Summary
우리는 구축 방법을 설명
Abstract
상피 난소 암 (EOCs)는 서양 사회에서 부인과 종에서 죽음의 주요 원인입니다. 수술 치료 및 향상된 백금 기반 chemotherapies의 발전에도 불구하고, 이상 40 년의 1,2에 대한 EOC 생존 요금에 약간의 개선이있었습니다. 무대하는 동안 I 종양은 5 년 생존 율이> 85 %, 스테이지 III / IV 질환의 생존 요금은 <40% 있습니다. 종양은 이전보다 치료할 수, 단계 3-5에서 감지 된 경우 따라서, EOC에 대한 사망률의 높은 비율이 크게 감소 될 수 있습니다. 현재 초기 단계의 질병 개발의 분자 유전 및 생물학적으로는 제대로 이해된다. 더 구체적으로, 작은은 종양 개시시 microenvironment의 역할에 대해 잘 알려져 있습니다,하지만 EOCs (예 : 나이와 패리티)에 대한 알려진 위험 요소는 microenvironment이 EOCs의 초기 기원에 중요한 역할을하는 것이 좋습니다. 따라서 입체 heterotypic 모델을 개발정상적인 난소 모두와 초기 단계의 난소 암의. 정상 난소를 들어, 공동 교양 일반 난소 표면 상피 (잃을)와 문화에서 이러한 세포의 수명을 연장하기 위해 인간의 telomerase의 holoenzyme (hTERT)의 촉매 subunit의 retrovrial 도입에 의해 불후의 일반 stromal 섬유 아세포 (INOF) 세포. 난소 상피 세포의 변형, 잃을 셀의 CMYC 종양 유전자의 overexpression, 다시 INOF 세포와 공동 배양의 초기 단계를 모델링합니다. 이 heterotypic 모델은 상피 세포의 변화와 침략에 노화와 노화의 효과를 조사하는 데 사용되었다. 여기 이러한 3 차원 모델의 개발 방법론 단계를 설명 할 수있다;이 방법은 정상 난소와 난소 암 조직의 발전에 해당하지 않습니다, 그리고 stromal 및 상피 세포의 상호 작용이 기본 위치를 다른 조직 유형을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 조직 유지 보수 및 디의 측면sease 개발.
Protocol
그림 1은 아래에 설명 된 워크 플로우의 개요를 보여줍니다.
1. hTERT의 Holoenzyme의 촉매 Subunit의 Overexpression의 정상 난소 섬유 아세포 및 체외 수명의 연장의 분리
- 난소 조직은 정보 환자의 동의 및 기관 검토위원회 (미국 기관 용)의 승인을 수령하실 수 있습니다. 일반 난소 조직은 양국 salpingo - oophorectomy과 총 복부 자궁 적출술 또는 총 복강경 자궁 적출술 후 수령하실 수 있습니다. 본 연구에서는 조직은 병리학 및 세포 배양을위한 검사 했어 난소 기질의 부분에 의해 검토되었다. 약 2-5mm 2의 조직 샘플은 난소 상피 조직을 샘플링의 기회를 줄이기 위해 시도 난소의 중심 지역에서 수확되었습니다.
- (IN 불후의 정상적인 난소 섬유 아세포의 세포 배양 실험실에 새로운 난소 조직을 운송추가 항생제와 antimycotics으로 보충 성장 매체)의. INOF 성장 매체 (INOF-GM)는 구성 : 중간 15% 태아 소 혈청, 2 MM L-글루타민, 50 μg / ML gentamicin 250 NG / ML amphotericin B.와 보충, 1:1 비율로 혼합 199 및 MCDB105
- 바이오 안전성 캐비닛 안에서 일하는 것은 : 느슨하게 5 ML PBS로 샘플을 세척하여 조직에 연결된 상태를 유지하는 상피 세포를 제거합니다. 두 번 더 기음하고 반복합니다.
