Summary
Descriviamo metodologie per la creazione di
Abstract
Tumori ovarici epiteliali (EOCS) sono la principale causa di morte per neoplasia ginecologica nelle società occidentali. Nonostante i progressi nei trattamenti chirurgici e il miglioramento delle chemioterapie a base di platino, si è registrato pochi miglioramenti nei tassi di sopravvivenza EOC per più di quattro decenni 1,2. Mentre stadio I tumori sono a 5 anni tasso di sopravvivenza> 85%, i tassi di sopravvivenza per la fase III / IV della malattia sono <40%. Pertanto, gli alti tassi di mortalità per tumore ovarico epiteliale potrebbe essere significativamente ridotta se i tumori sono stati rilevati in precedenza, più trattabili, fasi 3-5. Allo stato attuale, la base molecolare genetica e biologica della malattia in stadio precoce sviluppo è poco conosciuta. Più in particolare, si sa poco circa il ruolo del microambiente tumorale durante l'inizio, ma i fattori di rischio noti per EOCS (ad esempio età e parità) suggeriscono che il microambiente svolge un ruolo chiave nella genesi precoce di EOCS. Abbiamo quindi sviluppato modelli eterotipiche tridimensionalisia dell'ovaio normale e di tumori ovarici primi stadi. Per l'ovaio normale, abbiamo co-coltura superficie epiteliale ovarico normale (Iose) e normale fibroblasti stromale (INOF) cellule, immortalata da trasduzione retrovrial della subunità catalitica della telomerasi holoenzyme umana (hTERT) per estendere la durata di vita di queste cellule in coltura. Per modellare le prime fasi di trasformazione cellulare ovarico epiteliale, sovraespressione del CMYC oncogene nelle cellule Iose, di nuovo co-coltura con cellule INOF. Questi modelli eterotipiche sono stati utilizzati per studiare gli effetti di invecchiamento e senescenza sulla trasformazione e l'invasione delle cellule epiteliali. Qui descriviamo le fasi metodologiche in sviluppo di questi modello tridimensionale; queste metodologie non sono specifici per lo sviluppo di ovaio normale e tessuti di cancro ovarico, e potrebbe essere usato per studiare tipi di tessuto in cui le interazioni cellule stromali ed epiteliali sono un fondamentale aspetto del tessuto e di manutenzioneSease sviluppo.
Protocol
La figura 1 illustra una panoramica del flusso di lavoro descritto di seguito.
1. Isolamento di fibroblasti normali ovariche e l'ampliamento della durata della vita in vitro dalla sovraespressione della subunità catalitica della holoenzyme hTERT
- Tessuti ovariche possono essere raccolti con il consenso informato del paziente e l'approvazione del Comitato Etico (per le istituzioni degli Stati Uniti). Tessuti ovarici normali possono essere raccolti dopo isterectomia totale addominale o isterectomia totale laparoscopica con salpingo-ovariectomia bilaterale. In questo studio, i tessuti sono stati esaminati da un patologo e una porzione di stroma ovarico biopsia per coltura cellulare. Campioni di tessuto di circa 2-5 mm 2 sono stati raccolti dalla regione centrale dell'ovaio per tentare di ridurre la possibilità di campionamento anche epiteli ovarica.
- Trasporto tessuto fresco ovarico al laboratorio di coltura cellulare in fibroblasti immortalato ovarica normale (INDI) terreno di crescita, integrato con antibiotici extra e antimicotici. Mezzo di crescita INOF (INOF-GM) comprende: Medium 199 e MCDB105 miscelato in rapporto 1:1, supplementato con 15% siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina, 50 ug / ml di gentamicina e 250 ng / ml di amfotericina B.
- Lavorando all'interno di un armadio biosicurezza: eliminare cellule epiteliali che restano debolmente fissato al tessuto, lavando il campione con 5 ml di PBS. Aspirare e ripetere altre due volte.
