Summary
एक orthotopic मूत्राशय ट्यूमर मॉडल की स्थापना intravesically दिया सरना निगरानी और अल्ट्रासाउंड और bioluminescent इमेजिंग के द्वारा ट्यूमर के विकास के अर्बुदरोधी प्रभाव का मूल्यांकन.
Abstract
हम छोटे सक्रिय intravesically दिया शाही सेना (सरना) के साथ एक orthotopic xenograft माउस मूत्राशय ट्यूमर मॉडल में मूत्राशय कैंसर के इलाज के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करते हैं. माउस मॉडल साँस सामान्य संवेदनाहारी के तहत मूत्रमार्ग कैथीटेराइजेशन के द्वारा स्थापित है. रासायनिक जला तो मूत्राशय mucosa intravesical चांदी नाइट्रेट समाधान का उपयोग करने के लिए मूत्राशय ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन परत को बाधित करने के लिए शुरू की है और कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए अनुमति देता है. बाँझ पानी, मानव मूत्राशय कैंसर के यू-7-luc2 - GFP कोशिकाओं के साथ कई washes के बाद कैथेटर के माध्यम से मूत्राशय में डाले 2 घंटे के लिए ध्यान केन्द्रित करना. मूत्राशय ट्यूमर के बाद विकास की पुष्टि की है और निगरानी में vivo में मूत्राशय अल्ट्रासाउंड और bioluminescent इमेजिंग द्वारा. ट्यूमर तो से सरना लिपिड नैनोकणों (LNPs) में तैयार कर रहे हैं intravesically इलाज. ट्यूमर के विकास अल्ट्रासाउंड और bioluminescence के साथ नजर रखी है. इस प्रक्रिया के सभी चरणों के साथ वीडियो में प्रदर्शन कर रहे हैं.
Protocol
पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं संस्थागत पशु देखभाल और कैलिफोर्निया, सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय में उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. सेल तैयार
- मानव मूत्राशय कैंसर कोशिका लाइन कू-7-luc2 - GFP (कैलिपर लाइफ साइंसेज, Hopkinton, एमए) RPMI 1640 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 50 gentamicin / μg एमएल के साथ पूरक मीडिया में उगाया जाता है.
- संस्कृतियों 37 में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस, 5% मीडिया के साथ सीओ 2 हर दो तीन दिन में परिवर्तन.
- कोशिकाओं trypsin पाचन द्वारा काटा गया और एक hemocytometer गिनती का उपयोग. 2 एक्स 10 50 μl में 6 कोशिकाओं की एक एकल कोशिका निलंबन फॉस्फेट में तैयार किया गया था खारा बफर और बर्फ पर रखा.
2. Orthotopic मूत्राशय ट्यूमर मॉडल
- महिला नग्न (/ परमाणु परमाणु) 8-10 सप्ताह पुराने चूहों (Simonsen प्रयोगशाला, Gilory, सीए) का इस्तेमाल किया गया.
- एक हीटिंग पैड पर एक बाँझ कपड़ा प्लेस के लिए एक सेवाएक शल्य मंच. बाँझ चिकनाई जेली, ख़ंजर सुइयों, चांदी नाइट्रेट समाधान, और बाँझ पानी के साथ 24 गेज कैथेटर तैयार हैं.
- सामान्य संवेदनाहारी साँस (शामिल करने के लिए 3%, रखरखाव के लिए 1-2%) isoflurane और nosecone के माध्यम से बनाए रखा के साथ चूहों में प्रेरित है. बाँझ नेत्र मरहम जानवर की आँखों के लिए लागू किया जाता है, और एक गर्मी पैड शरीर की गर्मी को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- लापरवाह स्थिति में माउस रखें.
- धीरे स्थिरीकरण के लिए संदंश के साथ पशु योनी समझ.
- सुई हटा नुकीला हथियार के साथ एक 24 गेज नसों में कैथेटर का प्रयोग, माउस मूत्रमार्ग catheterized है. पर्याप्त स्नेहन इस्तेमाल किया जाना चाहिए. माउस लापरवाह, मूत्रमार्ग तुरंत vulvar परतों और योनि के लिए पूर्वकाल में पीछे स्थित है. एक 45 डिग्री के कोण शुरू में ले लिया है क्रम में मूत्रमार्ग cannulate के लिए और जघन हड्डी के नीचे से गुजारें. एक और अधिक उथले कोण तो मूत्राशय में मूत्रमार्ग के माध्यम से पारित करने के लिए लिया जाता है. कोमल श्रोणि दबावसीधा मूत्रमार्ग अक्सर मदद कर सकते हैं सुनिश्चित करें. देखभाल करने के लिए प्रतिरोध के खिलाफ भी मुश्किल जोर दे, जैसा कि इस मूत्रमार्ग या मूत्राशय वेध करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. कैथेटर के भीतर देखा मूत्र मूत्राशय लुमेन भीतर अपने स्थान की पुष्टि है.
