylin und Eosin oder spezifische molekulare Marker mit Standard-Immunhistochemie (Abbildung 3).
- Alternativ können Sphäroide in PBS gewaschen, in 4% Paraformaldehyd fixiert werden (hergestellt in PBS), eingebettet in eine optimale Schnittleistung Temperatur Oktober mittel-und Snap für gefrorene Schnitte und Immunfluoreszenzfärbung eingefroren.
- Für molekulare Analysen können die Sphäroide geerntet werden pelletiert und zweimal in PBS, bevor Lysieren von Zellen für DNA, RNA oder Protein-Extraktion gewaschen.
- Zur Analyse durch Durchflusszytometrie kann Sphäroide in PBS und dissoziierte durch Trypsin oder Accutase Verdau bei 37 ° C gewaschen werden Dazu tauchen die Falcon Röhrchen mit Sphäroide ina Wasserbad zu erleichtern Trypsinierung. Vollständige Dissoziation von Sphäroiden in eine Einzelzellsuspension durch Pipettieren der Lösung nach oben und unten mit einer 1 ml Pipette gefördert werden. Achten Sie darauf, nicht zu stark trypsinieren die Zellen.
Neutralisierung der Reaktion mit einem gleichen Volumen Kulturmedium und Zellklumpen zu entfernen, indem die Suspension durch eine 40 bis 70 um Zellsieb. Pellet Zellen mit PBS gewaschen, aufzuzählen und resuspendieren die gewünschte Anzahl von Zellen in FACS-Puffer. Fleck Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Repräsentative Ergebnisse
Dieser Ansatz kann für ein breites Spektrum von Anwendungen eingesetzt werden, und für die Untersuchung der normalen Ovarien Biologie sowie die Untersuchung von Eierstockkrebs Initiation. Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber 3D Kulturen erstellt unter Verwendung kommerziell erhältlicher extrazellulären Matrix-Gel ist, dass die normalen Ovarien Fibroblasten die extrazelluläre Matrix, die u macht produzierenp den Kern der Sphäroide. Nach unserer Erfahrung ist das Matrixmaterial durch normale ovariellen Fibroblasten heterogen und ähnelt mehr der extrazellulären Matrix des Eierstocks als jedes handelsübliche Matrixgel. In unserem Labor haben wir Epithelzellen, die teilweise in vitro transformiert mit definierten genetischen Elemente (zB CMYC Überexpression) und co-kultivierten diese Zellen mit normaler und seneszenten Eierstock-Fibroblasten auf Early-Stage-Eierstockkrebs in einer postmenopausalen Ovar imitieren genutzt. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Alterung Mikroumgebung neoplastische Eigenschaften (zB Proliferation) von teilweise transformierten Epithelzellen (Abbildung 3) fördert, während ein normaler Mikroumgebung hemmt neoplastischen Progression 8. Unser Labor und andere haben ähnliche Ansätze zur normalen Ovarialepithelzellen 9, Eileiter Epithelzellen, stufenweise Modelle neoplastischen Progression modellieren
Abbildung 1. Schematischen Überblick des Protokolls für 3D heterotypische Kultivieren. Zellkulturflaschen werden zweimal mit einer 1% polyHEMA Lösung beschichtet und trocknen gelassen. PolyHEMA beschichtete Kunststoffe mit 1x PBS unmittelbar vor der Anwendung gewaschen. Immortalisierte Fibroblastenzellen normalen Ovarien (4x10 6 Zellen) werden in den Kolben mit 20 ml Wachstumsmedium ausplattiert. Spheroid Bildung und das Wachstum über 7 Tage überwacht. An diesem Punkt sind Fibroblasten-Kulturen Sphäroids mit 1x10 6 Epithelzellen beimpft, und die zwei Zelltypen für 14 Tage co-kultiviert, bevor die mehrzellige Sphäroide geerntet und für Downstream-Anwendungen (molekulare Analysen, Imaging usw.) verarbeitet.
Abbildung 2. Immunfluoreszenzfärbung von hTERT </ Em> normalen ovariellen Fibroblasten verewigt. Beide primären normalen Eierstock-Fibroblasten (Pr NoFS) und verewigt normalen ovariellen Fibroblasten (INOFs) express Fibroblasten spezifisches Protein (FSP), nicht ausdrücken Cytokeratin-7 (Ck-7) und Express Vimentin (VIM) . Marker von Interesse sind grün dargestellt, DNA mit DAPI angefärbt und in blau dargestellt wird Zytoplasma mit Evans-Blau und rot dargestellt gegengefärbt.