- Trasferire il campione più PBS in un ambiente pulito 10 cm di diametro (P100) capsula di Petri. Utilizzare pinze sterili per gestire il tessuto e il luogo in un secondo, a secco piatto P100 cultura pulito. Usa bisturi sterile per tagliare tessuti 0,5 centimetri 2 pezzi. Mettere ogni pezzo di tessuto in una separata P100 piatto e ulteriore taglio a pezzi <1 mm 2 di dimensioni. Aggiungere 20 ml di INOF-GM (più antibiotici e antimicotici), e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. Monitorare la crescita delle cellule con il microscopio a fase. Le celle possono essere visti rispettando lo spirito piatto hin 24 ore.
- Rialimentazione dopo una settimana, eliminando qualsiasi non-tessuto aderente per aspirazione. Successivamente, rialimentazione culture due volte a settimana. Le cellule si formano colonie, di solito entro 1-3 settimane. Una volta che queste colonie sono abbastanza grandi da subcultura (una volta raggiunto circa 500 micron), isolare i cloni usando tripsina rivestite dischi clonazione.
Confermare cellule sono 100% fibroblastica e privo di altri contaminanti cellulari piastrando un campione della linea cellulare su un vetrino ed eseguendo immuno-colorazione fluorescente per un marcatore fibroblastica (FSP), un marcatore epiteliale (pan-citocheratina) e un marcatore di cellule endoteliali (von Willenbrand Fattore VIII). - Passage primaria normale fibroblasti ovarica (NOF) cella isola da un unico piatto in 3 P100 P100 piatti un giorno prima trasduzione retrovirale di hTERT. Pre-made surnatanti virali possono essere acquistati o prodotti in-house utilizzando protocolli standard di co-trasfezione delle cellule HEK293T (veditarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Surnatanti retrovirali possono essere prodotti usando il pBABE-igro-hTERT vettore (Addgene). Rimuovere NoFS dall'incubatore e quindi aspirare il mezzo di coltura cellulare. Aggiungere 3 ml di surnatante virale per ogni piatto: un piatto riceve hTERT-retrovirus, il 2 ° piatto riceve GFP-retrovirus e il terzo piatto non riceve alcun virus. Sovrapporre sovranatanti virali con INOF-GM contenente polibrene per dare una concentrazione finale di 8 mg / ml. Rialimentazione cellule il giorno seguente con terreno fresco. Due giorni dopo l'infezione, inizia la selezione con basse dosi (10 U / ml) igromicina B. Dopo sette giorni la dose può essere aumentata a 20 U / ml, la selezione dovrebbe essere completa entro 10-14 giorni. - I cloni che esprimono hTERT o GFP può essere isolato per clonazione anello una volta che raggiungono circa 500 micron. Le linee cellulari richiedono caratterizzazione ulteriore per confermare la riuscita espressione di hTERT e il mantenimento delle caratteristiche principali di linee cellulari. Ciò comporta: (a)confermare l'attività della telomerasi mediante PCR-ELISA e lunghezza dei telomeri, mediante Southern blot o PCR 6,7, (b) che conferma l'espressione di marcatori critiche (ad esempio immunocolorazione con un anti-pan-citocheratina anticorpo per identificare le cellule epiteliali, e con un anti- superficie anticorpo fibroblasti proteine per fibroblasti) sono simili tra cellule primarie e hTERT immortalizzate, (c), confermando le cellule non mostrano proprietà di trasformazione neoplastica (ad esempio utilizzando saggi di crescita indipendenti ancoraggio), (d) l'estensione di conferma in vitro vita osservata . cellule esprimenti hTERT ma non esprimenti GFP hTERT immortalizzate ovariche fibroblasti normali (INOFs) dovrebbe bypassare senescenza replicativa ma non neoplastically essere trasformato, in più celle INOF dovrebbero mantenere l'espressione della proteina di superficie ma non fibroblasti marcatori epiteliali come citocheratina (Figura 2) .
2. Rivestimento di Cultur TissuePiatti E Con PolyHEMA per non aderente Colture Cellulari
- Per preparare la soluzione polyHEMA, pesare 1,5 g polyHEMA, e posto in una bottiglia sterile. Aggiungere 95 ml di etanolo per biologia molecolare assoluto e 5 ml di acqua coltura cellulare grado distillata. L'idrogel polyHEMA si dissolvono nel contenuto di acqua della soluzione, e l'etanolo sterilizzare la preparazione.
