Summary
हम स्थापित करने के लिए तरीके का वर्णन
Abstract
उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर (EOCs) पश्चिमी समाजों में स्त्रीरोगों दुष्टता से मौत का प्रमुख कारण हैं. शल्य चिकित्सा उपचार और बेहतर प्लेटिनम आधारित chemotherapies में प्रगति के बावजूद, वहाँ EOC जीवित रहने की दरों में थोड़ा सुधार चार से अधिक दशकों 1,2 के लिए किया गया है. मंच Whilst मैं ट्यूमर 5 वर्ष जीवित रहने की दर है> 85%, चरण III / चतुर्थ रोग के लिए जीवित रहने की दर 40% है. इस प्रकार, EOC के लिए मृत्यु की उच्च दर काफी अगर ट्यूमर पहले, अधिक treatable, 3-5 चरणों में पाया गया की कमी हुई सकता है. वर्तमान में, प्रारंभिक चरण रोग के विकास के आणविक आनुवंशिक और जैविक आधार खराब समझा जाता है. विशेष रूप से, छोटे ट्यूमर दीक्षा के दौरान microenvironment की भूमिका के बारे में जाना जाता है, लेकिन EOCs (जैसे उम्र और समता) के लिए जोखिम कारकों ज्ञात सुझाव है कि microenvironment EOCs के प्रारंभिक उत्पत्ति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इसलिए हम तीन आयामी heterotypic मॉडल विकसितदोनों सामान्य और प्रारंभिक चरण डिम्बग्रंथि के कैंसर के अंडाशय के. अंडाशय के लिए सामान्य, हम सह सुसंस्कृत सामान्य डिम्बग्रंथि सतह उपकला (IOSE) और सामान्य stromal (INOF) fibroblast कोशिकाओं, मानव टेलोमिरेज (hTERT) holoenzyme संस्कृति में इन कोशिकाओं की उम्र बढ़ाने के उत्प्रेरक सबयूनिट के retrovrial पारगमन द्वारा अमर. डिम्बग्रंथि उपकला कोशिका परिवर्तन, IOSE कोशिकाओं में CMYC ओंकोजीन की overexpression फिर, INOF कोशिकाओं के साथ सह सुसंस्कृत के प्रारंभिक चरणों मॉडल. इन heterotypic मॉडल परिवर्तन और उपकला कोशिकाओं के आक्रमण पर उम्र बढ़ने और senescence के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया. यहाँ हम इन तीन आयामी मॉडल के विकास में methodological कदम का वर्णन है, इन तरीकों सामान्य अंडाशय और डिम्बग्रंथि के कैंसर के ऊतकों के विकास के लिए विशिष्ट नहीं हैं, और अन्य प्रकार के ऊतक का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जहां stromal और उपकला सेल बातचीत एक मौलिक हैं ऊतक रखरखाव और di पहलूsease विकास.
Protocol
चित्रा 1 नीचे वर्णित कार्यप्रवाह की एक सिंहावलोकन दिखाता है.
1. सामान्य डिम्बग्रंथि Fibroblasts और इन विट्रो उम्र में विस्तार की hTERT Holoenzyme कैटालिटिक सबयूनिट की Overexpression द्वारा अलगाव
- डिम्बग्रंथि ऊतकों सूचित रोगी सहमति और संस्थागत समीक्षा बोर्ड (अमेरिकी संस्थानों के लिए) के अनुमोदन के साथ एकत्र किया जा सकता है. सामान्य डिम्बग्रंथि ऊतकों पेट या द्विपक्षीय salpingo-oophorectomy के साथ कुल लेप्रोस्कोपिक गर्भाशयोच्छेदन गर्भाशयोच्छेदन के बाद एकत्र किया जा सकता है. इस अध्ययन में, ऊतकों एक रोगविज्ञानी और डिम्बग्रंथि सेल संस्कृति के लिए biopsied stroma के एक हिस्से के द्वारा जांच की गई. लगभग 2-5 2 मिमी के ऊतक के नमूने अंडाशय के मध्य क्षेत्र से काटा गया करने के लिए भी डिम्बग्रंथि epithelia नमूने की संभावना को कम करने का प्रयास है.
- अमर सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblast में सेल कल्चर प्रयोगशाला परिवहन ताजा डिम्बग्रंथि ऊतक (IN) मध्यम विकास, अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं और antimycotics के साथ पूरक. शामिल INOF मध्यम विकास (INOF जीएम): मध्यम 199 और MCDB105 एक 1:1 अनुपात में मिलाया, 15% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, 50 ग्राम / मिलीलीटर gentamicin और 250 एनजी / एमएल amphotericin बी के साथ पूरक
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर कार्य: किसी उपकला कोशिकाओं कि शिथिल ऊतकों को संलग्न रहते हैं 5 एमएल पीबीएस के साथ नमूना धोने निकालें. Aspirate और दो बार दोहराएँ.
