Summary
Etablering en orthotopic blære tumor modell for å vurdere antitumor effekter av intravesikalt levert Sarna og overvåking tumorvekst ved ultralyd og Bioluminescent bildebehandling.
Abstract
Vi presenterer en ny metode for behandling av blærekreft med intravesikalt levert liten aktiverende RNA (Sarna) i en orthotopic xenograft mus blære svulst modell. Musen modellen er etablert ved urethral kateterisering etter inhalert narkose. Kjemisk forbrenning blir så introdusert til blæren slimhinnene hjelp intravesikal sølvnitrat løsning å forstyrre blæren glycosaminoglycan laget og tillater celler å feste. Etter flere vask med sterilt vann, menneskelig blærekreft KU-7-luc2-GFP cellene er innpodet gjennom kateteret inn i blæren for å bo i 2 timer. Påfølgende vekst av blæretumorer bekreftes og overvåkes av in vivo blære ultralyd og Bioluminescent bildebehandling. Svulstene blir deretter behandlet intravesikalt med Sarna formulert i lipid nanopartikler (LNPs). Tumorvekst overvåkes med ultralyd og bioluminesens. Alle trinnene i denne fremgangsmåten er demonstrert i den medfølgende videoen.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av det institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco.
1. Celleforberedelsen
- Den menneskelige blærekreft celle linje KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) dyrkes i RPMI-1640 media supplert med 10% fosterets bovint serum og 50 mikrogram / ml gentamicin.
- Kulturer er opprettholdt ved 37 ° C, 5% CO 2 med media endres hver to til tre dager.
- Cellene ble høstet av trypsin fordøyelsen og telles ved hjelp av en hemocytometer. En enkelt celle suspensjon av 2 x 10 6 celler i 50 mL ble utarbeidet i fosfatbufret saltvann og holdt på is.
2. Orthotopic Blære Tumor Model
- Female Nude (NU / NU) mus 8-10 uker gamle (Simonsen Laboratory, Gilory, CA) ble brukt.
- Plasser et sterilt drapere over en varmepute til å tjene enSA kirurgisk plattform. Steril smørende gelé, 24-testutstyr katetre med Stylet nåler, sølvnitrat løsning, og sterilt vann er forberedt.
- Narkose er indusert i mus med inhalert isofluran (3% for induksjon, 1-2% for vedlikehold) og vedlikeholdes via nosecone. Steril ophthalmic sårsalve brukes til dyrets øyne, og en varme pad brukes til å opprettholde kroppsvarmen.
- Plasser musen i liggende stilling.
- Ta forsiktig tak i dyrets vulva med pinsett for stabilisering.
- Ved hjelp av en 24-testutstyr venekateter med nålen Stylet fjernet, er musen urinrøret catheterized. Rikelig smøring bør brukes. Med musen liggende, blir urinrøret ligger umiddelbart posterior til vulva folder og fremre til vagina. En 45-graders vinkel er i utgangspunktet tatt for å cannulate urinrøret og passerer under skambenet. En mer overfladisk vinkel er da tatt å passere gjennom urinrøret inn i blæren. Gentle bekkenet presHusk å rette ut urinrøret kan ofte hjelpe. Hensyn må tas for å unngå å skyve altfor hardt mot motstand, da dette kan føre til urethral eller blære perforasjon. Urin sett innenfor kateteret bekrefter sin posisjon innenfor blæren lumen.
- Sug urin fra kateteret og blæren lumen ved hjelp av Stylet nålen. Den Stylet nål brukes for alle påfølgende ambisjoner og injeksjoner, forlater kateteret på plass. Dette åpner for injeksjon av nøyaktige volumer ved å eliminere de døde-plass i kateteret, og det gjør gjentatte catheterizations unødvendig.
- Til å svekke glycosaminoglycan laget av blæren urothelium, er 10 mL av 0,5 M sølvnitrat injisert og lov til å bo i 10 sekunder. Dette kan danne et hvitt bunnfall med gjenværende urin.
- Aspirer og kast bunnfallet og blære innholdet med en Stylet nål.
