Summary
Biz kurulması için metodolojiler tarif
Abstract
Epitelyal over kanserleri (EOCs) Batı toplumlarında jinekolojik malignite ölüm önde gelen nedenidir. Cerrahi tedaviler ve geliştirilmiş platin bazlı kemoterapi ilerlemelere rağmen, fazla dört yıl 1,2 için EOC sağkalım oranları çok az bir gelişme olmuştur. Sahnelemeye Iken Ben tümörleri 5-yıllık sağkalım oranları>% 85, evre III / IV hastalığı için sağkalım oranları <% 40 vardır. Tümörler daha erken, daha tedavi edilebilir, aşamaları 3-5 tespit edildi Böylece, EOC için mortalite yüksek sıklığında önemli derecede azalma olabilir. Şu anda, erken evre hastalık gelişimi moleküler genetik ve biyolojik temeli tam anlaşılamamıştır. Daha spesifik olarak, küçük bir tümör başlangıcı sırasında mikroçevresinin rolü hakkında bilinir fakat EOCs (örneğin yaş ve parite) için bilinen risk faktörleri mikroçevresindeki EOCs erken oluşumunda önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. Bu nedenle, üç-boyutlu heterotipik modelleri geliştirilmiştirNormal yumurtalık hem de ve erken evre over kanserlerinin. Normal over için, eş-kültürlü, normal over yüzey epitel (kaybetmek) ve kültür bu hücrelerin ömrünü uzatmak için insan telomeraz holoenzyme (hTERT) ve katalitik alt birimi retrovrial transdüksiyon tarafından ölümsüzleştirdi Normal stromal fibroblast (INOF) hücreleri. Over epitel hücre transformasyonu, kaybetmek hücrelerde CMYC onkogen ekspresyonu, yine INOF hücreleri ile birlikte kültüre en erken aşamalarında modellemek için. Bu heterotipik modeller epitel hücrelerinin dönüşümü ve işgali üzerine yaşlanma ve yaşlanma etkilerini araştırmak için kullanıldı. İşte bu üç boyutlu model geliştirme metodolojik adımları açıklamak; Bu metodolojiler, normal yumurtalık ve yumurtalık kanseri dokuların gelişimi özgü değildir ve stromal ve epitelyal hücre etkileşimleri temel nerede diğer doku türleri incelemek için kullanılan olabilir doku bakım ve di yönüolgunun hastalığı gelişme.
Protocol
Şekil 1 aşağıda tarif akışı genel bir bakış gösterilmektedir.
1. HTERT Holoenzyme arasında Katalitik Altbirim aşırı ekspresyonu ile normal Yumurtalık Fibroblastlar ve in vitro ömrü içinde Uzatılması İzolasyonu
- Yumurtalık dokusu bilgilendirilmiş hasta oluru ve Kurumsal İnceleme Kurulu (ABD kurumları için) onayı ile alınabilir. Normal yumurtalık dokuları bilateral salpingo-ooferektomi ile total abdominal histerektomi veya total laparoskopik histerektomi sonrasında toplanabilir. Bu çalışmada, dokular bir patolog ve hücre kültürü için biyopsi ovarian stroma bir kısmı ile incelendi. Yaklaşık 2-5 mm 2 de doku örnekleri over epitel örnekleme şansını azaltmaya çalışmalıdır yumurtalık merkez bölgesinden hasat edildi.
- (IN ölümsüzleştirdi normal yumurtalık fibroblast hücre kültürü laboratuvarında taze yumurtalık dokusu Ulaşımİlave antibiyotik ve antimikotik ile desteklenmiş büyüme ortamı,) OF. INOF büyüme ortamı (INOF-GM) ihtiva eder: Orta% 15 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, 50 ug / ml gentamisin ve 250 ng / ml amfoterisin B ile desteklenmiş, bir 1:1 oranında karıştırılmaktadır 199 ve MCDB105
- Bir biyogüvenlik kabini içinde çalışma: gevşekçe 5 ml PBS ile örnek yıkayarak, doku bağlı kalmasını herhangi bir epitel hücreleri çıkarın. Iki kez daha aspire ve tekrarlayın.