- एक साफ 10 सेमी (P100) व्यास संस्कृति डिश में नमूना प्लस पीबीएस स्थानांतरण. बाँझ संदंश का प्रयोग करने के लिए एक दूसरे, शुष्क P100 साफ संस्कृति डिश में ऊतक और जगह संभाल. बाँझ स्केलपेल का उपयोग करने के लिए ऊतक 0.5 सेमी 2 टुकड़े काट. एक अलग पकवान P100 और टुकड़ों में और कटौती <1 2 मिमी आकार में में ऊतक के एक टुकड़ा रखें. 20 मिलीलीटर INOF (प्लस एंटीबायोटिक दवाओं और antimycotics) - जीएम, और 37 पर सेते हैं ° सी, 5% सीओ 2 जोड़ें. सेल चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर विकास की निगरानी. कोशिकाओं पकवान बुद्धि का पालन करने में देखा जा सकता है हिन घंटा 24.
- एक सप्ताह के बाद पुन फ़ीड, आकांक्षा द्वारा किसी भी गैर अनुयायी ऊतक को हटाने. इसके बाद, एक सप्ताह में दो बार संस्कृतियों refeed. कोशिकाओं कालोनियों 1-3 सप्ताह के भीतर आमतौर पर बनेगी. एक बार इन कालोनियों subculture (एक बार वे 500 मीटर के आसपास पहुंच) के लिए काफी बड़े हैं, trypsin लेपित क्लोनिंग डिस्क का उपयोग कर क्लोनों अलग.
कोशिकाओं की पुष्टि 100% तंतुप्रसू संबंधी और अन्य सेलुलर contaminants के कांच coverslips पर सेल लाइन का एक नमूना चढ़ाना और इम्युनो फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना एक तंतुप्रसू संबंधी मार्कर (FSP), एक उपकला मार्कर (अखिल cytokeratin) और एक endothelial सेल मार्कर के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं (वॉन Willenbrand फैक्टर आठवीं). - पारित होने के प्राथमिक सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblast सेल (NOF) 3 P100 एक दिन व्यंजन hTERT की रेट्रोवायरल transduction पूर्व में एक एकल P100 पकवान से आइसोलेट्स. पूर्व बनाया वायरल supernatants, खरीदा जा सकता है या घर में उत्पादन सह transfecting HEK293T कोशिकाओं के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग (देखेंलक्ष्य = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
रेट्रोवायरल supernatants pBABE hygro-hTERT वेक्टर (Addgene) का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता है. इनक्यूबेटर से NOFs निकालें और फिर सेल संस्कृति मध्यम aspirate. प्रत्येक पकवान वायरल तैरनेवाला के 3 मिलीलीटर जोड़ें: एक पकवान hTERT retrovirus प्राप्त, 2 एन डी GFP-retrovirus पकवान प्राप्त करता है और 3 पकवान कोई वायरस प्राप्त. वायरल INOF जीएम polybrene युक्त 8 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता दे supernatants ढ़कें. पुन फ़ीड कोशिकाओं ताजा माध्यम से अगले दिन. संक्रमण के बाद दो दिन, सात दिनों के इस खुराक 20 यू / एमएल के लिए बढ़ाया जा सकता है के बाद कम खुराक (10 यू / मिलीलीटर) hygromycin बी के साथ चयन शुरू; चयन 10-14 दिनों के भीतर पूरा किया जाना चाहिए. - HTERT या GFP व्यक्त क्लोन अंगूठी क्लोनिंग के द्वारा अलग किया जा सकता है एक बार वे 500 मीटर के आसपास पहुंच. सेल लाइनों अतिरिक्त लक्षण वर्णन hTERT और प्राथमिक कोशिका लाइन सुविधाओं की अवधारण के सफल अभिव्यक्ति की पुष्टि की आवश्यकता. यह शामिल है: (क)टेलोमिरेज गतिविधि पीसीआर एलिसा और telomere लंबाई की पुष्टि करने के लिए, दक्षिणी धब्बा या पीसीआर 6,7, (ख) महत्वपूर्ण मार्कर (जैसे उपकला कोशिकाओं की पहचान के लिए एक विरोधी में अखिल cytokeratin के लिए एंटीबॉडी के साथ immunostaining की अभिव्यक्ति की पुष्टि के साथ, और एक विरोधी fibroblasts के लिए fibroblast सतह प्रोटीन एंटीबॉडी) प्राथमिक और hTERT अमर कोशिकाओं के बीच समान हैं, (ग) कोशिकाओं की पुष्टि neoplastic परिवर्तन के गुणों (जैसे लंगरवानी स्वतंत्र विकास assays का उपयोग) नहीं दिखा है, (घ) इन विट्रो उम्र में की पुष्टि की विस्तार में मनाया hTERT लेकिन नहीं GFP व्यक्त कोशिकाओं hTERT व्यक्त अमर सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblasts (INOFs) replicative senescence बाईपास लेकिन neoplastically तब्दील नहीं करना चाहिए; इसके अतिरिक्त INOF कोशिकाओं fibroblast सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति है, लेकिन cytokeratin के रूप में नहीं मार्करों उपकला (2 चित्रा) को बनाए रखने चाहिए .