- मूत्र कैथेटर और मूत्राशय ख़ंजर सुई का उपयोग लुमेन से महाप्राण (व्यंजन). ख़ंजर सुई बाद के सभी आकांक्षाओं और इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है, जगह में कैथेटर छोड़ने. यह सही संस्करणों के कैथेटर के भीतर मृत अंतरिक्ष को नष्ट करने के द्वारा इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है, और यह दोहराया catheterizations अनावश्यक बनाता है.
- को मूत्राशय urothelium की ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन परत ख़राब, 0.5 एम चांदी नाइट्रेट की 10 μL इंजेक्शन और 10 सेकंड के लिए ध्यान केन्द्रित की अनुमति दी. यह शेष मूत्र के साथ एक सफेद तलछट फार्म का हो सकता है.
- महाप्राण (व्यंजन) और वेग और मूत्राशय एक ख़ंजर सुई का उपयोग करते हुए सामग्री त्यागें.
- 100 μL बाँझ पानी इंजेक्शन द्वारा मूत्राशय धो लें. महाप्राण (व्यंजन) और पानी त्यागें. Repeबाँझ पानी से धोने पर 4 washes के एक कुल के लिए 3 बार.
- मूत्रमार्ग कुहर के चारों ओर एक 4-0 रेशम टाई कैथेटर को हटाने के लिए तैयारी में मूत्रमार्ग रोक देना रखें.
- इंजेक्षन पहले 50 ख़ंजर सुई का उपयोग μL में 2 x 10 6 कू-7-luc2 - GFP कोशिकाओं को तैयार है.
- इसके साथ ही कैथेटर और ख़ंजर सुई को हटाने, रेशम टाई द्वारा occluded मूत्रमार्ग जा.
- माउस सामान्य संवेदनाहारी के तहत 2 घंटे के लिए रखा जाएगा, रेशम टाई से पहले हटा दिया है और पशु जागा है.
3. अल्ट्रासाउंड
- सामान्य संवेदनाहारी में वाष्पीकृत isoflurane और नाक शंकु के माध्यम से बनाए रखा के साथ प्रेरित है.
- Vivo में एक VisualSonics Vevo 770 माइक्रो उच्च संकल्प इमेजिंग प्रणाली (VisualSonics इंक, टोरंटो, ओंटारियो, कनाडा) RMV-704 40 मेगाहर्टज जांच के साथ इस्तेमाल किया गया था.
- अल्ट्रासाउंड मंच पर लापरवाह स्थिति में माउस रखें.
- पशु पिछले पैरों सुरक्षितटेप के साथ अल्ट्रासाउंड जांच के हेरफेर के दौरान अतिरिक्त आंदोलन से बचने के लिए.
- माउस श्रोणि अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें.
- माउस श्रोणि पर कम RMV-704 (40 मेगाहर्ट्ज) अल्ट्रासाउंड जांच के लिए अनुप्रस्थ या अनुदैर्ध्य छवियों को प्राप्त कर सकते हैं.
- यदि ट्यूमर पाया जाता है, छवियों ट्यूमर आयामों की माप के लिए बचाया जा सकता है.
4. Bioluminescent इमेजिंग
- 200 (150 मिलीग्राम / किग्रा) μL luciferin सब्सट्रेट की intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं.
- Isoflurane वाष्पीकृत के साथ सामान्य संवेदनाहारी प्रेरित और नाक शंकु के माध्यम से बनाए रखने के.
- Bioluminescence imager के भीतर ढालुआं स्थिति में चूहों रखें.
- Luciferin इंजेक्शन के बाद पांच मिनट, प्रति सेकंड फोटॉनों में पशु से bioluminescence उपाय.
5. सरना तैयारी
- 50-100 μmol के पैमाने पर oligonucleotides के शाही सेना synthesize.
- मैं पूरक एकल असहाय oligonucleotides के पानी रखनासहेजे द्वैध saRNAs.