- 깨끗한 10cm 직경 (P100) 배양 접시에 샘플 플러스 PBS를 전송합니다. 두 번째, 건조 P100 깨끗한 배양 접시에 조직과 장소를 처리하기 위해 멸균 집게를 사용하십시오. 조직 0.5 cm 2 개를 잘라 멸균 메스를 사용합니다. 조각에 별도의 P100 요리 및 추가 컷 <크기가 1mm 2로 조직의 각 조각을 놓으십시오. 20 ML INOF-GM (플러스 항생제와 antimycotics), 그리고 37 품다 ° C, 5 % CO 2를 추가합니다. 위상 현미경을 사용하여 세포의 성장을 모니터링합니다. 셀은 요리의 지혜를 준수 볼 수 있습니다 힌 24 시간.
- 다시 피드 일주일 후에, 흡인하여 비 점착성의 조직을 제거 할 수 있습니다. 이후 일주일에 두 번 문화를 refeed. 셀은 보통 1-3주 안에 식민지를 형성합니다. 이 식민지는 하위 문화 (일단 500 μm 주위에 도달)에 충분히 큰되면, 트립신 - 코팅 복제 디스크를 사용하여 클론을 분리.
세포가 유리 coverslips에 세포 라인의 샘플을 도금하고 fibroblastic 마커 (FSP), 상피 마커 (범 cytokeratin)과 내피 세포 마커에 대한 immuno-형광 염색법을 수행하여 백퍼센트 fibroblastic와 다른 세포 오염 물질 무료입니다 확인 (폰 Willenbrand 팩터 VIII). - 항로 차 정상 난소 섬유 아세포 (NOF) 세포는 hTERT의 retroviral 전달하기 전에 세 P100 요리 일일에 하나의 P100 요리에서 분리합니다. 미리 만든 바이러스 supernatants 공동 transfecting HEK293T 세포에 대한 표준 프로토콜을 (참조 사용하여 구입, 또는 집에서 생산 될 수 있습니다대상 = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Retroviral supernatants은 pBABE-hygro-hTERT 벡터 (Addgene)를 사용하여 생성 할 수 있습니다. 보육에서 NOFs를 제거하고 세포 배양 매체를 대기음. 각 요리에 바이러스 표면에 뜨는 3 ML을 추가합니다 : 한 접시 hTERT-레트로 바이러스를 수신, 2 차 요리 GFP-레트로 바이러스를 받고 세 번째 요리는 바이러스를받지 않습니다. INOF - GM은 8 μg / ML의 최종 농도를 제공 polybrene을 포함하는으로 바이러스 supernatants을 입혀 라. 신선한 매체가 재 피드 세포는 다음 날. 이틀 감염 후,이 복용 20 U / ML로 증가 할 수 있습니다 7 일 후 저용량 (10 U / ML) hygromycin B.로 선택을 시작, 선택은 10~14일 이내에 완료해야합니다. - 그들은 500 μm 주위에 도달하면 hTERT 또는 GFP를 표현 클론는 링 복제에 의해 격리 할 수 있습니다. 셀 라인은 hTERT 및 기본 세포 라인 기능의 유지를 성공적으로 표현을 확인하기 위해 추가 특성을 필요로합니다. 이 포함 : ()남부 얼룩이나 PCR 6,7하여 PCR-엘리사와 telomere의 길이에 의해 telomerase 활동을 확인하고, (b) 중요한 마커 (예 : 상피 세포를 식별 할 수있는 안티 팬 cytokeratin 항체와 immunostaining의 표현을 확인하고있는 반 섬유 아세포에 대한 섬유 아세포의 표면 단백질 항체)는 기본 및 hTERT-불후의 세포 사이의 비슷합니다, (C) 세포를 확인하는 것은 neoplastic 변화의 속성을 (예 : 고정 독립적 인 성장 assays를 사용하여) 표시되지 않습니다, 체외 수명의의 (d)에 확인 확장에서 관찰 . hTERT 그러나 GFP를 표현 세포는 hTERT-표현 불후의 정상적인 난소 섬유 아세포는 (INOFs) replicative의 노화를 우회해야하지만 neoplastically 변환 할 수 없습니다, 또한 INOF 세포는 섬유 아세포 표면 단백질의 표현이지만 cytokeratin로하지 상피 마커를 (그림 2) 유지해야 .