2. ऊतक संस्कृतियों की कोटिंगई PolyHEMA साथ गैर पक्षपाती सेल संस्कृति के लिए व्यंजन
- समाधान तैयार polyHEMA, एक बाँझ बोतल में 1.5 ग्राम polyHEMA, और जगह तौलना. 95 मिलीलीटर आणविक जीव विज्ञान ग्रेड निरपेक्ष इथेनॉल और 5 मिलीग्राम सेल संस्कृति ग्रेड आसुत जल जोड़ें. polyHEMA hydrogel समाधान के पानी की सामग्री में भंग, और इथेनॉल तैयारी बाँझ बनाना होगा.
- Waterbath में 65 में polyHEMA समाधान प्लेस ° C तक पूरी तरह से भंग है. यह 8 घंटे तक लग सकते हैं. ध्यान दें कि polyHEMA समाधान समय की लंबी अवधि के लिए संग्रहीत नहीं कर सकते हैं और इसलिए हमेशा नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए.
समस्या निवारण: polyHEMA समाधान 65 में लंबी ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है डिग्री सेल्सियस नियमित रूप से polyHEMA समाधान मिश्रण पलटना. कांच की बोतल के नीचे मनाया चिपचिपापन polyHEMA इंगित करता है और पूरी तरह से भंग कर रहा है और 65 पर आगे ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस की आवश्यकता है. - PolyHEMA समाधान के साथ एक लामिना का प्रवाह हुड, कोट टिशू कल्चर व्यंजन के अंदर काम कर रहे हैं. कोई sizटिशू कल्चर पकवान, फ्लास्क या multiwell प्लेट के ई polyHEMA साथ लेपित किया जा सकता है. PolyHEMA प्रत्येक पोत के लिए आवश्यक समाधान की अनुशंसित मात्रा 2 तालिका में दिया जाता है.
- सेल संस्कृति व्यंजन लामिना का प्रवाह हुड के अंदर शुष्क करने की अनुमति दें. यह 2-3 दिन लग सकते हैं. कोमल एक कमाल मंच पर कमाल करने के लिए बड़े आकार के बर्तन या बोतल की कोटिंग भी सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. PolyHEMA समाधान dries यदि भी तेजी से सतह चिकनी नहीं हो सकता. इस से बचने के लिए सुनिश्चित करने के लिए, पकवान / फ्लास्क ढक्कन सुखाने की प्रक्रिया के दौरान पर रहता है.
- PolyHEMA के एक दूसरे कोट लागू करें और ऊपर वर्णित के रूप में करने के लिए सूखी अनुमति देते हैं.
समस्या निवारण: polyHEMA कोटिंग में छेद हो, खासकर जब प्लेटें जल्दी सूख भी कर सकते हैं. डबल कोटिंग polyHEMA साथ प्लेटों के अंतराल या कोटिंग में दरारें को कवर करने में मदद करता है का उपयोग करने से पहले आते हैं. प्लेट्स आमतौर पर सूखी प्रत्येक polyHEMA कोट के लिए 2-3 दिन लग और इसलिए कम से कम एक सप्ताह के लिए तैयार किया जाना चाहिए इससे पहले कि वे सेल संस्कृति के लिए आवश्यक हो जाएगा. - PolyHEMA लेपित प्लेट का उपयोग करें जब तक कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
नोट: 1% agarose समाधान, 1X पीबीएस में भंग और बाँझ बनाना autoclaved, कोट सेल संस्कृति व्यंजन भी अल्पकालिक 3D संवर्धन के लिए एक गैर पक्षपाती सतह (कम से कम एक सप्ताह के लिए) बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बहु - अच्छी तरह से प्लेटों के agarose कोटिंग एक अवतल सतह है कि कई सेल लाइनों के लिए एक अच्छी तरह से प्रति एक उपगोल के गठन को बढ़ावा बनाता है. हालांकि, अब 3 डी संस्कृतियों लिए polyHEMA कोटिंग agarose कोटिंग अक्सर अब संस्कृति अवधि के बाद विखंडित के रूप में सिफारिश की है.