- Vask blæren ved å injisere 100 mL sterilt vann. Aspirer og kast vannet. Repeved vask med sterilt vann 3 ganger for totalt 4 vask.
- Plasser en 4-0 silkeslips rundt urinrørsåpningen til occlude urinrøret i forberedelse til kateteret fjernes.
- Injiser tidligere utarbeidet 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP celler i 50 mL med Stylet nålen.
- Samtidig fjerner kateteret og Stylet nål, forlater urinrøret okkludert av silkeslips.
- Musen vil bli vedlikeholdt under narkose i 2 timer før silkeslips fjernes og dyret blir vekket.
3. Ultralyd
- Narkose er indusert med fordampede isofluran og vedlikeholdes via nesen kjegle.
- En VisualSonics Vevo 770 In Vivo High-Resolution Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) med RMV-704 40 MHz probe ble brukt.
- Plasser musen i ryggen på ultralyd plattformen.
- Sikre dyrets bakbenmed tape for å unngå overflødig bevegelse under manipulering av ultralydprobe.
- Påfør ultralyd gel til musen bekkenet.
- Senk en RMV-704 (40 MHz) ultralydprobe på musen bekkenet for å få tverrgående eller langsgående bilder.
- Dersom svulsten er funnet, kan bildene lagres for måling av tumor dimensjoner.
4. Bioluminescent Imaging
- Utfør intraperitoneal injeksjon av 200 mL (150 mg / kg) luciferin substrat.
- Fremkall narkose med fordampede isofluran og vedlikeholde via nesen kjegle.
- Plasser mus i liggende stilling innenfor bioluminesens kameraet.
- Fem minutter etter luciferin injeksjon, måle bioluminesens fra dyret i fotoner per sekund.
5. Sarna Forberedelse
- Syntetisere RNA oligonukleotider på en skala fra 50-100 mikromol.
- Anneal komplementære enkelt-strandet oligonukleotider into duplex saRNAs.
- Lipid-nanopartikkel (LNP)-Sarna er utarbeidet med ionizable lipid 1,2-dilinoleyl-4-(2 - dimethylaminoethyl) - [1,3]-dioxolane (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl kolin, kolesterol, og PEG-DMG hjelp av en spontan vesicle formasjon formulering prosedyre som tidligere beskrevet. 1
6. Intravesikal Administrasjon av Formulert Sarna
- Etter etablering av orthotopic blæren svulsten modell, er mus behandlet med intravesikal liten aktiverende RNA (Sarna) formulert i lipid nanopartikler (LNPs) (tabell 1).
- Narkose er etablert og vedlikeholdes med fordampede isofluran, og steril ophthalmic smøremiddel brukes.
- Plasser dyret i liggende stilling.
- Utfør urethral kateterisering som tidligere beskrevet.
- Plasser en 4-0 silkeslips rundt urinrøret og kateter.
- Aspirer all urin fra kateteret ogblæren ved hjelp av en tom sprøyte og Stylet nål.
- Injiser LNP-Sarna intravesikalt en total dose på 50 mL (3 mg / kg). Samtidig fjerner kateteret og Stylet nål, forlater urinrøret okkludert av silkeslips.
- Musen vil forbli bedøvet med urinrøret okkludert i 2 timer.
- Behandling med intravesikal LNP-Sarna ble påbegynt på dag 4 etter svulst implantasjon. Musene ble behandlet serielt, hver 3 dager, til sammen 14 behandlinger.
7. Representative Resultater
Blæretumorer stammer fra KU-7-luc2-GFP celler kan overvåkes av luciferase Bioluminescent imaging (Figur 1A og C) og blære ultralyd (figur 1B og D). Svulster er ofte påvises innen 3-5 dager etter celle inokulasjon. Vi fant vellykket blære svulst implantasjon i over 90% av mus. Som behandling med intravesikal dsRNA oppstår, kan utviklingen av svulsten følges with disse modaliteter. Etter at dyret er slaktet, kan tumorvekst også bekreftes ved hjelp av GFP fluorescens. Generelt mener bioluminesens korrelert med gjennomsnittlig ultralyd dimensjoner for blæretumorer, sett visuelt i figur 1C og 1D. Men etter dyr ble ofret og tumor ble bekreftet av GFP, fant vi at bioluminesens korrelert tettere med tilstedeværelse av levedyktige tumor enn gjorde ultralyd målinger. Dette var særlig tydelig blant mus behandlet med Sarna (i motsetning til kontroll) fordi gjenværende arrvev i behandlede mus var ofte visualisert med ultralyd, men kunne ikke skilles fra levende tumor.