- Mettere la soluzione polyHEMA a bagnomaria a 65 ° C fino a completa dissoluzione. Questo può richiedere fino a 8 ore. Si noti che la soluzione polyHEMA non può essere immagazzinato per lunghi periodi di tempo e quindi devono sempre essere preparato fresco.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: Soluzioni di polyHEMA richiedono lunghi tempi di incubazione a 65 ° C. Regolarmente invertire la soluzione polyHEMA per mescolare. Viscosità osservato sul fondo della bottiglia di vetro indica il polyHEMA non è completamente sciolto e incubazione a 65 ° C è necessaria. - Lavorando all'interno di una cappa a flusso laminare, rivestire piastre di coltura di tessuto con la soluzione polyHEMA. Qualsiasi size del piatto di coltura tissutale, pallone o piastra multipozzetto può essere rivestita con polyHEMA. Volumi consigliati di soluzione polyHEMA richiesti per ogni nave sono riportati nella tabella 2.
- Lasciare i piatti di coltura cellulare per asciugare all'interno della cappa a flusso laminare. Questa operazione potrebbe richiedere 2-3 giorni. Dolce dondolio su una piattaforma oscillante può essere utilizzato per garantire anche il rivestimento di maggiori dimensioni piatti o bottiglie. Se si asciuga troppo velocemente soluzione polyHEMA la superficie potrebbe non essere regolare. Per evitare questo, assicurare il coperchio del piatto / pallone rimane per tutto il processo di essiccazione.
- Applicare un secondo strato di polyHEMA e lasciare asciugare come descritto sopra.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: fori nel rivestimento polyHEMA può verificarsi, in particolare quando le piastre asciugare troppo rapidamente. Doppio rivestimento le piastre con polyHEMA aiuta a coprire lacune o crepe nel rivestimento sono coperti prima dell'uso. Piatti solito prendere 2-3 giorni per ogni mano polyHEMA ad asciugare e quindi deve essere preparato almeno una settimana prima che saranno necessari per la coltura delle cellule. - PolyHEMA piastre rivestite possono essere conservati a temperatura ambiente fino all'utilizzo.
NOTA: 1% agarosio soluzioni, disciolto in PBS 1X e sterilizzare in autoclave, può anche essere utilizzato per rivestire i piatti di coltura di cellule per creare una superficie non aderente a breve termine coltura 3D (meno di una settimana). Rivestimento di agarosio multi-pozzetti crea una superficie concava che promuove la formazione di uno sferoide unico per bene per molte linee cellulari. Tuttavia, per le culture più 3D rivestimento polyHEMA è raccomandato come agarosio rivestimento disintegra spesso dopo periodi più lunghi della cultura.
3. Generazione tridimensionali (3D) Spheroids eterotipica e Re-alimentazione delle Culture 3D
- Recuperare ed espandere colture cellulari INOF ed epiteliali in vitro per prepararsi numero sufficiente di cellule per la creazione di 3D sferoidi eterotipiche. Per le "culture di massa" che in genere semi 2-4x10 6 INOFs per P100 piatto e 0,5-1x10 6 cellule epiteliali per dare un stromale: epiteliale ratio di 4:1. INOF cellule sono coltivate in terreno di crescita INOF (INOF-GM) senza gentamicina o anfotericina B. Se desiderato, fibroblasti può essere pretrattato prima della coltura 3D (ad esempio per l'induzione della senescenza, le cellule possono essere trattate con dosi subletali di perossido di idrogeno ).
- Lavare una piastra asciutta polyHEMA con 5 ml di tampone fosfato salino (PBS) per 5 min. Aspirare il PBS e sostituire con 15 ml INOF-GM.
- Nel frattempo, Tripsinizzare immortalato normali fibroblasti ovariche staccarlo dal piatto di coltura, dopo 3-5 min neutralizzare la tripsina con un uguale volume di cultura media e il pellet per centrifugazione a 450 xg per 5 min.
- Eliminare il surnatante. Creare una cella singola sospensione da parte di risospendere l'agglomerato di cellule in 5 ml INOF-GM, mescolare bene pipettando su e giù o vortex delicatamente. Calcolare la concentrazione cellulare mescolando 10 microlitri di sospensione cellulare e 10 microlitri trypan blu e l'enumerazione utilizzando un emocitometro. Trypan esclusione blu può essere utilizzared per identificare le cellule vive.