3. जनरेटिंग तीन आयामी (3 डी) heterotypic और 3 डी संस्कृतियों के पुन खिला spheroids
- ठीक है और INOF और उपकला सेल संस्कृतियों के लिए इन विट्रो में 3D heterotypic spheroids की स्थापना के लिए पर्याप्त कक्षों तैयार का विस्तार. उपकला आरए: हम आम तौर पर 2 4x10 बीज P100 पकवान के प्रति 6 INOFs और 0.5-1x10 6 उपकला कोशिकाओं stromal देने के लिए 'जन' संस्कृतियों के लिए4:1 के tio. INOF कोशिकाओं INOF gentamicin या amphotericin बी के बिना विकास मध्यम (INOF जीएम) अगर वांछित, fibroblast कोशिकाओं 3D संस्कृति से पहले pretreated किया जा सकता है (senescence के शामिल होने के लिए जैसे बड़े हो रहे हैं, कोशिकाओं हाइड्रोजन पेरोक्साइड के उप घातक खुराक के साथ इलाज किया जा सकता है ).
- 5 मिनट के लिए 5 मिलीग्राम खारा (पीबीएस) फॉस्फेट-buffered एक सूखी polyHEMA प्लेट से धो लें. पीबीएस Aspirate और 15 मिलीलीटर INOF जीएम के साथ बदलें.
- इस बीच, सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblast कोशिकाओं अमर trypsinize उन्हें संस्कृति पकवान से 3-5 मिनट संस्कृति मीडिया और गोली कोशिकाओं के एक बराबर मात्रा के साथ centrifugation द्वारा 5 मिनट के लिए 450 XG पर trypsin बेअसर के बाद, अलग.
- तैरनेवाला त्यागें. 5 मिलीग्राम INOF जीएम में सेल गोली resuspending द्वारा एक एकल कोशिका निलंबन बनाएँ, pipetting और नीचे या धीरे vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण. 10 μl सेल निलंबन और 10 μl trypan नीले मिश्रण और एक hemocytometer का उपयोग कर की गणना कर सेल एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. Trypan blue बहिष्करण का उपयोग किया जा सकता हैघ के लिए जीवित कोशिकाओं की पहचान.
- पहले से ही थाली में polyHEMA लेपित तिरस्कृत मध्यम 4x10 6 INOF कोशिकाओं जोड़ें. संस्कृति मीडिया 20 मिलीग्राम मात्रा ताजा INOF जीएम और सेते का एक उचित मात्रा में 37 डिग्री सेल्सियस का प्रयोग कर रहा है, 5% सीओ 2. कोशिकाओं multicellular spheroids में कुल 24 घंटे के भीतर शुरू करते हैं. उपगोल गठन चरण माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती है.
जन संस्कृति की शर्तों के तहत उपगोल संख्या की सटीक गिनती करना मुश्किल है, लेकिन हम अनुमान है कि हम 50-100 spheroids प्राप्त जब 4x10 6 stromal कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है. उपगोल आकार आमतौर पर 80-250 सुक्ष्ममापी से लेकर. - उपगोल संस्कृतियों हर 2-3 दिन पुनः फ़ीड एक कोण पर एक लामिना का प्रवाह हुड के भीतर रखा विंदुक पर प्लेटों आराम से. Spheroids व्यवस्थित करने की अनुमति दें. यह अप करने के लिए 20 मिनट का समय लग सकता है. ध्यान से केवल लगभग 4 मिलीलीटर पकवान में तब तक बना रहेगा जब तक एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ थक मीडिया को हटा दें. देखभाल करने के लिए spheroids नहीं aspirate. 16 मिलीलीटर ताजा INO के साथ पुन फ़ीडF-जीएम और इनक्यूबेटर में लौटने.
- 7 दिन, fibroblast spheroids उपकला कोशिकाओं को जोड़ने के रूप में heterotypic संस्कृतियों बनाने. डिम्बग्रंथि trypsinization द्वारा उपकला कोशिकाओं (phenotypically सामान्य या बदल) के निलंबन की तैयारी रूप में 3.4-3.5 खंड में वर्णित है. सेल एक hemocytometer का उपयोग एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. INOF जीएम में एक बार धोने के लिए उपकला विकास मीडिया से खत्म किया जा रहा है किसी भी वृद्धि कारकों को रोकने के.
हमारी प्रयोगशाला में सामान्य डिम्बग्रंथि सतह उपकला कोशिका लाइनों (OSEC) पेट या द्विपक्षीय salpingo-oophorectomy के साथ कुल लेप्रोस्कोपिक गर्भाशयोच्छेदन गर्भाशयोच्छेदन द्वारा हटा अंडाशय से सूचित रोगी सहमति से एकत्र किए गए. अंडाशय के लिए उपकला इकट्ठा करने के लिए एक बाँझ cytobrush के साथ ठुकरा दिया गया. प्राथमिक सेल लाइनों की स्थापना की और hTERT साथ transduced ऊपर वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे थे. का विवरण 2d में OSEC संस्कृति, 3 डी और OSEC स्थायीकरण 10 और 11 के संदर्भ में पाया जा सकता है. - Heterotypic sph फार्मeroids, fibroblast अकेले spheroids के पहले फिर फ़ीड संस्कृतियों. तो 1x10 6 उपकला कोशिकाओं के साथ 04:01 fibroblasts उपकला कोशिकाओं के अनुपात में fibroblast उपगोल संस्कृतियों टीका लगाना. Heterotypic spheroids INOF जीएम में संस्कृति.