Figur 1. Tumorvekst kinetikk blæretumorer. (A) bioluminesens bildebehandling måler luciferase aktivitet innen blæretumorer å bekrefte sin beliggenhet og vekst. (B) In vivo blære ultrasound bruker en 40MHz sonde produserer tumor bilder som dimensjoner kan måles nøyaktig. (C) Grafer illustrerer svulsten er progressiv økning i bioluminesens og ultralyd dimensjoner. Verdier representere bety (+ / - standardavvik) målinger fra 6 dyr. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer en protokoll for etablering av en mus orthotopic xenograft blære tumor modell etterfulgt av intravesikal behandling av svulster med LNP formulert Sarna som er rettet mot arrangøren av P21 CIP1/WAF1 (P21) for transcriptional aktivering. 2, 3 Den resulterende svulster kan være bekreftet og overvåkes med Bioluminescent bildebehandling og blære ultralyd. Orthotopic modeller kan være overlegen intraperitoneal, subkutane eller intravenøse modeller ved å gi et miljø av urin og urothelium som nærmere tilnærmet endogen blærekreft. En rekke orthotopic mus blæretumorer har blitt etablert ved hjelp av både direkte blæreveggen injeksjon, samt intravesikal instillering. 4-8 intravesikal instillasjon av svulsten, som demonstrert her, mer etterligner menneskelige blæretumorer som begynner overfladisk i slimhinnene epitel og vokse dypere som de går videre. Vår metode for å bruke sølvnitrat for å imøtekomme Bladders for svulst opptak er billig og teknisk enkel.
Hadaschik et al. Beskrevet intravesikal instillasjon av blæretumorer i mus og rapportert pålitelig Bioluminescent svulst vurdering. 5 Vi Tilsvarende fant høy forekomst av vellykket tumor implantasjon med kateterisering og celle instillasjon. Våre svulster ble ikke bare bekreftet med bioluminesens men også med in vivo blæren ultralyd, som gir en ekstra metode for å kvantifisere tumor progresjon.
I denne protokollen, ser vi flere endringer andres teknikk. Vi ansatt instillasjon av sølvnitrat løsning å forstyrre blæren ekstracellulære glycosaminoglycan lag for svulst celle implantasjon, istedenfor electrocautery. Vi fant dette å være en billig, enkel og pålitelig metode som minimert potensial for brukerfeil. Under ultralyd vurdering av blæren, fant vi det unødvendig å utføre urethral kateteriseringforhånd. Så lenge dyret ikke hadde blitt utsatt for betydelig ubehag kan forårsake vannlating før under anestesi, ble musa blæren pålitelig oppblåst under bildebehandling for å tillate utmerket svulst visualisering. Uten tvil, var urethral kateterisering den minst pålitelige trinn av protokollen. Vår erfaring er kateterisering av athymic nakenmus vanskeligere enn i C57 mus. Men med teknikken beskrevet i denne protokoll og video, ble over 90% av dyrene gjentatte ganger catheterized vellykket for både tumor instillering og behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
LCL er en navngitt oppfinner på patentsøknader relatert til Sarna som har blitt arkivert av University of California San Francisco og lisensiert til Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Denne forskningen er finansiert av AACR Henry Shepard blærekreft Research Grant (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Semple, S. C. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nature. 28, 172-176 (2010).
- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
- Chancellor, M. B. Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).
- Hadaschik, B. A. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU international. 100, 1377-1384 (2007).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), e2523 (2011).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder. Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535 (2011).
- Dinney, C. P. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).