2. 조직 Cultur의 코팅비 점착성의 세포 배양을위한 PolyHEMA있는 전자 요리
- polyHEMA 솔루션을 준비하려면, 멸균 병에 1.5 g의 polyHEMA, 및 장소를 무게. 95 ML 분자 생물학 등급 절대 에탄올, 5 ML 세포 배양 등급 증류수를 추가합니다. polyHEMA의 히드로 겔은 솔루션의 물 함량에 용해되며, 에탄올은 준비를 소독합니다.
- 65 waterbath에 polyHEMA 솔루션을 배치 ° C 완전히 용해 될 때까지. 이 8 시간까지 소요될 수 있습니다. polyHEMA 솔루션은 오랜 기간 동안 저장 될 수 없으며 항상 신선한 준비해야합니다.
문제 해결 : polyHEMA의 솔루션이 65에서 긴 배양 시간이 필요합니다 ° C. 정기적으로 혼합 할 수있는 polyHEMA 솔루션을 반전. 유리 병의 하단에 관찰 점도 polyHEMA가 완전히 용해되지 않는 65에서 추가 부화가 ° C가 필요합니다 나타냅니다. - polyHEMA 솔루션으로 층류 후드, 코트 조직 문화 요리 내부 작업. 모든 siz조직 배양 접시, 병 또는 multiwell 판의 전자는 polyHEMA으로 코팅 할 수 있습니다. 각 선박에 필요한 polyHEMA 솔루션의 추천 권은 표 2에 주어집니다.
- 세포 배양 요리 층류 후드 안쪽에 건조 할 수 있습니다. 이 2-3 일이 소요될 수 있습니다. 흔들 플랫폼에서 젠틀 락은 더 큰 크기의 요리 나 플라스크의도 코팅을 보장하기 위해 사용할 수 있습니다. polyHEMA 솔루션 건조하면 너무 빨리 표면은 매끄러운되지 않을 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 건조 과정 전반에 걸쳐에 남아있는 요리 / 병의 뚜껑을 보장합니다.
- polyHEMA의 두 번째 코트를 적용하고 위에서 설명한 건조 할 수 있습니다.
문제 해결 : polyHEMA 코팅에 구멍이 접시가 너무 빨리 건조 할 때 특히, 문제가 발생할 수 있습니다. polyHEMA와 플레이트는 코팅에 공백이나 균열을 커버하는 데 도움이 두 번 코팅은 사용하기 전에 적용됩니다. 접시는 보통 건조하기 위해 각 polyHEMA 코트에 2-3 일이 걸릴 그래서 그들이 세포 배양에 필요한되기 전에 적어도 일주일 준비해야합니다. - PolyHEMA - 코팅 접시는 사용까지 실온에서 저장 될 수 있습니다.
참고 : 1X PBS에 용해하고 멸균을 위해 autoclaved 1% 아가로 오스 솔루션, 또한 단기 3D 배양을위한 비 점착성의 표면 (이하 일주일)을 만들 외투 세포 배양 요리에 사용할 수 있습니다. 멀티 잘 접시의 아가로 오스 코팅은 많은 세포 라인에 잘 당 단일 회전 타원체의 형성을 촉진 오목 표면을 만듭니다. 그러나, 더 이상 3D 문화에 대한 polyHEMA 코팅은 아가로 오스 코팅은 종종 더 이상 문화 기간 후 분해하는 것이 좋습니다.