- Temiz bir 10 cm çapında (P100) kültürü çanak içine numune artı PBS aktarın. Bir saniye, kuru P100 temiz kültürü çanak içine doku ve yer işlemek için steril forseps kullanın. Doku 0.5 cm 2 adet kesilmiş steril neşter kullanın. Parçalar halinde ayrı bir P100 çanak ve daha fazla kesim <boyutu 1 mm 2 doku içine, her bir parça yerleştirin. 20 ml INOF-GM (artı antibiyotik ve antimikotik), ve 37 inkübe ° C,% 5 CO 2 ekleyin. Faz mikroskopi kullanılarak hücre büyümesini izleyin. Hücreler çanak yani kalarak görülebilir hin 24 saat.
- Re-besleme bir hafta sonra, aspirasyon herhangi yapışmaz dokusunun çıkartılması. Bundan sonra, haftada iki kez kültür tekrar çember yükleme özelliği. Hücreler genellikle 1-3 hafta içinde, koloniler oluşturacaktır. Bu koloniler altkültür (kez onlar 500 mikron çapında ulaşmak) için yeterince büyük olduğunda, tripsin-kaplamalı klonlama diskler kullanılarak klonlar izole.
Hücreler cam lameller üzerine hücre hattı bir örnek kaplama ve fibroblastik işaretleyici (FSP), epitelyal bir işaretleyici (pan-sitokeratin) ve endotel hücre işaretleyici için immün floresan boyama yaparak% 100 fibroblastik ve diğer hücresel kirletici ücretsizdir onaylayın (Von Willenbrand Faktör VIII). - Passage birincil normal yumurtalık fibroblast (NOF) hücre hTERT arasında retroviral transdüksiyon öncesinde 3 P100 yemekleri bir gün tek bir P100 tabaktan ayırır. Önceden yapılmış viral süpernatanlar, ko-transfekte HEK293T hücreleri için standart protokolleri (bkz. kullanılarak satın, ya da in-house üretilebilirtarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Retroviral süpernatan pBABE-rutubet hTERT vektörü (Addgene) kullanılarak imal edilebilir. Inkübatör NOFs çıkarın ve sonra hücre kültürü ortamında aspire. Her yemeğin viral süpernatant 3 ml ekleyin: bir tabak hTERT-retrovirüs aldığında, 2. çanak GFP-retrovirüs alır ve üçüncü çanak hiçbir virüs alır. INOF-GM 8 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyon vermek için polybrene ihtiva ile viral süpernatanlar kaplaması. Taze aracı madde ile yeniden besleme hücreler ertesi gün. İki gün sonra enfeksiyon, bu doz 20 U / ml 'ye yükselmiştir olabilir yedi gün sonra düşük doz (10 U / ml) higromisin B. seçimi ile başlar; seçim 10-14 gün içinde tam olmalıdır. - Bunlar 500 mikron çapında ulaştığında hTERT veya GFP ifade Klonların halka klonlama ile izole edilebilir. Hücre hatları hTERT ve birincil hücre hattı özelliği tutma başarılı bir şekilde ifade teyit etmek için ilave nitelemeyi gerektirecektir. Bu, şunları içerir: (a)Southern blot veya PCR 6,7 ile, PCR-ELISA ve telomer uzunluğu ile telomeraz aktivitesi onaylamak; (b) kritik belirleyicileri (örneğin epitel hücreleri tanımlamak için bir anti-pan-sitokeratin antikoru ile immünohistokimyasal ifade onaylayan ve bir anti- fibroblastlar için fibroblast yüzey protein antikor) birincil ve hTERT-ölümsüzleştirdi hücreleri arasındaki benzerlik vardır; (c) hücreleri teyit neoplastik dönüşüm özellikleri (örneğin bulunduğu bağımsız büyüme yöntemleri kullanılarak) görünmüyor; vitro ömrü içinde (d) doğrulayan uzantısı gözlenen . hTERT ancak GFP ifade eden hücreler hTERT salgılayan ölümsüzleştirilmiş normal yumurtalık fibroblast (INOFs) replikatif ihtiyarlık baypas gerekir, ancak neoplastically dönüştürülmesi mümkün değildir, ayrıca INOF fibroblast hücreleri yüzey proteininin ekspresyonu fakat sitokeratin olarak değil, epitelyal işaretleyicileri (Şekil 2) sahip olmalıdır .