Abbildung 3. Immunhistochemie der co-kultivierten Stromazellen und Epithelzellen. Left Panel normalen ovariellen Fibroblasten Sphäroid Monokultur, durch Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Normalen Ovarien Fibroblastenzellen allein in 3D-Form Sphäroiden, bestehend aus Zellen mit einer Einspindeldrehmaschinen-Morphologie und reichlich extrazellulären Matrix kultiviert. Rechts: normalen ovariellen Fibroblasten wurden zu Wasserstoffperoxid ausgesetzt Seneszenz induzieren. Teilumgewandelter Ovarialepithelzellen (IOSE
Abbildung 4. Histologischen Merkmale der 3D kultivierten Zellen reflektieren primären Gewebe. (A) klarzelligen Ovarialkarzinomen charakteristischen klare Zellstrukturen anzuzeigen, diese fehlen, wenn klarzelligen EOC Linien auf Kunststoff, aber ähnliche Strukturen angebaut werden erkannt, wenn die gleichen Zellen als 3D-Sphäroide angebaut werden ( B). (C) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des normalen Ovarialepithelzellen als Kugeln für 14 Tage gewachsen. Oberfläche Mikrovilli sichtbar sind (Pfeile). (D) Serous Eierstockkrebs Zelllinie Sphäroide, in der Kultur. (A, B) Hämatoxylin und Eosin-Färbung der geschnittenen Paraffin eingebettet Tumorgewebe oder 3D Sphäroiden, (C) Rasterelektronenmikroskopie, (D) Phasenkontrastmikroskopie. Sphäroide können kugelförmig (gestrichelter Kreis)oder unregelmäßig in der Form, wie in dem Fall der Struktur in der linken Seite des Bildes gesehen.
| Dish / Plate Größe | Volumen polyHEMA (zweimal angewendet werden) | Kultur, Medien Endgültiges Volumen |
| 6-Well-Platte | 3 ml | 5-7 ml |
| 12-Well-Platte | 1,5 ml | 2 ml |
| 24-Well-Platte | 500 ul | 1,5 ml |
| 48-Well-Platte | 250 ul | 500 ul |
| 96-Well-Platte | 50 ul | 200 ul |
| P100 Kulturschale | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 Kulturschale | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25 Kolben | 2-3 ml | 7 ml |
| F75 Kolben | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175 Kolben | 15 ml | 30-50 ml |
Tabelle 2. Empfohlene Mengen für polyHEMA Beschichtung und 3D-Kultivierung.
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Discussion
Die Biologie der Early-Stage-epithelialen Ovarialkarzinom (EOC) ist wenig bekannt. Vielleicht eines der Haupthindernisse in diesem Bereich seit vielen Jahren war der Mangel an Verständnis für die Gewebe-spezifische Ursachen der Krankheit und die Bedeutung der Rolle der Mikroumgebung in EOC Entwicklung. In den letzten Jahren hat sich herausgestellt, dass sich EOC eine heterogene Erkrankung mit mehreren unterschiedlichen Subtypen histopathologischen, wahrscheinlich mit verschiedenen zellulären Ursprung für verschiedene Subtypen ist. Zum Beispiel schlagen die aktuellen Daten, die hochgradige serösen EOC kann von beiden Eileiter sekretorischen Epithelzellen und Ovarialoberfläche epithelialen Zellen stammen, mindestens ein Anteil der endometrioid und klarzelligen EOC sind vermutlich aus Eierstock-Endometriose (Endometriomen) entstehen, und muzinösen EOC können von paraovarian oder Paratubal Übergangs-Typ Epithel 15,16 entstehen. Allerdings gab es bisher nur in vitro und <begrenztem> in vivo Modellen der Krankheitsprogression für jede dieser histotypes. In vitro heterotypische Modellierung von EOC, um die Tumor-Stroma-Epithel-Interaktionen und die Mikroumgebung mit Entwicklungsländern Ovarialkarzinome assoziiert zu studieren ist eine noch wenig entwickelte Gebiete der Forschung. Die Tumorstroma wahrscheinlich sowohl eine Quelle von Tumor Biomarker sowie ein neues Target für Therapie sein. Die Entwicklung und Anwendung von heterotypische Modelle EOC kann daher Schlüssel zur Identifizierung neuartiger Biomarker mit frühen Stadium der Erkrankung, die als Teil eines Programms zum Screening und Früherkennung von Krankheiten verwendet werden könnten assoziiert ist, oder für die Identifizierung von neuen, zu druggable therapeutische Targets zu verbessern Behandlungsverfahren für Patienten mit EOC diagnostiziert.