3. 3D 문화의 생성 3 차원 (3D) Heterotypic Spheroids하고 다시 먹이
- 복구 및 3D heterotypic spheroids 설립을위한 충분한 세포를 준비하는 체외에서 INOF과 상피 세포의 문화를 확장합니다. 상피 RA : '대량 문화'우리가 일반적으로 시드 2 - 4x10을 P100 요리 당 6 INOFs 및 0.5-1x10 6 상피 세포가 stromal를 제공 할 수4시 1분의 티오. INOF 세포가 원하는 경우, 섬유 아세포 세포 (예 : 노화의 유도에 대한 이전 3D 문화에 pretreated 할 수 있습니다 gentamicin이나 amphotericin B.없이 INOF 성장 매체 (INOF-GM)에서 재배되며, 세포는 과산화수소의 하위 치명적인 투여로 치료 될 수있다 ).
- 5 ML 5 분 동안 (PBS) 생리 인산염 버퍼와 건조 polyHEMA 접시를 씻으십시오. PBS를 대기음 15 ML INOF-GM을 교체하십시오.
- 한편, 3-5 분 5 분에 450 XG에서 원심 분리하여 문화 매체와 펠렛 세포의 동일한 볼륨으로 트립신을 중화 한 후 배양 접시에서 그들을 분리 정상적인 난소 섬유 아세포 세포를 불후의 trypsinize.
- 표면에 뜨는 폐기하십시오. 최대 pipetting 아래로 또는 부드럽게 vortexing하여 잘 혼합, 5 ML INOF-GM의 세포 펠렛을 resuspending하여 단일 셀 정지를 만듭니다. 10 μl 세포 현탁액 및 10 μl trypan 파랑을 혼합하고 hemocytometer를 사용하여 열거하여 세포 농도를 결정합니다. Trypan 파랑 제외 사용할 수 있습니다라이브 셀을 식별 할 D.
- 이미 polyHEMA 코팅 플레이트에 투여 매체에 4x10 6 INOF 세포를 추가합니다. 37 신선한 INOF-GM과 배양의 적절한 볼륨을 사용하는 20 ML에 문화 미디어 볼륨 ° C, 5 % CO 2를 확인하십시오. 셀은 24 시간 이내에 다세포 spheroids에 통합하기 시작합니다. 회전 타원체 형성 위상 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다.
대량 문화 조건에서 회전 타원체 숫자의 정확한 계산은 어렵습니다,하지만 우리는 4x10 6 stromal 세포를 도금 할 때 우리가 50-100 spheroids를 얻을 것으로 예상하고 있습니다. 회전 타원체 크기는 일반적으로 80-250 μm에서 다양합니다. - 층류 흐름 후드에 배치 피펫에 각도 번호판을 쉴하여 모든 2~3일 회전 타원체 문화에게 다시 먹이. spheroids이 정착 할 수 있도록 허용합니다. 이 20 분까지 소요될 수 있습니다. 조심스럽게 만 약 4 ML의 접시에 남아 때까지 5 ML 피펫으로 소진 미디어를 제거합니다. spheroids을 기음 않도록주의보십시오. 16 ML 신선한 이노와 재 공급F-GM과 보육 돌아갑니다.
- 일 7 다음과 같이 heterotypic 문화를 만들어 섬유 아세포 spheroids에 상피 세포를 추가 할 수 있습니다. 섹션 3.4-3.5에 설명 된대로 trypsinization에 의해 난소 상피 세포 (phenotypically 정상 또는 변화)의 정지를 준비합니다. hemocytometer를 사용하여 세포 농도를 결정합니다. 상피 성장 미디어에서 이월 대상에서 성장 요인을 방지하기 위해 한 번 INOF-GM에 씻으십시오.