- Aggiungere 4x10 6 cellule INOF al mezzo già dispensato nel polyHEMA piastra rivestita. Portare al volume cultura dei media a 20 ml con un volume adeguato di fresco INOF-GM e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. Le cellule cominciano ad aggregarsi in sferoidi multicellulari entro 24 ore. Sferoide formazione può essere monitorata mediante microscopia fase.
Conteggio preciso dei numeri sferoidali in condizioni di coltura di massa è difficile, ma si stima che si ottiene 50-100 sferoidi quando 4x10 6 cellule stromali sono placcati. Dimensioni sferoide in genere varia 80-250 micron. - Ri-alimentare le culture sferoidali ogni 2-3 giorni appoggiando le piastre con un angolo di una pipetta posizionato all'interno della cappa a flusso laminare. Lasciare le sferoidi di stabilirsi. Questo può richiedere fino a 20 min. Rimuovere con cautela il supporto esausti con una pipetta da 5 ml, fino a che solo circa 4 ml restano nel piatto. Fare attenzione a non aspirare il sferoidi. Re-feed con 16 ml fresco INOF-GM e tornare alla incubatrice.
- Il giorno 7, aggiungere alle cellule epiteliali sferoidi fibroblasti creare culture eterotipiche come segue. Preparare sospensioni di cellule ovariche epiteliali (fenotipicamente normale o trasformato) per tripsinizzazione come descritto nella sezione 3,4-3,5. Determinare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro. Lavare una volta in INOF-GM per evitare fattori di crescita vengano riportati dai media di crescita epiteliali.
Nel nostro laboratorio, superficie ovarica normale delle cellule epiteliali (OSEC) le linee sono stati raccolti con il consenso informato del paziente da ovaie di isterectomia totale addominale o isterectomia totale laparoscopica con salpingo-ovariectomia bilaterale. Ovaie sono stati spazzolati con cytobrush sterile per raccogliere l'epitelio. Linee cellulari primarie sono state stabilite e trasdotte con hTERT utilizzando il metodo descritto sopra. Dettagli della cultura OSEC in 2D, 3D e immortalizzazione OSEC può essere trovato in riferimenti 10 e 11. - Per formare sph eterotipicaeroids, in primo luogo ri-alimentazione culture di fibroblasti sferoidi solo. Quindi inoculare colture di fibroblasti sferoidali con 1x10 6 cellule epiteliali in un rapporto di 04:01 fibroblasti alle cellule epiteliali. Cultura le sferoidi eterotipiche in INOF-GM.
- Re-alimentare culture eterotipiche ogni 2-3 giorni per altri 14 giorni.
4. Elaborazione per l'imaging e analisi molecolari
- Numerose tecniche possono essere utilizzate per analizzare gli sferoidi eterotipiche. Per l'imaging, si raccomanda che sferoidi vengono raccolte dal piatto di coltura con una pipetta 25 ml. Pipettando lentamente si minimizzare le probabilità di forze di taglio che perturbano l'architettura dello sferoide. Sferoidi possono essere lavate in PBS e delicatamente pellettizzate per centrifugazione a 100 xg per 10 min; forze centrifughe superiori possono danneggiare gli sferoidi. In alternativa, le culture possono essere trasferiti in una provetta da 50 ml falcon e lasciato depositare, e il mezzo di crescita quindi rimosso.
- Per immunoistochimicachimica, fissano sferoidi con formalina tamponata neutra per 30 min a temperatura ambiente. Pellet le sferoidi e sostituire la formalina con il 70% di etanolo. Processo in paraffina utilizzando protocolli standard utilizzati per i tessuti umani. Sferoidi incluso in paraffina può essere sezionato, e colorati con ematossilina ed eosina sia o specifici marcatori molecolari mediante immunoistochimica standard (Figura 3).
- In alternativa, sferoidi lavati in PBS possono essere fissati in paraformaldeide al 4% (preparato in PBS), incorporato in media temperatura di taglio ottimale ottobre e congelato a scatto per il sezionamento congelati e immunofluorescenza.