2. Doku Kültür ve KaplamaSigara yapışık Hücre Kültürü PolyHEMA ile e Yemekleri
- PolyHEMA çözeltisini hazırlamak için, steril bir şişeye 1,5 g polyHEMA ve yerde tartın. 95 ml moleküler biyoloji notu mutlak etanol ve 5 ml hücre kültürü sınıf damıtılmış su ekleyin. PolyHEMA hidrojel çözelti su içeriği içinde çözülür, ve etanol hazırlanması sterilize edecektir.
- 65 bir su banyosunda polyHEMA çözüm yerleştirin ° C tamamen eriyene kadar. Bu 8 saat kadar sürebilir. PolyHEMA çözümü uzun süre saklanabilir edilemez ve bu nedenle her zaman taze olarak hazırlanması gerekir unutmayın.
ARIZA: polyHEMA Çözümleri 65 itibariyle uzun inkübasyon süreleri gerektirir ° C. Düzenli karıştırmak için polyHEMA çözümü ters. Cam şişenin alt kısmında görülen Viskozite polyHEMA tamamen çözülmüş değildir ve 65 ° C'de inkübasyon daha fazla gerekli olduğunu gösterir. - PolyHEMA çözümü ile bir laminer akış kaputu, ceket doku kültürü yemekleri içinde çalışılması. Herhangi Sizdoku kültürü çanağı, flask veya multiwell plaka e polyHEMA ile kaplanabilir. Her bir kap için gereken polyHEMA çözeltisi tavsiye hacimleri Tablo 2 de verilmiştir.
- Hücre kültürü yemekleri laminer akış kaputu içinde kurumasını bekleyin. Bu 2-3 gün sürebilir. Bir sallanan platform üzerinde hafif sallanan büyük boyutlu bir bulaşık ya da şişeler eşit bir kaplama sağlamak için de kullanılabilir. PolyHEMA çözüm kurur ise çok hızlı yüzeyi pürüzsüz olmayabilir. Bunu önlemek için, kurutma işlemi boyunca açık kalır çanak / şişenin kapağını sağlamak.
- PolyHEMA ikinci bir tabaka uygulanır ve yukarıda tarif edildiği gibi kurumaya bırakılır.
ARIZA: polyHEMA kaplama delikler plakaları çok hızlı kurumasını zaman özellikle, oluşabilir. PolyHEMA ile kaplama plakaları içinde boşluklar ya da çatlak kaplamak için yardımcı çift kaplama kullanımdan önce ele alınmaktadır. Plakalar genellikle kuru her polyHEMA kat için 2-3 gün sürebilir ve bu yüzden hücre kültürü için gerekli olacak önce en az bir hafta hazırlanmalıdır. - PolyHEMA kaplı plakalar kullanılana kadar oda sıcaklığında saklanabilir.
NOT: 1X PBS içinde çözüldü ve otoklav ile sterilize% 1 agaroz çözüm, aynı zamanda kısa süreli 3D kültürlenmesi için bir yapışkan olmayan yüzey (en az bir hafta) oluşturmak için ceket hücre kültür tabaklarında için de kullanılabilir. Çok oyuklu plakalar agaroz tabaka bir çok hücre çizgileri için tek başına da küremsi oluşumunu teşvik eden bir konkav yüzey oluşturur. Ancak, uzun süre 3D kültürlerin polyHEMA kaplama agaroz kaplama genellikle uzun kültür dönemlerinden sonra parçalanır olarak tavsiye edilir.