저희 연구실에서는 정상적인 난소 표면 상피 세포 (OSEC) 라인은 양국 salpingo - oophorectomy과 총 복부 자궁 적출술 또는 총 복강경 자궁 적출술에 의해 제거 난소에서 정보 환자 동의하에 수집되었습니다. 난소는 상피를 수집 할 수있는 살균 cytobrush을 닦았습니다. 기본 셀 라인 설립하고 위에서 설명한 방법을 사용 hTERT와 transduced했다. 2D에서 OSEC 문화에 대한 자세한 내용은, 3D 및 OSEC 불멸화는 참조 10 호와 11 호에서 찾을 수 있습니다. - heterotypic SPH를 형성하려면eroids, 혼자 섬유 아세포 spheroids의 첫 재 피드 문화. 그런 다음 상피 세포에 4시 1분 섬유 아세포의 비율에 1x10 6 상피 세포와 섬유 아세포 회전 타원체 문화의 예방. INOF - GM의 문화 heterotypic spheroids합니다.
- heterotypic 문화에게 추가 14 일 동안 매일 2-3 일이 다시 먹이.
4. 이미징 및 분자 분석을위한 처리
- 여러 가지 방법은 heterotypic spheroids를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이미지를 들면, spheroids는 25 ML의 피펫으로 배양 접시에서 수확하는 것이 좋습니다. 천천히 Pipetting하면 회전 타원체의 건축을 방해 전단 세력의 가능성을 최소화합니다. Spheroids 그 다음 10 분 100 XG에서 부드럽게 원심 분리하여 PBS와 pelleted에서 세척 될 수있다; 높은 원심 힘이 spheroids가 손상 될 수 있습니다. 또한, 문화는 50 ML 팔콘 튜브로 옮겨와 정착 할 수 있으며, 성장 매체는 제거 할 수 있습니다.
- immunohisto에 대한중성과 화학, 수정 spheroids는 실온에서 30 분에 포르말린 버퍼. spheroids와 70 %의 에탄올과 포르말린을 대체 펠릿. 인간 조직에 사용되는 표준 프로토콜을 사용하여 파라핀에 과정입니다. 파라핀 - 임베디드 spheroids는 hematoxylin 및 eosin 또는 표준 immunohistochemistry를 사용하여 특정 분자 마커 (그림 3) 중 하나와 sectioned, 그리고 스테인드 될 수 있습니다.
- 또한, PBS에 세척 spheroids은 (PBS에서 작성) 4 % paraformaldehyde에 고정 냉동 sectioning 및 immunofluorescent 착색을위한 냉동 최적의 절삭 온도 10월 매체와 스냅에 포함 할 수 있습니다.
- 분자 분석은 spheroids는 pelleted, 수확 및 DNA, RNA 나 단백질 추출을위한 세포를 lysing하기 전에 두 번 PBS에 세척 할 수 있습니다.
- 유동 세포 계측법에 의한 분석을 위해, spheroids은 37 ° C.에 PBS와 트립신 또는 accutase의 소화에 의해 dissociated에서 세탁 할 수 있습니다 이 작업을 수행하려면 잠수함 팔콘 튜브는 spheroids에게 i를 포함NA waterbath는 trypsinization을 촉진합니다. 하나의 세포 현탁액에 spheroids의 완전한 분리는 1 ML 피펫 팁을 아래로 솔루션을 pipetting과에 의해 촉진 될 수있다. 세포를 과잉 trypsinize 않도록주의보십시오.
문화 매체의 동일한 볼륨으로 반응을 중화시키고 40-70 μm 셀 스트레이너를 통해 정지를 전달하여 세포 clumps를 제거합니다. 펠렛 세포는 PBS로 씻어 열거하고 FACS 버퍼에서 셀의 원하는 번호를 resuspend. 제조업체의 지시에 따라 세포를 청바지.