- Per le analisi molecolari, gli sferoidi possono essere raccolti, pellettato e lavate due volte in PBS prima di lisi per DNA, RNA o estrazione di proteine.
- Per l'analisi mediante citometria a flusso, sferoidi possono essere lavate in PBS e dissociata dalla tripsina o accutase digestione a 37 ° C. Per effettuare questa operazione, immergere il tubo Falcon contenente i sferoidina bagnomaria per facilitare tripsinizzazione. Completa dissociazione di sferoidi in una sospensione singola cellula può essere promossa la soluzione pipettando su e giù con una punta di pipetta 1 ml. Fare attenzione a non sovra-Tripsinizzare le cellule.
Neutralizzare la reazione con un uguale volume di mezzo di coltura delle cellule e rimuovere macchie passando la sospensione attraverso un filtro a 40-70 micron cella. Cellule pellet, lavare con PBS, enumerare e risospendere il numero desiderato di cellule in tampone FACS. Colorare le cellule in base alle istruzioni del produttore.
5. Risultati rappresentativi
Questo approccio può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni, e per lo studio della biologia ovarico normale così come lo studio di iniziazione cancro ovarico. Un importante vantaggio di questo approccio rispetto culture 3D creati utilizzando commercialmente disponibile gel matrice extracellulare è che i fibroblasti normali ovariche produrre la matrice extracellulare che rende up il nucleo delle sferoidi. Nella nostra esperienza, il materiale di matrice prodotta dai fibroblasti ovarici normali è eterogenea e più simile alla matrice extracellulare delle ovaie di qualsiasi matrice gel disponibile in commercio. Nel nostro laboratorio abbiamo utilizzato le cellule epiteliali che sono state in parte trasformate in vitro utilizzando definiti elementi genetici (ad esempio sovraespressione CMYC) e co-coltura con fibroblasti queste cellule ovariche normali e senescenti per imitare stadio precoce del cancro ovarico in un post-menopausa ovaio. I nostri dati suggeriscono che il microambiente invecchiamento promuove caratteristiche neoplastiche (es. proliferazione) delle cellule epiteliali trasformate parzialmente (Figura 3), mentre un microambiente normale inibisce la progressione neoplastica 8. Il nostro laboratorio e altri hanno anche utilizzato metodi simili per modellare le cellule ovariche epiteliali normali 9, cellule epiteliali, tube di Falloppio graduale modelli di progressione neoplastica
Figura 1. Schema del protocollo per il 3D coltura eterotipica. Beute di coltura dei tessuti sono due volte rivestiti con una soluzione polyHEMA 1% e lasciate asciugare. Plastiche PolyHEMA rivestite vengono lavate con PBS 1x immediatamente prima dell'uso. Immortalato normali fibroblasti ovariche (4x10 6 celle) sono placcati nel pallone con 20 ml di terreno di crescita. La formazione e la crescita Spheroid monitorato più di 7 giorni. A questo punto, colture di fibroblasti sferoidali vengono inoculate con 1x10 6 cellule epiteliali, ed i due tipi di cellule sono co-coltivate per 14 giorni prima di sferoidi multicellulari sono raccolti e trattati per applicazioni a valle (analisi molecolari, immagini, ecc).
Figura 2. Colorazione immunofluorescenza di hTERT </ Em> immortalato fibroblasti ovarici normali. Entrambi i fibroblasti primari ovarici normali (Pr NoFS) e immortalata fibroblasti ovarici normali (INOFs) fibroblasti della proteina espressa specifica (FSP), non esprimono citocheratina-7 (Ck-7) ed esprimono vimentina (VIM) . Marcatori di interesse sono visualizzati in verde, il DNA è macchiato con DAPI e mostrato in blu, citoplasma è di contrasto con il blu di Evan e mostrato in rosso.