3. 3D Kültürleri Üretme Üç boyutlu (3D) heterotypic sferoidler ve Re-besleme
- Kurtar ve 3D heterotipik sferoidler kurulması için yeterli hücre hazırlamak için in vitro INOF ve epitel hücre kültürlerinde genişletin. Epitel ra: 'kitlesel kültürlerin' biz genellikle tohum 2-4x10 P100 tabak başına 6 INOFs ve 0,5-1x10 6 epitel hücrelerinin stromal vermek için4:1 'lik bölüm. INOF hücreler Eğer istenirse, fibroblast hücreleri (örneğin, ihtiyarlık indüksiyonu için önceki 3D kültür için işlemden geçirilmiş olabilir veya gentamisin amfoterisin B olmadan INOF büyüme ortamı (INOF-GM) yetiştirilen hücre hidrojen peroksit alt öldürücü dozları ile tedavi edilebilir, ).
- 5 mL 5 dakika boyunca (PBS) ile tuzlu su, fosfat tamponlu bir kuru polyHEMA plakayı yıkayın. PBS aspire ve 15 ml INOF-GM ile değiştirin.
- Bu arada, 3-5 dakikada 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ile pelet kültür ortamı ve hücre eşit bir hacim ile nötralize tripsin sonra, kültür çanak bunları ayırmak için, normal yumurtalık fibroblast hücreleri ölümsüzleştirilmiş Trypsinize.
- Süpernatantı atın. Yukarı pipetleme ve aşağı ya da hafifçe vorteks iyice karıştırın, 5 ml INOF-GM hücre pelletini resuspending tek bir hücre süspansiyonu oluşturun. 10 ul hücre süspansiyonu ve 10 ul tripan mavi karıştırma ve bir hemasitometre kullanarak numaralandırma tarafından hücre konsantrasyonunu belirleyin. Tripan mavi dışlama kullanmak olabilircanlı hücreleri belirlemek için d.
- Zaten polyHEMA kaplı plaka akar orta 4x10 6 INOF hücreleri ekleyin. 37 taze INOF-GM ve inkübe uygun bir birim kullanarak 20 ml kültür ortamı hacmi ° C,% 5 CO 2 Makyaj. Hücreler 24 saat içinde multisellüler sferoidler içine agrega başlar. Sfero oluşum aşamasında mikroskobu ile izlenebilir.
Kitle kültürü koşullarında spheroid sayılar Doğru sayım zordur, ama biz 4x10 6 stromal hücreler kaplıdır biz 50-100 sferoidler elde olduğunu tahmin ediyoruz. Sfero boyutları genellikle 80-250 mikron arasında değişir. - Laminer akış kaputu içinde yerleştirilen bir pipet bir açıyla plakaları bekleterek 2-3 günde spheroid kültürlerin yeniden besleyin. Sferoidler yerleşmek için izin verin. Bu 20 dakika kadar sürebilir. Dikkatlice sadece yaklaşık 4 ml çanak kalmayıncaya kadar, 5 ml'lik pipet ile bitkin ortamı çıkarın. Sferoidler aspire etmemeye dikkat edin. 16 ml taze INO ile Re-beslemeF-GM ve inkübatör dönmek.
- Günde 7 günü, şöyle heterotipik kültürleri oluşturmak için fibroblast sferoidler epitelial hücreleri ekleyin. Bölümünde 3,4-3,5 açıklandığı gibi tripsinizasyonla tarafından over epitel hücreleri (fenotipik olarak normal veya dönüştürülmüş) süspansiyonları hazırlayın. Hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. Epitelyal büyüme medya üzerinde yürütülen herhangi bir büyüme faktörleri önlemek amacıyla bir kez INOF-GM yıkayın.