5. 대표 결과
이 방법은 응용 프로그램의 광범위한 사용하고, 정상적인 난소 생물학의 연구뿐만 아니라 난소 암 개시의 연구를 위해 할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 세포 외 기질 젤을 사용하여 만든 3D 문화 이상이 접근법의 가장 큰 장점은 정상 난소 섬유 아세포는 u를 만드는 세포 외 기질을 생산 것입니다spheroids의 핵심을 쪽. 우리의 경험에서, 정상적인 난소 섬유 아세포에 의해 생성 된 매트릭스 자료는 이기종하고 더 가깝게 모든 상업적으로 이용 가능한 매트릭스 젤보다 난소의 세포 외 기질이 유사합니다. 저희 연구실에서는 부분적으로 사후 갱년기 난소에서 초기 단계의 난소 암을 모방하는 정상과 늙은 난소 섬유 아세포로 정의 된 유전 요소 (예 : CMYC overexpression)와 공동 배양이 세포를 사용하여 체외에서 변형 된 상피 세포를 활용하고 있습니다. 우리의 데이터는 일반 microenvironment가 neoplastic 진행에게 팔을 억제하는 반면 노화 microenvironment가 부분적으로 변형 상피 세포의 neoplastic 기능 (예 확산) (그림 3)을 촉진하는 것이 좋습니다. 우리 연구실 등은 neoplastic 진행의 정상 난소 상피 세포 9, 난관 상피 세포 단계 - 현명한 모델을 모델링하기 위해 유사한 방법을 사용했습니다
1 그림. 3D heterotypic 배양을위한 프로토콜의 개략적 인 개요. 조직 문화 플라스크에 두번 1 % polyHEMA 솔루션으로 코팅하고 건조 할 수 있습니다. PolyHEMA 코팅 플라스틱이 사용 1X PBS 바로 전에로 세척합니다. 불후의 정상적인 난소 섬유 아세포 세포는 (4x10 6 셀) 20 ML의 성장 매체와 술병으로 도금되어 있습니다. 회전 타원체 형성과 성장은 7 일 동안 모니터링. 이 시점에서 섬유 아세포 회전 타원체 문화는 1x10 6 상피 세포를 주사하며, 다세포 spheroids는 다운 스트림 응용 프로그램 (분자 분석, 영상 등)을 수확하고 처리되기 전에 두 세포 유형은 14 일 동안 공동 배양하고 있습니다.
그림 2. hTERT <의 Immunofluorescence 착색/ em>는 모두 기본 정상적인 난소 섬유 아세포 (PR NOFs). 일반 난소 섬유 아세포를 불후의 및 일반 난소 섬유 아세포 (INOFs) 고속 섬유 아세포 특정 단백질 (FSP), (CK-7) cytokeratin-7을 표현하지 않고 명시 적 vimentin (VIM)를 불후의 . 관심 마커가 녹색으로 표시됩니다, DNA는 DAPI 물들과 파란색으로 표시되며, 세포질은 에반의 파란색과 빨간색으로 표시를 counterstained 있습니다.
그림 3. 공동 교양 stromal과 상피 세포의 Immunohistochemistry. hematoxylin과 eosin로 물들어 왼쪽 패널, 일반 난소 섬유 아세포 회전 타원체의 monoculture. 일반 난소 섬유 아세포 세포는 spindled - 형태와 풍부한 세포 외 기질과 세포로 구성된 3D 형태 spheroids에서 혼자 배양 하였다. 패널 오른쪽 : 정상 난소 섬유 아세포는 노화를 유도하기 위해 과산화수소에 노출되었다. 부분적으로 변형 난소 상피 세포 (졌어
4 그림. 3D 배양 세포의 조직 학적 기능은 기본 조직을 반영합니다. (A) 지우기 세포 난소 carcinomas는 특성 명확한 세포 구조를 표시 명확한 세포 EOC 라인은 플라스틱이지만 유사한 구조를 재배하는 경우, 이러한 결석하는 동일한 셀 (3D spheroids로 재배하는 경우 감지 B). 14 일 동안 spheroids으로 성장 정상 난소 상피 세포의 (C) 스캐닝 전자 현미경. 표면 microvilli은 (화살표) 볼 수 있습니다. (D) 장액 난소 암 세포 라인 spheroids, 문화, 인치 sectioned 파라핀의 (A, B) Hematoxylin 및 eosin 염색은 종양 조직 또는 3D spheroids을 포함, (C) 전자 현미경을 스캔 (D) 위상 대비 현미경. Spheroids은 (점선 원) 구형 할 수 있습니다이미지의 왼쪽에서 본 구조의 경우에서와 같이 모양 또는 불규칙한.