Mehr grundlegend, könnten die Modelle, die wir beschrieben haben, verwendet, um ein tieferes Verständnis der zugrunde liegenden phänotypischen und molekularen Veränderungen, die während EOC Initiierung und frühen Entwicklung der Krankheit auftreten, gewinnen. Es ist jetzt klar, dass verschiedene EOC Subtypen unterschiedliche molekulare Profile, klinische Charakteristika und der zugrunde liegenden Biologie haben. Durch die Erzeugung einer Bibliothek von EOC Vorläuferzellen und Modellierung der Entwicklung der einzelnen Krebs-Subtyp, einschließlich der Mikroumgebung Einflüsse, kann es möglich sein, neue Einblicke in die Entwicklung des EOC histotypes gewinnen durch Modelle, die genau die Entwicklung der Krankheit in der conditio humana. Die Methoden, die wir beschreiben können, um eine breite Palette von Studien und Anwendungen, einschließlich der Untersuchung der anderen soliden Tumoren angewendet werden. Wir haben Sphäroidbildung Fähigkeit in über 50 verschiedenen normalen und transformierten Zelllinien ovariellen bisher getestet und festgestellt, dass die überwiegende Mehrheit von Zelllinien können Sphäroiden zu bilden, wenn bei hohen Zelldichten auf polyHEMA beschichteten Platten plattiert sind. Wir erwarten daher, dass die Zellkultur-Modellen aus anderen Säugerorganen und auch andere Arten könnten auch in 3D mit diesem Ansatz kultiviert werden.
ve_content "> Diese Ansätze können einen Fortschritt darstellen spezifisch für die Untersuchung der Rolle der Mikroumgebung während Tumorinitiation, beispielsweise bei Untersuchungen der Wechselwirkungen von diskreten somatischen genetische Aberrationen in Tumor Epithelzellen bestehenden gleichzeitig mit spezifischen Mikroumgebungsbedingungen Variablen. Wir haben gezeigt, dass phänotypischen Veränderungen in Stromazellen beeinflussen kann Epithelzelle Phänotyp 8. Durch Abänderung der Zelltypen in das Modell aufgenommen, könnte man untersuchen, ob verschiedene Stromazellen differentiell zu beeinflussen Epithelzellvermehrung und Expression von anderen Markern zB Marker mit Invasion oder Metastasen verknüpft. Außerdem sind diese Varianten können auch bei der Untersuchung von gutartigen Krankheit und normalem ovariellen Physiologie verwendet werden. Zum Beispiel können solche 3D-Modellen in Fertilitätsstudien könnte verwendet werden, um die Rolle der Ovar-Stroma während Oocytenreifung auszuwerten.Für die Untersuchung des Beitrags der microenvironment zu EOC Entwicklung und die Rolle von Eierstock-Krebs assoziiertes Fibroblasten in malignen EOC Diese Modelle können auch durch Co-Kultivieren von Eierstockkrebszellen mit Fibroblasten aus Tumorproben isoliert angepasst werden. Komplexere Kulturen könnte auch durch die Einführung zusätzlicher, relevante Zelltypen in den heterotypische Struktur erzeugt werden. Zum Beispiel könnte das Modell des stromalen und epithelialen Zell-Wechselwirkungen entwickelten wir durch die Einführung von Granulosazellen, Immun-oder Endothelzellen ergänzt. Eine andere Möglichkeit wäre, um Co-Kultur andere Vorläufer Zelltypen im ovariellen Stroma Modell, wie Epithelzellen aus dem Eileiter und Endometrium sein. Es ist auch möglich, zusätzliche parakrine Wechselwirkungen, vorgeschlagen, während EOC Initiation wichtigen sind modellieren. Beispielsweise könnten in den Steroidhormonen heterotypische Modell eingebracht werden, oder Expression parakrine wirkende Gene konnten ausschließlich gestört werden im Abteil und Stromazellendie Wirkung auf Epithel-Zellen gemessen.
Die Mehrheit der Ovarialkarzinome werden in einem späten Stadium identifiziert, nachdem die Krankheit hat überall in dem Peritoneum verbreitet. Eierstockkrebs diagnostiziert, wenn die Eierstöcke (Stufe 1) lokalisiert effektiv mit einer Operation behandelt werden und in über 90% der Fälle die Patienten von ihrer Krankheit geheilt. Es ist klar, dass Strategien zur Früherkennung von Eierstockkrebs erheblich verringern Eierstockkrebs Morbidität und Mortalität. Durch ein tieferes Verständnis der frühen Krankheitsstadium Entwicklung mit organotypischen Modellierungsansätze wie hier beschrieben, ist zu erwarten, dass neue Möglichkeiten für Erkennung von Krankheiten bei Risikopatienten Bevölkerung enthüllt werden und letztlich in die klinische Praxis umgesetzt werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde an der Keck School of Medicine, University of California, USA, und am University College London, UK durchgeführt. KL wird von National Institute of Health Gewährung 5 U19 CA148112-02 finanziert. BG wurde von einer Projektgruppe Zuschuss aus dem Eve Appeal gynäkologische Onkologie Charity (UK) finanziert. Einige dieser Arbeiten am UCLH / UCL durchgeführt wurde teilweise Finanzierung aus dem Department of Health NIHR Biomedical Research Centre Förderprogramm.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
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References
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