Laboratuvarımızda, normal over yüzey epitel hücre (OSEC) hatları bilateral salpingo-ooferektomi ile total abdominal histerektomi veya total laparoskopik histerektomi tarafından kaldırıldı yumurtalıklardan bilgilendirilmiş hasta oluru ile toplanmıştır. Yumurtalıklar epitel toplamak için steril bir cytobrush ile fırçalanmış edildi. Birincil hücre hatları belirlenmiş ve yukarıda anlatılan yaklaşım kullanılarak hTERT ile transdük edildi. 2D OSEC kültür Detaylar, 3D ve OSEC ölümsüzleşme başvuruları 10 ve 11 bulunabilir. - Heterotipik sph oluşturmak içineroids, yalnız fibroblast sferoidlerin ilk yeniden-besleme kültürler. Sonra, epitelyal hücreler 4:1 fibroblastlar oranında 1x10 6 epitel hücreleri ile fibroblast küremsi kültürleri inoküle. INOF-GM Kültür heterotipik sferoidler.
- Heterotipik kültürleri ilave 14 gün boyunca her 2-3 günde yeniden besleyin.
4. Görüntüleme ve Moleküler Analizleri İşleme
- Pek çok farklı teknikler heterotipik sferoidler analiz etmek için de kullanılabilir. Görüntüleme için, sferoidler 25 ml'lik bir pipet ile kültür çanak hasat edilmesi tavsiye edilir. Yavaş Pipetleme spheroid mimarisini bozan kesme kuvvetlerinin şansını en aza indirecektir. Sferoidler sonra, 10 dakika boyunca 100 x g santrifüj ile yavaşça PBS ile pelet haline yıkanabilir, daha yüksek santrifüj kuvvetleri sferoidler zarar verebilir. Alternatif olarak, kültürler bir 50 ml tüp şahin aktarılmış ve çökelmeye bırakılmıştır, ve büyüme aracı maddesi daha sonra çıkarılabilir.
- Immunhisto içinnötr ile kimya, düzeltmek sferoidler oda sıcaklığında 30 dakika için tamponlu formalin. Sferoidler ve% 70 etanol ile formalin değiştirin Pelet. Insan dokuları için kullanılan standart protokoller kullanılarak parafin içine Süreci. Parafin-gömülü sferoidler hematoksilen ve eosin veya standart immünohistokimya kullanarak belirli moleküler belirteçlerin (Şekil 3) ile ya kesitli ve lekeli olabilir.
- Alternatif olarak, PBS ile yıkanır sferoidler, (PBS içinde hazırlanmış)% 4 paraformaldehid sabit dondurulmuş kesit ve immünofloresan boyama için dondurulmuş Optimal Kesme Sıcaklık Ekim orta ve ek gömülü olabilir.
- Moleküler analizler için sferoidler pelet, hasat ve DNA, RNA ve protein ekstraksiyonu için hücrelerini parçalayan önce iki kez PBS içinde yıkanabilir.
- Flow sitometri ile analiz için, sferoidler 37 ° C'de PBS ve tripsin veya accutase sindirim disosiye yıkanabilir Bunu yapmak için, batığın Falcon tüp sferoidler i içerenna su banyosunda tripsinizasyonla kolaylaştırmak için. Tek bir hücre süspansiyonu haline sferoidlerin Komple dissosiasyon bir 1 ml pipet ile aşağı yukarı pipetleme çözüm ve teşvik edilebilir. Hücreler aşırı Trypsinize vermemeye özen.