- Heterotypic संस्कृतियों एक अतिरिक्त 14 दिनों के लिए हर 2-3 दिनों पुन फ़ीड.
4. इमेजिंग और आण्विक विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण
- कई अलग अलग तकनीक heterotypic spheroids का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इमेजिंग के लिए, यह सिफारिश की है कि spheroids एक 25 मिलीलीटर विंदुक के साथ संस्कृति पकवान से काटा जाता है. धीरे धीरे pipetting कतरनी उपगोल की वास्तुकला में खलल न डालें बलों की संभावना को कम कर देंगे. Spheroids फिर धीरे से 10 मिनट के लिए 100 XG पर centrifugation द्वारा PBS और pelleted में कर सकते हैं धोया जाना, उच्च केंद्रत्यागी बलों spheroids नुकसान हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, संस्कृतियों एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है और बसने की अनुमति दी है, और विकास के माध्यम फिर हटा दिया.
- Immunohisto लिएरसायन शास्त्र, तटस्थ के साथ तय spheroids कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए formalin buffered. गोली spheroids और 70% इथेनॉल के साथ formalin की जगह. मानक मानव ऊतकों के लिए इस्तेमाल प्रोटोकॉल का उपयोग आयल में प्रक्रिया. पैराफिन - एम्बेडेड spheroids sectioned, और या तो hematoxylin और लाल भामसान रंग या विशिष्ट आणविक मानक immunohistochemistry का उपयोग मार्कर (चित्रा 3) के साथ दाग हो सकता है.
- वैकल्पिक रूप से, पीबीएस में धोया spheroids 4% paraformaldehyde में तय किया जा सकता है (पीबीएस में तैयार), इष्टतम काटना तापमान अक्टूबर मध्यम और तस्वीर में जमे हुए सेक्शनिंग और immunofluorescent धुंधला हो जाना के लिए जमे हुए में एम्बेडेड.
- आणविक विश्लेषण के लिए, spheroids, काटा जा सकता pelleted और डीएनए, शाही सेना या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं lysing पहले पीबीएस में दो बार धोया.
- प्रवाह cytometry से विश्लेषण के लिए, spheroids पीबीएस और trypsin या accutase पाचन द्वारा dissociated में 37 डिग्री सेल्सियस में धोया जा सकता है ऐसा करने के लिए, डूब बाज़ ट्यूब spheroids मैं युक्तna waterbath trypsinization को सुविधाजनक बनाने के लिए. एक एकल कक्ष निलंबन में spheroids की पूरी हदबंदी समाधान pipetting और एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ नीचे से पदोन्नत किया जा सकता है. देखभाल करने के लिए नहीं कोशिकाओं से अधिक trypsinize.
मध्यम संस्कृति की एक समान मात्रा के साथ प्रतिक्रिया बेअसर और एक 40-70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से निलंबन गुजर द्वारा सेल clumps निकाल. गोली कोशिकाओं, पीबीएस के साथ धोने, एन्यूमरेट करने के लिए और FACS बफर में कोशिकाओं की वांछित संख्या resuspend. निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं दाग.