- [1,3] (DLinKC2-डीएमए) dioxolane, disteroylphosphatidyl choline, कोलेस्ट्रॉल, और खूंटी DMG लिपिड nanoparticle (LNP) सरना ionizable लिपिड 1,2 dilinoleyl-4-(- dimethylaminoethyl 2) के साथ तैयार कर रहे हैं एक सहज पुटिका गठन तैयार प्रक्रिया का उपयोग कर के रूप में पहले वर्णित 1.
6. तैयार सरना intravesical प्रशासन
- Orthotopic मूत्राशय ट्यूमर मॉडल की स्थापना के बाद, चूहों intravesical छोटे सक्रिय शाही सेना (सरना) लिपिड नैनोकणों (LNPs) (तालिका 1) में तैयार के साथ व्यवहार कर रहे हैं.
- सामान्य संवेदनाहारी और स्थापित isoflurane वाष्पीकृत के साथ बनाए रखा, और बाँझ नेत्र स्नेहक लागू किया जाता है.
- लापरवाह स्थिति में पशु रखें.
- मूत्रमार्ग के रूप में पहले वर्णित कैथीटेराइजेशन प्रदर्शन करते हैं.
- मूत्रमार्ग और कैथेटर के चारों ओर एक 4-0 रेशम टाई रखें.
- सभी मूत्र कैथेटर से महाप्राण (व्यंजन) औरमूत्राशय एक खाली सिरिंज और ख़ंजर सुई का उपयोग करते हुए.
- LNP - सरना intravesically से इंजेक्षन 50 μL (3 मिलीग्राम / किग्रा) के कुल खुराक के लिए. इसके साथ ही कैथेटर और ख़ंजर सुई को हटाने, रेशम टाई द्वारा occluded मूत्रमार्ग जा.
- 2 घंटे के लिए occluded मूत्रमार्ग के साथ anesthetized माउस रहेगा.
- 4 दिवस पर intravesical LNP सरना के साथ इलाज ट्यूमर आरोपण के बाद शुरू हो गया था. चूहे क्रमानुसार इलाज को हर 3 दिन, 14 उपचार के एक कुल के लिए.
7. प्रतिनिधि परिणाम
मूत्राशय के यू-7-luc2 - GFP कोशिकाओं से stemming ट्यूमर luciferase bioluminescent इमेजिंग (चित्र 1 ए और सी) और मूत्राशय अल्ट्रासाउंड (चित्रा 1 बी और डी) द्वारा नजर रखी जा सकती है. ट्यूमर अक्सर सेल टीका के बाद 3-5 दिनों के भीतर detectable हैं. हम चूहों के 90% से अधिक में सफल मूत्राशय ट्यूमर आरोपण पाया. Intravesical dsRNA साथ उपचार के रूप में ensues, ट्यूमर की प्रगति वाई नजर रखी जा सकतीइन रूपरेखा वें. पशु का बलिदान करने के बाद, ट्यूमर के विकास को भी GFP प्रतिदीप्ति का उपयोग कर पुष्टि की जा सकता है. सामान्य में, मतलब, bioluminescence मूत्राशय ट्यूमर के लिए मतलब अल्ट्रासाउंड आयामों के साथ सहसंबद्ध है, के रूप में आंकड़े और 1C 1D में नेत्रहीन देखा. हालांकि, के बाद पशुओं का बलिदान किया गया और ट्यूमर GFP द्वारा पुष्टि की गई, हमने पाया कि bioluminescence से अल्ट्रासाउंड मापन किया व्यवहार्य ट्यूमर की उपस्थिति के साथ और अधिक निकटता सहसंबद्ध. सरना (के रूप में नियंत्रित करने के लिए विरोध किया है) के साथ इलाज चूहों के बीच विशेष रूप से स्पष्ट किया गया था क्योंकि इलाज चूहों में अवशिष्ट निशान ऊतक अक्सर अल्ट्रासाउंड द्वारा देखे हैं, लेकिन जीने के ट्यूमर से भेदभाव नहीं कर सकता.