| 요리 / 플레이트 크기 | PolyHEMA의 볼륨 (두 번 적용 예정) | 문화 미디어 최종 볼륨 |
| 6 - 잘 접시 | 3 ML | 5-7 ML |
| 12 잘 판 | 1.5 ML | 2 ML |
| 24 잘 판 | 500 μl | 1.5 ML |
| 48 잘 판 | 250 μl | 500 μl |
| 96 - 웰 플레이트 | 50 μl | 200 μl |
| P100 배양 접시 | 4-5 ML | 20 ML |
| P60 배양 접시 | 2-3 ML | 5-7 ML |
| F25 플라스크 | 2-3 ML | 7 ML |
| F75 플라스크 | 4-5 ML | 20-30 ML |
| F175 플라스크 | 15 ML | 30-50 ML |
표 2. polyHEMA 코팅 및 3D 배양을위한 볼륨을 추천합니다.
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Discussion
초기 단계의 상피 난소 암 (EOC)의 생물은 제대로 이해된다. 아마도 몇 년 동안이 분야의 주요 장애물 중 하나는 조직의 특정 질병의 기원과 EOC 개발 microenvironment의 역할의 중요성에 대한 이해의 부족이었다. 지난 몇 년 동안, EOC는 아마 다른 하위 유형에 대해 서로 다른 세포의 기원에 여러 별개의 histophathological 하위 유형과 이기종 질병입니다 분명이되었습니다 있습니다. 예를 들어, 현재의 데이터는 고급 장액 EOCs은 난관의 분비 상피 세포와 난소 표면 상피 세포 모두에서 발생한 수 있다는 제안, 적어도 endometrioid과 명확한 세포 EOCs의 비율은 난소 endometriosis (endometrioma)에서 발생하는 것으로 생각되고, 그리고 mucinous의 EOCs는 paraovarian 또는 paratubal 전환 형 상피 15,16에서 발생할 수 있습니다. 그러나, 체외와 <거기에 제한되어em>는이 histotypes의. 종양 기질 - 상피 상호 작용과 개발 난소 carcinomas와 관련된 microenvironment를 공부하는 EOC의 체외 heterotypic 모델링에 대한 질병 진행의 생체 모델에 연구를 더 개발 지역입니다. 종양 기질은 종양 생체의 원천뿐만 아니라 치료에 대한 소설 대상 모두이 될 수 있습니다. EOC의 heterotypic 모델의 개발 및 사용 따라서 심사 프로그램의 일환 및 조기 질병 발견으로 사용될 수 초기 단계의 질환과 관련된 소설 생체 식별에 열쇠가 될 수 있습니다, 또는 소설의 식별을 druggable 치료 목표는 개선 EOC 진단을 환자에 대한 치료 regimens.
더 근본적으로, 우리가 설명 한 모델 EOC 개시 및 조기 질병 개발하는 동안 발생하는 기본 phenotypic와 분자 변경 사항의 깊은 이해를 얻을하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은이다 지금은 다른 EOC 하위 유형을 별도로 분자 프로파일, 임상 특성 및 기본 생물학이 있는지 취소합니다. EOC 전구체 세포의 라이브러리를 생성하고 microenvironmental 영향을 포함하여, 각 암 하위 유형의 개발을 모델링함으로써, 정확하게 인간 조건의 질병 발전을 반영하는 모델을 통해 EOC histotypes의 개발에 소설 통찰력을 얻을 수도 있습니다. 우리가 설명하는 방법은 다른 고체 종양 연구 등의 연구 및 응용 프로그램의 광범위한 적용 할 수 있습니다. 우리는 날짜까지 50여 일반 다른과 변화 난소 세포 라인에 회전 타원체 형성 능력을 테스트하고, 셀 라인의 대부분은 polyHEMA - 코팅 접시에 높은 세포 밀도에 도금 할 때 spheroids를 형성 할 수 있다는 관찰했다. 따라서 우리는 다른 포유류의 기관에서 그 세포 배양 모델을 예측하고 다른 종은이 방법을 사용하여 3D로 배양 될 수 있습니다.