Kültür ortamının bir eşit hacmi ile reaksiyon nötralize etmek ve bir 40-70 mikron hücre süzgecinden süspansiyon geçerek hücre kümeleri çıkarın. Pelet hücreleri, PBS ile yıkayın numaralandırmak ve FACS tamponu içinde hücre istenilen sayıda tekrar süspansiyon. Üreticinin talimatlarına göre hücre Leke.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Bu yaklaşım, çok geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılır, ve normal yumurtalık biyoloji çalışma hem de yumurtalık kanseri inisiyasyon çalışma için edilebilir. Piyasada bulunan ekstrasellüler matriks jel kullanılarak oluşturulan 3D kültürler üzerinde bu yaklaşımın önemli bir avantajı, normal yumurtalık fibroblastlar u yapar ekstrasellüler matriks üretmek olduğunusferoidlerin çekirdek s. Bizim tecrübelerimize göre, normal yumurtalık fibroblastlar tarafından üretilen matris malzemesi heterojen olup, daha yakından herhangi bir ticari matriks jeli daha overin ekstrasellüler matriks benzer. Laboratuarımızda kısmen bir post-menopozal yumurtalık erken evre over kanseri taklit normal ve ihtiyarlık over fibroblast ile tanımlanmış genetik elementlerin (örneğin CMYC ekspresyonu) ve co-kültür bu hücreleri kullanarak in vitro dönüştürülmüştür epitel hücrelerinde kullanılan var. Bizim veri normal mikroçevrede neoplastik ilerlemesi 8 inhibe ise yaşlanma mikroçevrede, kısmen dönüştürülmüş epitel hücrelerinin neoplastik özellikler (örneğin çoğalması) (Şekil 3) teşvik öneririz. Bizim laboratuar ve diğerleri de neoplastik ilerlemesinin normal yumurtalık epitel hücreleri 9, fallop tüpü epitel hücreleri, adım adım modelleri modellemek için benzer yaklaşımlar kullanmışlardır
Şekil 1. 3D heterotipik kültür için protokol şematik gösterimi. Doku kültürü şişeleri iki defa% 1 lik polyHEMA çözeltisi ile kaplanır ve kurumaya bırakılır. PolyHEMA kaplı plastik kullanmak için 1 x PBS hemen önce ile yıkanır. Ölümsüzleştirdi normal yumurtalık fibroblast hücreleri (4x10 6 hücre) 20 ml büyüme ortamı ile balonun içine kaplanır. Sfero oluşumu ve büyümesi 7 gün boyunca izlenir. Bu noktada, fibroblast spheroid kültürleri 1x10 6 epitel hücreleri ile inoküle edilir ve çok hücreli sferoidler downstream uygulamalar (moleküler analizleri, görüntüleme, vb) için hasat ve işleme koyulmadan önce iki hücre tipi 14 gün boyunca ortak kültüre.
Şekil 2. HTERT <immünofloresan boyaması/ Em> Hem birincil normal yumurtalık fibroblastlar (Pr NOFs). Normal yumurtalık fibroblastlar ölümsüzleştirdi ve normal over fibroblastlar (INOFs) ekspres fibroblast belirli bir proteinin (FSP), (Ck-7) sitokeratin-7 ifade etmezler ve ekspres vimentin (VIM) ölümsüzleştirdi . Ilgi Markerler yeşil gösterilir, DNA DAPI ile boyanarak mavi renkte gösterilir, sitoplazma Evan mavi ve kırmızı renkte gösterilir ile zıt edilir.
Şekil 3,. Co-kültürlü stromal ve epitelyal hücrelerin İmmünohistokimya. Hematoksilen ve eosin ile boyanarak Sol panel, normal yumurtalık fibroblast spheroid monokültür,. Normal yumurtalık fibroblast hücreleri iğsi-morfolojisi ve bol ekstrasellüler matriks ile hücrelerden oluşan 3D şeklinde sferoidler yalnız kültüre. Paneli Sağ: normal yumurtalık fibroblastlar yaşlılığında ikna etmek için hidrojen peroksit maruz bırakıldı. Kısmen dönüştürülmüş over epitel hücreleri (kaybettin
Şekil 4. 3D kültür hücrelerinin histolojik bulguların primer dokuları yansıtmaktadır. (A) berrak hücreli over karsinomları karakteristik berrak hücreli yapıları görüntülemek berrak hücreli EOC hatları plastik ama benzer yapılar üzerinde yetiştirilen zaman, bu bulunmadığına aynı hücrelere (3D sferoidler olarak yetiştirilen zaman tespit edilir B). 14 gün için sferoidler olarak yetiştirilen, normal yumurtalık epitel hücreleri (C) tarama elektron mikrografı. Yüzey mikrovilluslar (oklar) görülebilir. (D) Seröz over kanseri hücre hattı sferoidler, kültür. Kesitli parafin (A, B) Hematoksilen ve eozin boyama tümör dokusu veya 3D sferoidler gömülü; (C) taramalı elektron mikroskobu; (D) faz kontrast mikroskobu. Sferoidler (kesikli daire) küresel olabilirgörüntünün sol tarafında görülen yapının durumunda olduğu gibi şeklinde veya düzensiz.