चित्रा 1 मूत्राशय ट्यूमर ट्यूमर विकास कैनेटीक्स. (ए) bioluminescence इमेजिंग मूत्राशय ट्यूमर के भीतर luciferase गतिविधि उपाय उनके स्थान और विकास की पुष्टि की. (बी) vivo मूत्राशय ultrasounघ एक 40MHz जांच का उपयोग ट्यूमर छवियों जिसका आयाम सही मापा जा सकता है. (सी) रेखांकन ट्यूमर bioluminescence और अल्ट्रासाउंड आयाम में प्रगतिशील वृद्धि illustrating है. मान मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं (+ / - मानक विचलन) 6 जानवरों से माप बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
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Discussion
हम माउस orthotopic xenograft मूत्राशय ट्यूमर LNP तैयार सरना कि transcriptional सक्रियण के लिए CIP1/WAF1 p21 (p21) के प्रमोटर लक्ष्य के साथ ट्यूमर के intravesical उपचार के बाद मॉडल की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान 2., 3 परिणामी ट्यूमर हो सकता है पुष्टि की और bioluminescent इमेजिंग और मूत्राशय अल्ट्रासाउंड के साथ नजर रखी. Orthotopic मॉडल मूत्र और urothelium है कि और अधिक बारीकी से करीब अंतर्जात मूत्राशय कैंसर के परिवेश उपलब्ध कराने के द्वारा intraperitoneal, चमड़े के नीचे, या नसों में मॉडल से बेहतर हो सकता है. Orthotopic माउस मूत्राशय ट्यूमर की एक किस्म दोनों सीधे मूत्राशय दीवार के रूप में अच्छी तरह से intravesical टपकाना इंजेक्शन का उपयोग कर स्थापित किया गया है 4-8 ट्यूमर की intravesical टपकाना., के रूप में यहाँ का प्रदर्शन, और अधिक बारीकी से मानव मूत्राशय ट्यूमर जो mucosal उपकला में अल्पज्ञता से शुरू करते हैं और गहरा हो जाना mimics के वे प्रगति के रूप में. चांदी नाइट्रेट का उपयोग करने के लिए blad समायोजित करने की हमारी विधिट्यूमर तेज ders सस्ती और तकनीकी रूप से सरल है.
Hadaschik एट अल चूहों में मूत्राशय ट्यूमर के intravesical टपकाना वर्णित और विश्वसनीय bioluminescent ट्यूमर मूल्यांकन. 5 हम इसी तरह कैथीटेराइजेशन और सेल टपकाना साथ सफल ट्यूमर आरोपण की उच्च दर की सूचना दी. हमारे ट्यूमर बल्कि मूत्राशय vivo अल्ट्रासाउंड में bioluminescence के साथ ही पुष्टि की गई है, बढ़ाता ट्यूमर प्रगति के लिए एक अतिरिक्त तरीका प्रदान करते हैं.
इस प्रोटोकॉल में, हम दूसरों की तकनीक को कई संशोधनों ध्यान दें. हम मूत्राशय कोशिकी ट्यूमर सेल आरोपण के लिए ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन विद्युतदहनकर्म की बजाय, परत को बाधित चांदी नाइट्रेट समाधान के टपकाना नियोजित. हम यह एक सस्ता, सरल है, और विश्वसनीय तरीका है कि उपयोगकर्ता त्रुटि के लिए संभावित कम से कम हो पाया. मूत्राशय की अल्ट्रासाउंड मूल्यांकन के दौरान, हम यह अनावश्यक मूत्रमार्ग कैथीटेराइजेशन प्रदर्शन करने के लिए मिलापहले से. जब तक पशु के रूप में महत्वपूर्ण संकट नहीं अधीन था संज्ञाहरण के दौर से गुजर से पहले पेशाब कारण के रूप में, माउस मूत्राशय मज़बूती इमेजिंग दौरान distended किया गया था करने के लिए उत्कृष्ट ट्यूमर दृश्य के लिए अनुमति देते हैं. एक शक के बिना, मूत्रमार्ग कैथीटेराइजेशन प्रोटोकॉल का कम से कम विश्वसनीय कदम था. हमारे अनुभव में, athymic नग्न चूहों के कैथीटेराइजेशन C57 चूहों की तुलना में और अधिक कठिन है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल और वीडियो में वर्णित तकनीक के साथ, पशुओं के 90% से अधिक बार बार दोनों ट्यूमर टपकाना और उपचार के लिए सफलतापूर्वक catheterized.
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Disclosures
LCL में सरना के लिए संबंधित पेटेंट आवेदन जो कैलिफोर्निया के सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय द्वारा दायर किया गया है और Alnylam फार्मास्यूटिकल्स के लिए लाइसेंस लंबित पर एक आविष्कारक का नाम है.
Acknowledgments
इस शोध के AACR हेनरी शेपर्ड मूत्राशय कैंसर अनुसंधान अनुदान (09-60-30-लाइट) द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
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