5. प्रतिनिधि परिणाम
इस दृष्टिकोण के आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और सामान्य डिम्बग्रंथि जीव विज्ञान के अध्ययन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डिम्बग्रंथि के कैंसर दीक्षा के अध्ययन के लिए. 3D व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोशिकी मैट्रिक्स जेल का उपयोग कर बनाया संस्कृतियों पर इस दृष्टिकोण का एक बड़ा फायदा यह है कि सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblasts मैट्रिक्स कोशिकी कि यू बनाता उत्पादनspheroids की कोर पी. हमारे अनुभव में, मैट्रिक्स सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblasts द्वारा उत्पादित सामग्री विषम है और अधिक बारीकी से किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैट्रिक्स जेल से अंडाशय के बाह्य मैट्रिक्स जैसा दिखता है. हमारी प्रयोगशाला में हम उपकला कोशिकाओं है कि आंशिक रूप से किया गया है इन विट्रो में तब्दील सामान्य और वृद्ध होनेवाला डिम्बग्रंथि fibroblasts के साथ परिभाषित आनुवंशिक तत्वों (जैसे CMYC overexpression) और सह सुसंस्कृत इन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक रजोनिवृत्ति के बाद अंडाशय में प्रारंभिक अवस्था डिम्बग्रंथि के कैंसर की नकल का उपयोग किया है. हमारे आंकड़े बताते हैं कि उम्र बढ़ने microenvironment आंशिक रूप से बदल उपकला कोशिकाओं के neoplastic सुविधाओं (जैसे प्रसार) (चित्रा 3) को बढ़ावा देता है, जबकि एक सामान्य microenvironment neoplastic प्रगति 8 रोकता. हमारी प्रयोगशाला और दूसरों को भी इसी तरह के तरीकों का इस्तेमाल किया है सामान्य डिम्बग्रंथि उपकला 9 कोशिकाओं, फैलोपियन ट्यूब उपकला कोशिकाओं neoplastic प्रगति की, कदम - वार मॉडल मॉडल
चित्रा 1. 3 डी heterotypic संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध सिंहावलोकन टिशू कल्चर बोतल दो बार के एक 1% polyHEMA समाधान के साथ लेपित हैं और सूखे की अनुमति दी. PolyHEMA लेपित प्लास्टिक 1x पीबीएस तुरंत उपयोग करने के लिए पूर्व के साथ धो रहे हैं. अमर सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblast कोशिकाओं (4x10 6 कोशिकाओं) फ्लास्क में 20 मिलीलीटर मध्यम विकास के साथ चढ़ाया जाता है. 7 दिनों से अधिक उपगोल गठन और विकास पर नजर रखी. इस बिंदु पर, fibroblast उपगोल संस्कृतियों 1x10 6 उपकला कोशिकाओं के साथ inoculated हैं, और 14 दिनों के लिए दो प्रकार की कोशिकाओं सह सुसंस्कृत पहले बहुकोशिकीय spheroids काटा और बहाव के अनुप्रयोगों (आणविक विश्लेषण, इमेजिंग, आदि) के लिए कार्रवाई कर रहे हैं.
चित्रा 2. HTERT <के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना/ Em> सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblasts अमर दोनों प्राथमिक सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblasts (पीआर NOFs) और सामान्य डिम्बग्रंथि (INOFs) एक्सप्रेस fibroblast विशिष्ट प्रोटीन (FSP) है, व्यक्त (सी.के.-7) नहीं cytokeratin-7 और एक्सप्रेस vimentin (वीआइएम) fibroblasts अमर . ब्याज की मार्करों हरे रंग में दिखाया जाता है, डीएनए DAPI साथ सना हुआ है और नीले रंग में दिखाया गया है, cytoplasm इवान नीले और लाल रंग में दिखाया के साथ counterstained है.
चित्रा 3. सह सुसंस्कृत stromal और उपकला कोशिकाओं के immunohistochemistry वाम पैनल, सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblast उपगोल मोनोकल्चर, hematoxylin और लाल भामसान रंग से सना हुआ. सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblast कोशिकाओं 3 डी रूप एक आकारिकी spindled और प्रचुर मात्रा में बाह्य मैट्रिक्स के साथ कोशिकाओं के मिलकर spheroids में अकेले सुसंस्कृत. सही पैनल: सामान्य डिम्बग्रंथि fibroblasts हाइड्रोजन पेरोक्साइड के लिए खुल गए थे करने के लिए senescence प्रेरित. आंशिक रूप से बदल डिम्बग्रंथि उपकला कोशिकाओं (IOSE
चित्रा 4. 3D संवर्धित कोशिकाओं के histological प्राथमिक ऊतकों को प्रतिबिंबित करता है (ए) स्पष्ट सेल डिम्बग्रंथि carcinomas विशेषता स्पष्ट सेल संरचनाओं प्रदर्शित करते हैं, इनमें से अनुपस्थित रहे हैं जब स्पष्ट सेल EOC लाइनों प्लास्टिक, लेकिन इसी तरह की संरचनाओं पर हो रहे हैं का पता चला रहे हैं जब एक ही कोशिकाओं 3D spheroids के रूप में बड़े हो रहे हैं. ( बी). (सी) सामान्य डिम्बग्रंथि उपकला 14 दिनों के लिए spheroids के रूप में विकसित कोशिकाओं की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ. भूतल microvilli दिखाई दे रहे हैं (तीर). (डी) तरल डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइन spheroids, संस्कृति में. (ए, बी) sectioned पैराफिन Hematoxylin और लाल भामसान रंग धुंधला हो जाना ट्यूमर ऊतक या 3 डी spheroids एम्बेडेड, (सी) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, (डी) चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी. Spheroids गोलाकार हो (धराशायी चक्र) कर सकते हैंआकार में अनियमित या छवि के बाईं ओर में देखा संरचना के मामले में के रूप में.