| Bulaşık / Levha Boyutu | PolyHEMA hacmi (iki defa uygulanacaktır) | Kültür Medya Sonu Hacmi |
| 6 plaka | 3 ml | 5-7 ml |
| 12-plaka | 1.5 ml'lik | 2 ml |
| 24-kuyulu plakalı | 500 ul | 1.5 ml'lik |
| 48-plaka | 250 ul | 500 ul |
| 96-kuyulu plakalı | 50 ul | 200 ul |
| P100 kültür çanak | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 kültür çanak | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25 şişeyi | 2-3 ml | 7 ml |
| F75 şişeyi | 4-5 ml | 20-30 mL |
| F175 şişeyi | 15 ml | 30-50 ml |
Tablo 2. PolyHEMA kaplama ve 3D yetiştiricilik için hacimleri önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erken evre epitelyal over kanseri (EOC) biyolojisi tam anlaşılamamıştır. Belki de uzun yıllar bu alanda başlıca engellerden biri doku spesifik hastalığın kökeni ve EOC geliştirme mikroçevresinin rolünün önemi ve anlayış eksikliği olmuştur. Son birkaç yılda, EOC muhtemelen farklı alt tipi için farklı hücresel kökeni ile birden çok farklı histophathological alttiplere ile heterojen bir hastalık olduğu açıktır haline gelmiştir. Örneğin, mevcut veri yüksek dereceli seröz EOCs fallop tüpü salgı epitel hücreleri ve over yüzey epitel hücreleri hem de kaynaklı olabilir öneririz; en az endometrioid ve berrak hücreli EOCs bir oranda endometriyozis (endometrioma) kaynaklandığı düşünülmektedir ve müsinöz EOCs paraovaryan veya paratubal geçiş tipi epitel 15,16 doğabilecek. Ancak, sadece in vitro ve <orada sınırlı kalmıştırem> bu histotypes herhangi. tümör stroma-epitelyal etkileşimler ve gelişmekte over kanserleri ile ilişkili mikroçevrede çalışma EOC in vitro heterotipik modellemede hastalık ilerleyişinin vivo modellerde bir araştırma daha az gelişmiş bir alandır. Tümör stroma tümör biyolojik bir kaynak yanı sıra tedavi için yeni bir hedef hem de olasıdır. EOC'nin heterotipik modellerinin geliştirilmesi ve kullanımı bu nedenle tarama programının bir parçası ve erken hastalık tespit olarak kullanılan olabilir erken evre hastalık ile ilişkili yeni biyolojik belirlenmesi için anahtar olabilir; veya romanın tanımlanması için, druggable tedavi hedefleri geliştirmek için EOC tanısı hastalar için tedavi rejimleri.
Daha da önemlisi, biz tanımladığım modellerin EOC başlatılması ve erken hastalık gelişimi sırasında meydana yatan fenotipik ve moleküler değişikliklerin daha derin bir anlayış kazanmak için kullanılabilir. It is Şimdi farklı EOC alt farklı moleküler profilleri, klinik özellikleri ve temel biyoloji olduğunu temizleyin. EOC öncü hücreleri bir kitaplık oluşturma ve microenvironmental etkiler dahil olmak üzere, her bir alt tipin kanser gelişimi modelleme ile, doğru bir şekilde insan durum hastalığın oluşmasını yansıtmak modelleri ile EOC histotypes gelişimini içine yeni bilgiler elde etmek için mümkün olabilir. Bizim tarif metodolojiler diğer katı tümörlerin çalışma içeren çalışmaları ve uygulamaları, geniş bir aralığı için uygulanabilir. Biz bugüne kadar elli Normal farklı ve transforme yumurtalık hücresi hatlarında spheroid oluşumu yeteneğini test ve hücre hatları büyük çoğunluğu polyHEMA kaplı plakalar üzerinde yüksek hücre yoğunluğunda kaplama yaparken sferoidler oluşturmak mümkün olduğunu gözlemledik. Bu nedenle diğer memeli organlarına gelen bu hücre kültür modelleri tahmin ve aynı zamanda diğer türlerin de bu yaklaşımı kullanarak 3D kültüre olabilir.