ve_content는 ">이 방법은 종양이 개시되는 동안 microenvironment의 역할을 공부를 위해 특별히 사전을 대표 할 수 있습니다 특정 microenvironmental 변수가 동시에 기존의 종양이 상피 세포에서 분리 된 체세포의 유전자 aberrations의 상호 작용 연구에서 예를 들어. 우리는 phenotypic 변화를 보여준 stromal 세포에서 상피 세포의 표현형에게 8에 영향을 줄 수 있습니다. 모델에 포함 된 셀 유형을 변경함으로써, 하나가 다른 stromal 세포가 differentially 상피 세포 증식에 영향을 미칠 수 있으며 공격 또는 전이와 관련된 다른 특정 마커 예 마커의 표현 여부를 조사 수 있습니다. 또한, 이것들은 모델 양성 질환과 정상적인 난소 생리의 연구에서도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 3D 모델은 난 모세포의 성숙 기간 동안 난소 기질의 역할을 평가하는 불임 연구에 사용 될 수 있습니다.미의 기여를 공부EOC 개발 및 악성 EOCs의 난소 암 관련 섬유 아세포의 역할에 croenvironment는 이러한 모델은 종양 표본로부터 격리 섬유 아세포와 공동 배양의 난소 암 세포에 의해 적용 할 수 있습니다. 더 복잡한 문화도 heterotypic 구조로 추가 관련성이 높은 세포 유형을 도입하여 생성 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 개발 stromal과 상피 세포 상호 작용의 모델로 granulosa 세포, 면역 또는 내피 세포의 도입으로 보충 수 있습니다. 또 다른 가능성은 난관과 endometrium의 상피 세포로 난소 기질 모델, 공동 문화 다른 전구체 세포 유형 것입니다. 이 EOC가 시작하는 동안 중요하다고 제안 아르 추가 paracrine 상호 작용을 모델링하는 것도 가능합니다. 예를 들어, 스테로이드 호르몬은 heterotypic 모델로 도입 할 수, 또는 paracrine 역할을 유전자의 표현은 stromal 칸에 독점적으로 어리둥절 할 수 있고상피 세포에 대한 효과는 측정.
질병 복막에 걸쳐 광범위하게 배포 후 난소 암의 대부분은, 늦은 단계에서 식별됩니다. 난소 (1 단계)에 지역화 때 진단 난소 암 효과적으로 수술로 치료 할 수 있으며, 가지 경우 90 %에서 환자들은 질병으로 치료하고 있습니다. 이 난소 암의 초기 감지를위한 전략은 크게 난소 암 병적 상태와 사망률을 줄일 수 있다는 분명하다. 이러한 여기에 설명 된 것과 같은 organotypic 모델링 방법을 사용하여 초기 단계의 질병 개발의 깊은 이해를 확보함으로써, 그것은 위험에 처한 인구의 질병 검출을위한 새로운 기회를 공개하고 궁극적으로 임상 실습로 번역 될 것으로 예상된다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 의학의 중사 님 학교, 캘리포니아, 미국 대학, 대학 대학 런던, 영국에서 수행되었다. KL는 건강 기금 5 U19 CA148112-02의 국립 연구소에 의해 지원을 받고 있습니다. BG는 이브 어필 부인과 종양학 자선 (UK)에서 프로젝트 교부금으로 운용되었다. UCLH / UCL에서 수행이 작업 중 일부는 부분적으로 건강의 NIHR 바이오 메디컬 연구 센터 자금 제도의학과에서 자금을 대고있었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
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References
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