| डिश / थाली के आकार | PolyHEMA की मात्रा (दो बार लागू किया जा) | संस्कृति, मीडिया अंतिम मात्रा |
| 6 अच्छी तरह से थाली | 3 मिलीलीटर | 5-7 मिलीलीटर |
| 12 अच्छी तरह से थाली | 1.5 मिलीलीटर | 2 मिलीलीटर |
| 24 अच्छी तरह से थाली | 500 μl | 1.5 मिलीलीटर |
| 48 अच्छी तरह से थाली | 250 μl | 500 μl |
| 96 अच्छी तरह से थाली | 50 μl | 200 μl |
| P100 संस्कृति डिश | 4-5 मिलीलीटर | 20 मिलीलीटर |
| P60 संस्कृति डिश | 2-3 मिलीलीटर | 5-7 मिलीलीटर |
| F25 फ्लास्क | 2-3 मिलीलीटर | 7 मिलीलीटर |
| F75 फ्लास्क | 4-5 मिलीलीटर | 20-30 मिलीलीटर |
| F175 फ्लास्क | 15 मिलीलीटर | 30-50 मिलीलीटर |
तालिका 2 polyHEMA कोटिंग और 3 डी संवर्धन के लिए संस्करणों की सिफारिश की.
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Discussion
प्रारंभिक अवस्था उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर (EOC) के जीव विज्ञान खराब समझा जाता है. शायद कई वर्षों के लिए इस क्षेत्र में मुख्य बाधाओं में से एक रोग के ऊतक विशिष्ट मूल और EOC विकास में microenvironment की भूमिका के महत्व की समझ की कमी के कारण किया गया है. पिछले कुछ वर्षों में, स्पष्ट बन गया है कि EOC कई विभिन्न उपप्रकारों के लिए अलग सेलुलर मूल के साथ शायद अलग histophathological उपप्रकार, के साथ एक विषम रोग है. उदाहरण के लिए, वर्तमान आंकड़े बताते हैं कि उच्च ग्रेड रक्तोदकीय EOCs दोनों फैलोपियन ट्यूब स्रावी उपकला कोशिकाओं और डिम्बग्रंथि सतह उपकला कोशिकाओं से उत्पन्न हो सकता है, कम से कम endometrioid और स्पष्ट सेल EOCs के एक अनुपात लिए डिम्बग्रंथि endometriosis (अन्तर्गर्भाशयकलार्बुद) से उठता लगा रहे हैं, और mucinous EOCs paraovarian या paratubal संक्रमणकालीन प्रकार 15,16 उपकला से उत्पन्न हो सकती है. हालांकि, वहाँ केवल किया गया है इन विट्रो और <में सीमितउन्हें इन histotypes इन विट्रो EOC की heterotypic मॉडलिंग ट्यूमर stroma उपकला बातचीत और डिम्बग्रंथि carcinomas के विकास के साथ जुड़े microenvironment अध्ययन में किसी के लिए रोग प्रगति के vivo मॉडल में अनुसंधान के एक भी कम विकसित क्षेत्र है. ट्यूमर stroma दोनों ट्यूमर बायोमार्कर के एक स्रोत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपचार के लिए एक उपन्यास लक्ष्य होने की संभावना है. और EOC का heterotypic मॉडल के विकास उपयोग इसलिए उपन्यास प्रारंभिक स्तर रोग है जो स्क्रीनिंग के एक कार्यक्रम का हिस्सा है और जल्दी रोग का पता लगाने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ जुड़े biomarkers की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, या उपन्यास की पहचान के लिए, druggable चिकित्सकीय लक्ष्य में सुधार करने के लिए EOC के साथ का निदान रोगियों के लिए इलाज regimens.
मौलिक, मॉडल हम वर्णित है अंतर्निहित प्ररूपी और आणविक परिवर्तन EOC दीक्षा और जल्दी रोग के विकास के दौरान होने की एक गहरी समझ हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह है अब स्पष्ट है कि अलग EOC subtypes विशिष्ट आणविक प्रोफाइल, नैदानिक विशेषताओं और अंतर्निहित जीव विज्ञान है. EOC अग्रदूत साबित कोशिकाओं के एक पुस्तकालय सृजन और प्रत्येक कैंसर उप प्रकार के विकास मॉडलिंग प्रभावों सहित microenvironmental, यह EOC histotypes के विकास में मॉडल के माध्यम से सही है कि मानव हालत में रोग के विकास को प्रतिबिंबित उपन्यास अंतर्दृष्टि लाभ संभव हो सकता है. के तरीके हम वर्णन अध्ययन और अन्य ठोस ट्यूमर के अध्ययन के आवेदन पत्र सहित, की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. हम पचास से अधिक विभिन्न सामान्य और बदल डिम्बग्रंथि तिथि करने के लिए सेल लाइनों में उपगोल गठन करने की क्षमता का परीक्षण किया है, और कहा है कि सेल लाइनों का विशाल बहुमत जब polyHEMA लेपित प्लेट पर उच्च सेल घनत्व चढ़ाया spheroids फार्म में सक्षम हैं. इसलिए हम अन्य स्तनधारी अंगों से है कि सेल संस्कृति मॉडल की आशा है और भी अन्य प्रजातियां भी इस दृष्टिकोण का उपयोग कर 3 डी में संवर्धित किया जा सकता है.