Figura 3. Immunoistochimica di cellule stromali ed epiteliali co-coltura. Pannello sinistro, normale fibroblasti monocoltura ovarico sferoide, colorate con ematossilina ed eosina. Normali fibroblasti ovariche coltivate solo in sferoidi forma 3D costituiti da cellule con un affusolato-morfologia e abbondante matrice extracellulare. Pannello di destra: fibroblasti ovarico normale sono stati esposti al perossido di idrogeno per indurre senescenza. Cellule ovariche epiteliali trasformate parzialmente (Iose
Figura 4. Caratteristiche istologiche 3D cellule coltivate riflettono tessuti primari. (A) Eliminare carcinomi ovarici microcella caratteristici strutture cellule chiare, questi sono assenti quando EOC chiare linee di cellule sono coltivate su strutture plastiche simili ma vengono rilevati quando le stesse cellule vengono coltivate come sferoidi 3D ( B). (C) microscopio elettronico a scansione di cellule ovariche epiteliali normali come sferoidi coltivati per 14 giorni. Microvilli superficie sono visibili (frecce). (D) sierose cancro ovarico sferoidi di linee cellulari, nella cultura. (A, B) colorazione ematossilina ed eosina di paraffina sezionata incorporato tessuto tumorale o sferoidi 3D; (C) microscopia elettronica a scansione, (D) microscopia a contrasto di fase. Sferoidi possono essere sferica (cerchio tratteggiato)o di forma irregolare, come nel caso della struttura visto nel lato sinistro dell'immagine.
| Piatto / Dimensioni piastra | Volume di PolyHEMA (essere applicato due volte) | Volume Cultura media finale |
| Piastra da 6 pozzetti | 3 ml | 5-7 ml |
| 12-pozzetti | 1,5 ml | 2 ml |
| 24-pozzetti | 500 pl | 1,5 ml |
| 48-pozzetti | 250 microlitri | 500 pl |
| Piastra a 96 pozzetti | 50 microlitri | 200 pl |
| P100 cultura piatto | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 cultura piatto | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25 pallone | 2-3 ml | 7 ml |
| F75 pallone | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175 pallone | 15 ml | 30-50 ml |
Tabella 2. Volumi consigliati per il rivestimento polyHEMA e coltura 3D.
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Discussion
La biologia di stadio precoce del cancro ovarico epiteliale (EOC) è poco conosciuta. Forse uno dei principali ostacoli in questo campo per molti anni è stata la mancanza di comprensione delle origini tessuto specifiche che la malattia, e del significato del ruolo del microambiente nello sviluppo EOC. Nel corso degli ultimi anni, è diventato chiaro che EOC è una malattia eterogenea con più sottotipi distinti histophathological, probabilmente con differenti origini cellulari per diversi sottotipi. Ad esempio, i dati attuali suggeriscono che EOCS sierose alta qualità può provenire da entrambe le cellule secretorie tube di Falloppio e cellule epiteliali ovarici epiteliali di superficie, almeno una parte delle cellule EOCS endometrioide e chiara si ritiene derivino da endometriosi ovarica (endometrioma), e EOCS mucinosi possono derivare da paraovarian o Paratubal di transizione di tipo epitelio 15,16. Tuttavia, ci sono solo limitati in vitro e <em> modelli in vivo di progressione della malattia di uno di questi istotipi. Nella modellazione vitro eterotipica di EOC per studiare i tumori dello stroma-epiteliali interazioni e il microambiente associato a carcinomi ovarici in via di sviluppo è un settore ancora meno sviluppata della ricerca. Lo stroma tumorale può essere sia una fonte di biomarcatori tumorali nonché un nuovo bersaglio per la terapia. Lo sviluppo e l'utilizzo di modelli di eterotipiche EOC possono quindi essere chiave per identificare nuovi biomarker associati stadio iniziale della malattia che potrebbe essere utilizzato come parte di un programma di screening e diagnosi precoce della malattia, o per l'identificazione di nuovi, druggable bersagli terapeutici per migliorare regimi di trattamento per i pazienti con diagnosi di EOC.