ve_content "> Bu yaklaşımlar tümör başlangıcı sırasında mikroçevresinin rolünü incelemek için özel bir avans temsil edebilir, belirli microenvironmental değişkenler ile eş zamanlı olarak mevcut tümör epitel hücrelerinde ayrık somatik genetik bozuklukların etkileşimlerin çalışmalarda örneğin. Biz fenotipik değişiklikler göstermiştir stromal hücrelerde epitelyal hücre fenotipi 8 etkileyebilir. modele dahil hücre tipleri değiştirerek, bir farklı stromal hücrelerinin ayirt epitel hücre çoğalmasını etkileyen ve aynı zamanda invazyon veya metastaz ile ilişkili diğer spesifik belirteçler gibi belirteçlerin ifadesi olmadığını araştırmak olabilir. Ayrıca, bu modellerinde iyi huylu hastalıklar ve normal yumurtalık fizyolojisi çalışmada da kullanılabilir. Örneğin, bu tür 3D modellerini oosit olgunlaşma sırasında yumurtalık stroma rolünü değerlendirmek için doğurganlık çalışmalarda kullanılabilir.Mil katkısı eğitim içinEOC geliştirme ve malign EOCs yumurtalık kanseri ile ilişkili fibroblastların rolü croenvironment, bu modeller ayrıca, tümör örneklerden izole edilen fibroblast ile ortak kültür yumurtalık kanseri hücreleri tarafından adapte edilebilir. Daha karmaşık kültürleri ayrıca heterotipik yapıya ek, uygun hücre tiplerinde getirerek elde edilebilir. Örneğin, biz geliştirdik stromal ve epitelyal hücre etkileşimleri modeline göre granüloza hücreleri, bağışıklık veya endotelyal hücrelerin tanıtımı ile desteklenmiş olabilir. Diğer bir olasılık, bu tür fallop tüpü ve endometriyum epitel hücreleri gibi yumurtalık stroma modeli, eş-kültür diğer öncü hücre tipleri olacaktır. Bu EOC inisiyasyon sırasında önemli olması önerilmektedir ek parakrin etkileşimleri modellemek için de mümkündür. Örneğin, steroid hormonlar heterotipik modeli ortaya olabilir; veya parakrin hareket eden genlerin ekspresyonunda stromal bölmesine sadece tedirgin olabilir veepitel hücreleri üzerindeki etkisi ölçülür.
Hastalığın periton genelinde yaygın dissemine sonra over kanserlerinin çoğunluğu, geç bir aşamada tespit edilir. Yumurtalıkların (Aşama 1) lokalize iken teşhis Over kanserleri etkili cerrahi ile tedavi edilebilir ve vakaların% 90 üzerinde hasta hastalık tedavi edilir. Bu yumurtalık kanserlerinin erken tespiti için stratejileri önemli over kanseri morbidite ve mortaliteyi azaltabileceğini açıktır. Böyle burada açıklandığı gibi organotipik modelleme yaklaşımları kullanarak erken evre hastalığı gelişimi daha derin bir anlayış kazanarak, bu risk popülasyonlarında hastalık tespiti için yeni fırsatlar ortaya koydu ve sonuçta klinik uygulamalara dönüştürülebileceği öngörülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma Tıp Keck School, California, USA Üniversitesi ve University College London, İngiltere yapıldı. KL Sağlık hibe 5 U19 CA148112-02 Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edilmektedir. BG Eve Temyiz jinekolojik onkoloji sadaka (İngiltere) bir proje hibe ile finanse edildi. UCLH / UCL'de yürütülen çalışmaların bir kısmı kısmen Sağlık NIHR Biyomedikal Araştırma Merkezi finansman planının Bölümü fon oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
|||
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