ve_content "> इन तरीकों ट्यूमर दीक्षा के दौरान microenvironment की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक अग्रिम विशेष रूप से प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, उदाहरण के लिए ट्यूमर उपकला विशिष्ट microenvironmental चर के साथ समवर्ती मौजूदा कोशिकाओं में असतत दैहिक आनुवंशिक aberrations की बातचीत के अध्ययन में हम कि प्ररूपी परिवर्तन दिखाया गया है stromal कोशिकाओं में उपकला कोशिका 8 phenotype को प्रभावित कर सकते हैं. सेल प्रकार के मॉडल में शामिल फेरबदल करके, एक की जांच कर सकता है कि विभिन्न stromal कोशिकाओं विभिन्न उपकला सेल प्रसार को प्रभावित और भी अन्य विशिष्ट मार्करों जैसे आक्रमण या मेटास्टेसिस के साथ जुड़े मार्करों की अभिव्यक्ति. इसके अलावा इन, मॉडल सौम्य रोग और सामान्य डिम्बग्रंथि शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन में भी इस्तेमाल किया जा सकता है उदाहरण के लिए, ऐसे 3D मॉडल प्रजनन अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है oocyte परिपक्वता के दौरान डिम्बग्रंथि stroma की भूमिका का मूल्यांकन.मील के योगदान के अध्ययन के लिएcroenvironment EOC विकास और डिम्बग्रंथि घातक EOCs में कैंसर से जुड़े fibroblasts की भूमिका करने के लिए, इन मॉडलों को भी ट्यूमर नमूनों से अलग fibroblasts के साथ सह संवर्धन डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है. अधिक जटिल संस्कृतियों भी heterotypic संरचना में अतिरिक्त, प्रासंगिक सेल प्रकार शुरू करने से उत्पन्न किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, stromal और उपकला सेल बातचीत हम विकसित मॉडल द्वारा granulosa कोशिकाओं, प्रतिरक्षा या endothelial कोशिकाओं की शुरूआत के साथ पूरक हो सकता है. एक और संभावना सह संस्कृति फैलोपियन ट्यूब और अंतर्गर्भाशयकला से उपकला कोशिकाओं के रूप में डिम्बग्रंथि stroma मॉडल, में अन्य अग्रदूत सेल प्रकार होगा. यह भी संभव है करने के लिए अतिरिक्त paracrine कि बातचीत EOC दीक्षा के दौरान महत्वपूर्ण होने के लिए प्रस्तावित कर रहे हैं मॉडल. उदाहरण के लिए, स्टेरॉयड हार्मोन heterotypic मॉडल में पेश किया जा सकता है, या paracrine अभिनय जीनों की अभिव्यक्ति stromal डिब्बे में विशेष रूप से परेशान हो सकता है औरउपकला कोशिकाओं पर प्रभाव को मापा.
डिम्बग्रंथि के कैंसर के बहुमत एक देर चरण में पहचान कर रहे हैं, के बाद रोग peritoneum भर में व्यापक रूप से फैलाया गया है. डिम्बग्रंथि के कैंसर का निदान जब अंडाशय (1 स्टेज) स्थानीय प्रभावी ढंग से सर्जरी के साथ इलाज किया जा सकता है और मामलों के 90% से अधिक में रोगियों को रोग का इलाज कर रहे हैं. यह स्पष्ट है कि डिम्बग्रंथि के कैंसर के पहले पता लगाने के लिए रणनीति में काफी डिम्बग्रंथि के कैंसर रुग्णता और मृत्यु दर को कम कर सकता है. प्रारंभिक अवस्था रोग यहाँ वर्णित उन लोगों के रूप में organotypic मॉडलिंग दृष्टिकोण का उपयोग कर विकास की एक गहरी समझ पाने, यह अनुमान है कि पर जोखिम आबादी में बीमारी का पता लगाने के लिए नए अवसरों और पता चल जाएगा अंततः नैदानिक व्यवहार में अनुवाद.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस शोध चिकित्सा के उबकना स्कूल, कैलिफोर्निया, संयुक्त राज्य अमेरिका के विश्वविद्यालय, और यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन, ब्रिटेन में प्रदर्शन किया था. के.एल. स्वास्थ्य अनुदान 5 CA148112 U19-02 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित है. बीजी ईव अपील स्त्रीरोगों ऑन्कोलॉजी दान (यूके) से एक परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. इस UCLH / UCL पर किए गए काम से कुछ आंशिक रूप से स्वास्थ्य NIHR बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर धन योजना विभाग से धन था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
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References
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