Più fondamentalmente, i modelli che abbiamo descritto può essere utilizzata per ottenere una più profonda comprensione dei cambiamenti sottostanti fenotipiche e molecolari che si verificano durante l'inizio EOC e lo sviluppo precoce della malattia. È ormai chiaro che diversi sottotipi EOC sono distinti profili molecolari, caratteristiche cliniche e la biologia di base. Generando una libreria di cellule precursori EOC e modellare lo sviluppo di ogni sottotipo di tumore, tra cui le influenze microambientali, potrebbe essere possibile acquisire conoscenze nuove per lo sviluppo di istotipi EOC attraverso modelli che riflettano con precisione lo sviluppo della malattia nella condizione umana. Le metodologie che descriviamo può essere applicata a una vasta gamma di studi e applicazioni, compresi lo studio di altri tumori solidi. Abbiamo testato capacità sferoide formazione in oltre 50 linee ovariche diverse cellule normali e trasformate ad oggi, e osservato che la maggior parte delle linee cellulari sono in grado di formare sferoidi quando piastrate a concentrazioni elevate di polyHEMA piastre rivestite. Abbiamo quindi anticipare che i modelli di colture cellulari da altri organi di mammiferi e anche altre specie potrebbero essere coltivate in 3D utilizzando questo approccio.
ve_content "> Questi approcci possono rappresentare un anticipo specificamente per studiare il ruolo del microambiente durante iniziazione tumorale, per esempio negli studi di interazioni di discrete aberrazioni genetiche somatiche in cellule epiteliali tumorali esistenti in concomitanza con specifiche variabili microambientali. Abbiamo dimostrato che modificazioni fenotipiche in cellule stromali possono influenzare il fenotipo delle cellule epiteliali 8. Modificando i tipi di cellule inclusi nel modello, si potrebbe verificare se differenti cellule stromali differenzialmente influenzare la proliferazione delle cellule epiteliali e anche espressione di altri marcatori specifici es. marcatori associati invasione o metastasi. Inoltre, questi modelli può essere utilizzato nello studio della malattia benigna e fisiologia ovarico normale. Per esempio, tali modelli 3D può essere usato in studi di fertilità per valutare il ruolo dello stroma ovarico durante la maturazione degli oociti.Per studiare il contributo della microenvironment allo sviluppo EOC e il ruolo di associate a tumori ovarici fibroblasti in EOCS maligni, questi modelli possono anche essere adattate da cellule ovariche di co-coltura con fibroblasti tumorali isolate da campioni tumorali. Culture più complessi potrebbero essere generati anche introducendo ulteriori tipi di cellule competenti nella struttura heterotypic. Ad esempio, il modello di interazioni cellule stromali ed epiteliali abbiamo sviluppati potrebbe dal integrato con l'introduzione di cellule della granulosa, cellule immunitarie o endoteliale. Un'altra possibilità sarebbe quella di co-coltura di altri tipi di cellule precursori nel modello stroma ovarico, come le cellule epiteliali della tuba e dell'endometrio. È anche possibile modellare addizionali interazioni paracrine che si propone di essere importante durante iniziazione EOC. Per esempio, ormoni steroidei potrebbero essere introdotti nel modello heterotypic, o l'espressione di geni che agiscono paracrini potrebbe essere perturbata esclusivamente nel compartimento stromale el'effetto sulle cellule epiteliali misurata.
La maggior parte dei tumori ovarici sono identificati in un secondo tempo, dopo che la malattia si è diffusa ampiamente in tutto il peritoneo. Tumori ovarici diagnosticati se localizzata alle ovaie (fase 1) può essere efficacemente trattata con la chirurgia e in oltre il 90% dei casi i pazienti sono guariti della loro malattia. E 'chiaro che le strategie di diagnosi precoce dei tumori ovarici potrebbe ridurre significativamente la morbilità del cancro ovarico e la mortalità. Per ottenere una più profonda comprensione delle prime fasi di sviluppo della malattia utilizzando approcci di modellazione organotipiche come quelle qui descritte, si prevede che le nuove opportunità per la diagnosi della malattia in popolazioni a rischio sarà rivelato e infine tradotto nella pratica clinica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata effettuata presso la Keck School of Medicine, University of California, Stati Uniti d'America, e la University College di Londra, Regno Unito. KL è finanziato dal National Institute of Health sovvenzione 5 U19 CA148112-02. BG è stato finanziato da una borsa di studio del progetto dalla carità oncologia ginecologica Eve Appeal (Regno Unito). Parte di questo lavoro svolto in UCLH / UCL è stato in parte il finanziamento da parte del Dipartimento del regime di Salute di ricerca biomedica NIHR finanziamento Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
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References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
